Introduction
Emopoiesi è un processo di sviluppo complesso in cui le cellule staminali ematopoietiche (CSE) germogliano fuori endotelio hemogenic presente in una varietà di siti emopoietiche embrionali, come l'aorta-gonadi-Mesonefro e la placenta 1,2. L'incapacità di coltura in vitro CSE impedisce approfondita analisi di questo processo così come l'applicazione clinica di questi studi. Per aggirare questa limitazione, studi precedenti hanno tentato di derivare cellule staminali emopoietiche de novo sia attraverso la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti (PSC) 3, o la plasticità indotta nelle cellule somatiche e la differenziazione diretto utilizzo di supporti riprogrammazione 4,5. Questi studi, tuttavia, non generano le cellule engraftable clinicamente sicuri o consentono lo studio di emopoiesi sviluppo definitivo "in un piatto."
Le cellule staminali pluripotenti Il lavoro romanzo stabilito da Yamanaka e colleghi di generare indotto (iPSCs) da fibroblasti somatica provides un quadro di fattore di trascrizione (TF) strategie basate iperespressione nella cella riprogrammazione destino 6,7. Questo lavoro ha spinto i ricercatori in diversi settori per generare tipi di cellule di scelta tramite TF riprogrammazione delle cellule somatiche facilmente ottenibili. L'obiettivo della strategia di riprogrammazione qui descritto è quello di indurre un processo hemogenic da cellule somatiche di topo usando un approccio riprogrammazione TF base con l'obiettivo di tradurre questi risultati per il sistema umano di riprogrammare fibroblasti paziente-specifici al fine di studiare ematopoiesi umana in vitro e generare prodotti sanguigni paziente-specifici per la modellazione della malattia, test anti-droga, e trapianto di cellule staminali.
Il primo passo per assicurare una corretta riprogrammazione in questo sistema il mouse è stato quello di sviluppare una linea giornalista che è servito come un read-out per l'espressione di CD34, un marker conosciuto in cellule progenitrici endoteliali e cellule staminali emopoietiche. Per fare questo, le linee di topo transgenico huCD34-AS e teto-H2BGFP sono stati usati per generate topo transgenico fibroblasti embrionali doppie (MEF), ora indicati 34 / H2BGFP, che fluorescenza verde dopo l'attivazione del promotore CD34 8. Questo ha permesso lo screening di una varietà di TF notoriamente richiesto in diversi punti durante specifica ematopoietico e sviluppo. Cominciando con 18 TF in PMX vettori retrovial (determinati attraverso la letteratura estrazione e profilatura di etichetta GFP trattenere HSC dalla descritto in precedenza 34 topi / H2BGFP), 34 / H2BGFP MEFs state trasdotte con tutti i fattori e coltivati su AFT024 HSC-portante cellule stromali. Dopo il riconoscimento di 34 / H2BGFP attivazione, TF sono stati successivamente rimossi dal cocktail riprogrammazione fino a quando è stato identificato il set ottimale di TF per l'attivazione giornalista. Dopo questa schermata iniziale, i fattori sono stati trasferiti in un sistema di inducibile vettore DOX pFUW per consentire l'espressione controllabile dei TF. Dal momento che questi due sistemi controllabili DOX sono incompatibili (le celle 34 / H2BGFP e vettori inducibili pFUW), MEF dasono stati necessari wild-type C57BL / 6 topi. E 'stato anche necessario fornire un microambiente appropriato per consentire hemogenesis di procedere e creare progenitori clonogeniche multilineage.
Gli studi attuali che tentano di riprogrammare le cellule somatiche in cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPCs) hanno incontrato vari livelli di successo 9-11. Ad oggi, la generazione di entrambi i mouse e HSPCs trapiantabili umani con a lungo termine e di auto-rinnovamento capacità ripopolamento non è stato raggiunto utilizzando lo stesso set di TF. In questo protocollo, forniamo una descrizione dettagliata della strategia precedentemente stabilito per indurre riproducibile hemogenesis in MEF. Abbiamo dimostrato che l'introduzione di un insieme minimo di TF (GATA2, Gfi1b, i CFO, e Etv6) è in grado di istigare un programma di sviluppo complesso in vitro che fornisce una piattaforma con la quale emopoiesi sviluppo e applicazione clinica di riprogrammazione ematopoietiche possono essere studiate ulteriormente 12.
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Protocol
dichiarazione etica: linee di cellule del mouse sono derivati seguendo le linee guida per la cura degli animali della Scuola Icahn di Medicina presso il Monte Sinai, e dovrebbe essere fatto in conformità con qualsiasi istituto ospitante.
1. embrionali di topo fibroblasti (MEF) Isolamento dei topi C57BL / 6
- Impostare l'accoppiamento temporizzato 13. Una volta che un tappo vaginale viene visualizzato, prendere in considerazione questa Giornata 0.5.
- Separare le femmine collegati alla data spina e verificare su di loro il giorno 10-11 per confermare la gravidanza.
- Il giorno di 13,5-14,5 eutanasia topi femmine gravide di via CO 2 inalazione seguita da dislocazione cervicale.
- Mettere a bagno in stato di gravidanza addome femminile con il 70% di etanolo, sezionare la cavità addominale con forbici sterili e pinze lungo la linea mediana, e rimuovere chirurgicamente le corna uterine che contengono gli embrioni 14. Estrarre gli embrioni delicatamente mentre tagliando il tessuto addominale rimanente.
NOTA: recuperare circa 8 embrioni con 4 su ogni lato. - Posizionare il uterina hORNS contenenti gli embrioni in un piatto di 10 centimetri con 5-10 ml di sterile refrigerata tampone fosfato salino (PBS).
- Con le forbici e pinze sterili, fare un'incisione lungo le corna uterine per isolare le sacche che trasportano gli embrioni. Trasferire le sacche ad un nuovo 10 centimetri piatto con 5-10 ml di sterili refrigerate PBS e disporli sul ghiaccio.
- Mettere alcune delle sacche in un nuovo 10 centimetri piatto con 5-10 ml di sterile raffreddato PBS. Utilizzando forbici sterili e pinze delicatamente tagliare aperto le sacche (senza tagliare troppo in profondità) al fine di evitare penetrante gli embrioni.
- Separare gli embrioni da placenta tagliando il cordone ombelicale.
- Trasferire gli embrioni per un nuovo 10 centimetri piatto contenente 5-10 ml di acqua refrigerata PBS e lasciare sul ghiaccio, mentre il completamento delle rimanenti dissezioni.
- Decapitare gli embrioni con pinza sterile. Tagliare con cautela lungo la linea mediana dell'embrione con le forbici e pinze sterili, a partire dalla zona decapitato per aprire l'addome. Posizione pinza sotto tegli organi viscerali (compreso il cuore, il fegato, i polmoni e) e raschiare 15.
- Tagliare il tessuto rimanente in piccoli pezzi con le forbici e pinze e trasferire in un tubo conico da 50 ml contenente 10 ml di tripsina.
- Pipettare su e giù con una pipetta 10 ml 20-30 volte per mescolare e dissociare il tessuto.
- Incubare il tessuto e mix tripsina in un bagno d'acqua a 37 ° C per 45 minuti, agitando di tanto in tanto.
- Pipettare su e giù con una pipetta 10 ml per circa 5 minuti per mescolare il contenuto.
- Aggiungere cellule trypsinized a 3X volume di Modified Eagle Medium standard di Dulbecco (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 10 mg / ml penicillina / streptomicina (P / S), e 1 mm L-glutammina (L-GLUT) in piatti 10 cm (~ 10 ml) e la cultura a 37 ° C fino confluenti (circa 2-4 giorni). Culture circa 1-2 embrioni per 10 cm piatto.
NOTA: le cellule Blocca una volta le piastre sono confluenti. cellule congelate possono essere scongelati e diversi passaggi altre 2 volte. Le celle possono essere alternativamentedividere 2 volte prima del congelamento, e quindi ancora una volta dopo essere stati scongelati.
2. La produzione virale
- Expand cellule 293T in 10 cm piastre con 10 ml DMEM con 10% FBS, 1% P / S, e 1% L-GLUT per la trasfezione.
- Trypsinize cellule 293T con 2 ml di tripsina, incubare a 37 ° C per 5 minuti, raccogliere le cellule in provette da 15 ml, spin a 300 xg, e la piastra in modo appropriato (10 ml per 10 centimetri piatto).
- 24 ore prima della trasfezione, dividere confluenti 10 cm piatto di cellule 293T 1: 6 e seme in 10 cm di gelatina rivestito (0,1% di gelatina in PBS) piatti.
NOTA: saranno tenuti 4 piastre per virus.- Per piastre cappotto in gelatina, aggiungere almeno 2 ml della soluzione di gelatina 0,1% per rivestire il fondo 10 piatti cm. Incubare a 37 ° C per almeno 20 min. Aspirare fuori la gelatina prima di aggiungere le cellule alle piastre.
- In un tubo da 15 ml, aggiungere 84 mcg plasmide (ad esempio GATA2, Gfi1b, i CFO, o Etv6 (sub-clonato nel vect pFUW-tetoo 16) o FUW-M2rtTA 17), 84 mg psPAX2, e 42 mg pMD2.G. Aggiungere acqua (H 2 O) per compensare il volume di 2 ml. Preparare un tubo per ogni fattore (ad es. GATA2, Gfi1b, i CFO, e Etv6 FUW-M2rtTA).
- Aggiungere 250 ml di 2M CaCl 2 a ciascuna provetta contenente la miscela 2 ml composta da 84 mg del gene prescelto (GATA2, Gfi1b, CFO, Etv6 o FUW-M2rtTA) + 84 mcg psPAX2 + 42 mcg pMD2.G + H 2 O .
- Usando una pipetta Pasteur inserito nel pipetta soccorso, rilascio di bolle in 2,25 ml DNA + H 2 O + 2 M CaCl 2 miscela. Poiché le bolle vengono prodotti, posizionare la punta di un P1000 contro la pipetta di vetro e lentamente espellere 2 ml di 100 mM N, N-bis (2-idrossietil) -2-amminoetano solfonico (BES) salina per pipetta Pasteur 1 ml alla volta.
- Incubare tutte le provette nella cappa coltura a temperatura ambiente per almeno 15 min.
NOTA: il 4,25 ml di miscela (ora DNA + H 2 O + 2M CaCl 2 - Come la miscela incuba, media aspirare al largo piastre 293T e aggiungere 10 ml DMEM + 10% FBS + 1 mM L-glutammina + 25 Nm clorochina.
NOTA: Questo supporto non contiene P / S. - Dopo almeno 15 min di incubazione (o fino a cambio di un supporto su cellule 293T), aggiungere il 4,25 ml DNA + H 2 O + 2 M CaCl 2 + BES miscela salina goccia a goccia per le cellule 293T, distribuendo in modo uniforme 4 piastre di cellule per provetta (cioè poco più di 1 ml di miscela per piastra).
- Incubare le piastre durante la notte (O / N) a 37 ° C.
- 24 dopo incubazione ore, sostituire media su tutte le piastre con 4 ml di DMEM standard (vedere il punto 1.15).
- Mantenere le cellule in un incubatore a 32 ° da ora in poi.
- 24 ore dopo il punto 2.10, raccogliere supporti in distinte provette da 50 ml. Sostituire i mezzi raccolti da ogni piatto con 4 ml di standard di DMEM.
NOTA: 4 piastre per i primi risultati della miscela tubo in 16 ml di media raccolti.- UNopo 12 ore di incubazione, raccogliere i media ancora una volta nelle stesse provette da 50 ml e sostituirlo con un altro 4 ml di standard di DMEM.
- Dopo 12 ore di incubazione, raccogliere i mezzi di comunicazione e di aggiungere le stesse provette da 50 ml.
NOTA: ogni tubo dovrebbe contenere circa 48 ml di supporti contenenti virus.
- Per concentrare il virus raccolti, primo filtro dei media raccolti tramite 0,45 micron a basso contenuto proteico filtri vincolanti.
- Versare i media filtrati contenenti virus in provette da centrifuga concentrazione virale (circa 16 ml per volta).
- Spin a 4.000 xg a 4 ° C per 25 minuti e rimuovere flow-through.
NOTA: un piccolo volume di mezzi concentrati e virus sarà visibile nel filtro. - Aggiungere altri 16 ml di media virus contenenti filtrato per il volume del supporto + virus concentrati rimanente nel filtro e mescolare capovolgendo la provetta.
- tubo Spin nuovamente a 4.000 xg a 4 ° C per 25 min e scarti flow-through.
- Aggiungere rimanendo filtratoraccolta ai media + volume di virus concentrati lasciato nel filtro e mescolare invertendo la provetta.
- Spin nuovamente a 4.000 xg a 4 ° C per 10-20 minuti (a seconda del volume nel filtro) e assicurarsi che il volume residuo di supporti concentrato + virus lasciato nel filtro è di circa 1 ml. Se è maggiore di 1 ml di concentrato supporti + virus rimane nel filtro, far girare nuovamente a 4.000 xg per 1 min e ripetere fino 1 ml viene lasciato nel filtro.
- Aliquotare 200 ml di virus concentrati in provette da 1,5 ml e congelare a -80 ° C o utilizzare immediatamente.
3. Riprogrammazione MEF
- Pre-coat 6 e piastre con 0,5 ml di 0,1% di gelatina in PBS per pozzetto, assicurando che la gelatina copre l'intera area del pozzo. Mettere in un incubatore a 37 ° C e incubare per almeno 20 min. Dopo l'incubazione, rimuovere le piastre e aspirare la gelatina.
- MEF piastra con DMEM standard ad una densità di 25.000 cellule per pozzetto (150.000 celluleper 6-pozzetti) sul 6 pozzetti gelatinizzato (s) dal punto 3.1 e si lascia stratificare O / N in un incubatore a 37 °.
- Preparare un cocktail di virus 100 ml mescolando 50 ml M2rtTA e il restante 50 ml un mix di GATA2, Gfi1b, i CFO, e Etv6 (12,5 ml ciascuno).
- supporti Aspirare dal MEF e aggiungere 2 ml di DMEM serie con 8 mg / ml di bromuro hexadimethrine.
- Trasdurre ciascun pozzetto delle piastre MEF con 15 ml di cocktail di virus e incubare O / N a 37 ° C.
NOTA: Questo è il giorno 0 del processo di riprogrammazione. - Il giorno 1, dopo 16-20 ore di incubazione, sostituire il supporto con 2 ml di DMEM fresco di serie integrato con 1 mg / ml DOX per pozzetto.
- Preparare terreni di coltura ematopoietiche integrato con idrocortisone (10 -6 M), 100 ng / ml fattore delle cellule staminali (SCF), 100 ng / ml FMS relativi tirosin-chinasi 3 ligando (Flt3L), 20 ng / ml di interleuchina-3 (IL- 3), 20 ng / ml di interleuchina-6 (IL-6), e 1 mg / ml DOX.
- Il giorno 4 aspirate dei media da ciascun pozzetto e lavare le cellule con 1 ml di PBS per pozzetto.
- Aspirare PBS, dissociare le cellule usando 1 ml di 0,05% tripsina per bene e raccogliere le cellule.
- Contare le cellule con un emocitometro, far girare a 300 xg per 5 minuti, risospendere in 12 ml di mezzi ematopoietiche descritti al punto 3.7 e piastra 60.000 cellule per 6 pozzetti su 0.1% piastre rivestite di gelatina (2 ml per pozzetto, 10.000 cellule per pozzetto ).
- Sostituire media con terreni di coltura ematopoietiche INTEGRAZIONI fresco ogni 6 giorni per tutta la durata della cultura (35 a 36 giorni).
- Analizzare sia cellule intermedie o cellule ematopoietiche come emergenti tramite immuno-colorazione 12, l'analisi FACS 8,12, qRT-PCR 12, e mRNA sequenziamento 12 per confermare l'acquisizione di endoteliale hemogenic o marcatori HSC-like e l'espressione genica.
4. placentare di aggregazione e Colony Forming unità (CFU) saggi in metilcellulosa
- Sezionare placente da C5 incinta7BL / 6 topi come precedentemente descritto 18 a E12.5 e mantenere il tessuto sul ghiaccio.
- Per avviare la placenta dissociazione 19, lavo tessuto placentare in 2-5 ml di 0,2% di tipo collagenasi io in PBS con il 20% FBS e dissocio meccanicamente con un ago da 18G montato in una siringa da 5 ml da passaging la placenta e PBS attraverso l'ago almeno 3 volte.
- Dopo la dissociazione meccanica, mantenere le cellule placentari in 2-5 ml di soluzione di collagenasi a 37 ° C per 1,5 ore.
- cellule passaggio attraverso 20-25 aghi G montati su 5 ml siringhe più volte per ulteriori dissociarsi meccanicamente le cellule placentari.
- Filtro sospensioni singola cella attraverso 70 micron filtri cellulari.
- Contare le cellule con un emocitometro e irradiare a 2.000 cGy per l'inattivazione mitotico 20.
- Aggiungere 10 ml di terreni di coltura ematopoietiche integrato con 100 ng / ml SCF, 100 ng / ml Flt3L, 20 ng / ml di IL-3, 20 ng / ml di IL-6, e 10 ng / trombopoietina ml (TPO) per 10 cm piatto.
NOTA: DOX non è necessario in questa fase. - Collocare un filtro 0,65 micron direttamente su terreni di coltura ematopoietiche nel piatto, che galleggi per creare una interfaccia liquido-gas e impostare il piatto da parte.
- Dissociarsi giorno 25 MEF trasdotte (derivati dal passaggio 3,11), come descritto nei punti 3.8-3.10 e mescolare 33.000 dei MEF trasdotte con 167.000 cellule degli aggregati placentari dal punto 4.6 (rapporto 1: 6).
- Per generare un aggregato 18,21, prima rotazione lungo il MEF e mix cellula placentare dal passaggio 4,9 per 5 min a 300 x g. Aspirare i media e risospendere le cellule pellet in 30-50 ml di standard di DMEM con una pipetta P200, disegnando la sospensione singola cella in 200 ml nonbevelled punta della pipetta.
- Occludere la punta della pipetta con la pellicola di paraffina. Posizionare la punta bloccato in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare per 5 min a 300 xg per cui si forma una pallina alla fine coperta di punta.
- Rimuovere la punta dal tubo da 15 ml con attenzione e postola punta sull'estremità della pipetta P200. Eliminare la pellicola di paraffina e estrudere il pellet cellulare sul filtro galleggiante dal punto 4.8.
NOTA: Piastra al massimo 3 aggregati per filtro. - Cultura aggregati sui galleggianti 0,65 micron filtri per 4-5 giorni a 37 ° C con 5% di CO 2.
- Raccogliere gli aggregati (al massimo 3 per filtro) con un raschietto cellulare, combinarli, e digerire con lo 0,2% collagenasi, seguendo lo stesso protocollo fatto con l'intero placenta dissociare le cellule (passi 4,2-4,5).
- Dopo la dissociazione, lavare gli aggregati con 2-5 ml di PBS integrato con il 5% FBS e centrifugare le cellule a 300 xg per 5 min.
- Risospendere gli aggregati in 500 ml di DMEM senza FBS, P / S, o L-GLUT. Prendete questo 500 risospensione microlitri e aggiungerla al 3 ml 1% Mezzi di metilcellulosa supplementato con 10 ng / ml di TPO, evitando accuratamente la formazione di bolle. Piastra volumi uguali di questa miscela in 3 35 x 10 mm non trattato piatti della cultura perCFU Saggi 12.
- Come controllo, la cultura irradiato aggregati placentari senza mescolando in MEF riprogrammate 4-5 giorni e posto in saggi di CFU come sopra descritto ai punti 4.7-4.16.
NOTA: Questi aggregati da solo non formano colonie. - Contare le colonie ematopoietiche manualmente al microscopio dopo 10-14 giorni di coltura a 37 ° C con 5% di CO 2.
- Cytospin 22 raccolse colonie per mostrare fenotipo morfologica delle singole cellule.
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Representative Results
Emopoiesi è un processo di sviluppo complesso che inizia in vari siti embrionali. Cellule endoteliali Hemogenic risiedono in questi siti e danno luogo a CSE tramite gemmazione delle cellule 23. Questo processo attualmente non può essere riprodotto mettendo CSE o precursori emopoietici nella cultura, che richiede una metodologia per ottenere in qualche modo queste cellule in vitro, sia per HSPC espansione ex vivo o la generazione de novo. Questo protocollo dimostra il nostro nuova tecnologia che tenta di ottenere queste cellule tramite la sovraespressione TF in MEF.
La figura 1 illustra il processo globale riprogrammazione. Dopo la generazione MEF e l'espansione, le cellule vengono trasdotte con GATA2, Gfi1b, i CFO, e Etv6 FUW-M2rtTA. Dopo 3 giorni di espansione e l'esposizione a DOX Per avviare l'attivazione transgene, le cellule sono dissociate e dividere il giorno 4 su piastre rivestite di gelatina ecresciuto nei media ematopoietiche integrato.
A seguito di una prolungata cultura post trasduzione con i media di riprogrammazione, le cellule adottano evidenti cambiamenti morfologici. Al giorno 20 cellule endoteliali adottano morfologia distinta dal MEF. Inoltre la cultura per giorno 35 dà luogo a varie cellule ematopoietiche, come rotonde che emergono dalle intermedi endoteliali-like che sono GFP + (quando si utilizza il 34 / H2BGFP MEF) e macchia positivo per i marcatori ematopoietici Sca1 e CD45 (Figura 2). Questa colorazione dimostra che queste cellule ottenere marcatori fenotipici suggestivi di induzione hemogenic. Inoltre la cultura si traduce in cellule che esprimono CD45, pur mantenendo l'espressione del reporter huCD34. Su cellule di coltura placentare aggregazione adottano potenziale clonogenica e generano colonie in metilcellulosa contenenti varie morfologie ematopoietiche e blasti-simile (Figura 3).
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Figura 1: Strategia per l'induzione hemogenic in MEF. Diagramma che illustra il processo di riprogrammazione e ogni passaggio all'interno di esso. Il processo di riprogrammazione generale prima coinvolge espansione MEF, seguita dalla divisione alla densità appropriata in 6 pozzetti gelatina rivestita. Le cellule sono poi trasdotte con il cocktail di GATA2, Gfi1b, i CFO, Etv6, e FUW-M2rtTA. Le cellule sono ulteriormente in coltura con DMEM integrato con standard di DOX. Al Day 4 celle sono tripsinizzate e suddivisi in 6 pozzetti. Ogni 6 giorni dei media è cambiato e in momenti scelti cellule possono essere analizzati da FACS, CFU, o saggi di espressione genica. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 2: L'induzione di cellule ematopoietiche che emergono da precursori. Cellule positive per 34 / H2BGFP macchiato per Sca1 e CD45 dimostrano l'induzione di un programma hemogenic. (A) Questa immagine mostra una fusione di cellule colorate per CD45 e Sca1 mentre fluorescente GFP un'immagine brightfield sottostante delle cellule riprogrammate con. Solo un sottoinsieme della popolazione di cellule piatta esprime Sca1, un endoteliale / marcatore hemogenic, e arrotondato solo le cellule ematopoietiche, come emergono da queste cellule macchia rossa per CD45, un marker pan-ematopoietiche. (B) Questa immagine mostra le cellule colorate e fluorescenti GFP senza l'immagine chiaro, mostrando chiaramente stretta associazione di cellule CD45 + con il Sca1 + cellule. Barra di scala = 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Generazione di cellule CD45 + ematopoietiche. (A) Circa il 12,7% dei 34 / H2BGFP MEFs trasdotte con GATA2, Gfi1b, i CFO, e Etv6 sono GFP + CD45 + dopo 35 giorni di riprogrammazione. Morfologie mieloidi chiare e blasti-simile può essere visto dopo colorazione H & E (B) dopo cytospin di CD45 + cellule ordinati placcato in metilcellulosa per 10-14 giorni. Questo dimostra il potenziale multilineare clonale delle cellule riprogrammate che adottano la funzione ematopoietiche dopo trasduzione con la minima serie di TF. Barra di scala = 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Generazione HSPCs de novo da cellule somatiche facilmente raggiungibili offre un metodo unico per studiare ematopoiesi in vitro, e la possibilità di potenzialmente applicare questa tecnologia al sistema umano. Questa traduzione genererebbe un nuovo strumento per studiare la malattia ematologica umana in un piatto, oltre a fornire le piattaforme di prova della droga e gene targeting opportunità per il trattamento di numerose malattie con terapie nuove o trapianti di CSE. Nel campo, recenti studi hanno ampliato la capacità di generare HSPCs de novo, dimostrando l'importanza di diverse caratteristiche del processo di riprogrammazione. Questi includono la scelta delle popolazioni cellulari partenza e cocktail TF, e come condizioni di coltura (co-coltura di nicchia) e integrazione (citochine, piccole molecole, etc.) influenzare significativamente l'efficienza della riprogrammazione 24-26. Diversi studi stanno applicando la tecnologia di riprogrammazione per il sistema umano senza passare perintermedio, 27,28 una fase indesiderabile pluripotenti in questi processi.
Qui è un protocollo che è stato il primo a generare cellule HSC-simili da cellule somatiche tramite un processo di sviluppo, evitando l'uso di fattori pluripotenza e la formazione di intermedi pluripotenti. Le cellule HSC-like generati sembrano sviluppare attraverso un processo di sviluppo, prima che richiedono cellule di viaggiare attraverso un hemogenic endoteliale intermedio simile a un EHT. Al giorno 20 di riprogrammazione forma intermedi endoteliali-like che contiene profili di espressione genica endoteliali e ematopoietiche. cellule HSC-come emergono da queste cellule intermedie a giorno 35 che contengono superficie delle cellule immuno-fenotipi e profili di espressione genica altamente simili a CSE e può produrre eritroide e mieloidi colonie in saggi CFU. Questo suggerisce che, a differenza di molti altri studi, questo protocollo riprogrammazione riassume un complesso processo di sviluppo in vitro, e può permulteriormente studio dei processi Emopoiesi e malattie ematologiche che coinvolgono emopoiesi embrionale. Questi studi consentono ulteriori ricerche sul modo di trattare e curare la moltitudine di disordini ematologici che esistono, e come manipolare emopoiesi a tal fine. Questo può essere fatto inducendo un programma hemogenic in fibroblasti specifici del paziente per stabilire in modelli di malattia vitro. Con questi modelli, ematopoiesi normale e malata può essere finemente sezionato e studiato, nonché sottoposto a droga schermi e editing gene per trattare / correggere difetti ematopoietiche associati con la malattia di interesse.
Usando fibroblasti di topo supporta diverse proprietà benefiche di questo processo di riprogrammazione. I fibroblasti stessi sono facili da ottenere da topi donatori, rendendo l'acquisizione delle cellule semplice. Traducendo questa tecnologia per l'uomo sarebbe quindi richiederebbe solo campioni di pelle dei pazienti, rendendo l'acquisizione di prodotti del sangue paziente-specifici e successiva TE cellularepungere una valida opzione per il trattamento della malattia ematologica. Inoltre, fibroblasti sono molto epigeneticamente distinte dalle cellule ematopoietiche, dimostrando la capacità dei TF scelti in questo protocollo riprogrammazione sia identità fibroblasti epigeneticamente repress, ed inoltre produrre un programma hemogenic alterando la memoria epigenetica delle cellule di partenza 29,30. Anche se gli studi di trapianto non dimostrano ancora piena funzione attecchimento multilineare di queste cellule derivate, vedere se questi fattori inducono un programma hemogenic che genera cellule ematopoietiche completamente funzionale nel sistema umano sarà di grande interesse.
Diversi passaggi all'interno di questo protocollo possono essere modificati in caso di difficoltà durante la riprogrammazione, come il numero di cellule piastrate prima trasduzione e la quantità di virus usato per la trasduzione. I risultati ottimali sono stati visti con 150.000 cellule per 6 pozzetti (punto 3.2) con il volume precedentemente descritto di virus (fasi 3.3 e 3.5), ma più cellule possono essere usati in caso di morte cellulare per esposizione al virus. Analogamente, piccoli volumi di virus possono essere usati devono morte cellulare sia un problema, purché procede riprogrammazione come descritto (che può essere verificata mediante analisi FACS, saggi CFU, e genica). Garantire che i passaggi 2,13-2,19 resa corretta quantità di virus è necessario per il successo di tutto il resto del protocollo. Passi 3,5-3,7 sono anche critici, come successo trasduzione di cellule è cruciale per indurre questo programma hemogenic. La quantità appropriata di DOX per pozzetto di cellule trasdotte deve essere mantenuto costante e fresca per garantire espressione dei transgeni (conseguente necessità di frequenti cambi di media). Anche se non è assolutamente necessario, coltura cellulare nel buio quando si utilizza DOX può aiutare a prevenire la perdita della funzione DOX. Dopo trasduzione, le cellule devono essere monitorati attentamente al microscopio per morfologia e dosati con vari metodi analitici (come FACS e saggi di CFU) per garantire la strasduzione virale Uccessful e riprogrammazione. cellule riprogrammate non possono adottare il maggior numero di cambiamenti morfologici come previsto, che richiede metodi analitici precedentemente menzionati per servire come i migliori indicatori di una corretta riprogrammazione.
Studi recenti hanno utilizzato diverse caratteristiche di questo protocollo riprogrammazione, come GATA2 nel cocktail TF o fibroblasti come la popolazione di cellule di partenza 31-33. Queste metodologie appaiono anche per indurre programmi di sviluppo durante il processo di riprogrammazione. Altre strategie hanno dimostrato l'importanza della nicchia ematopoietica durante riprogrammazione 9,10,25,26. Identificare tutti i fattori che aiutano a riprogrammazione sarà essenziale per sviluppare il protocollo che genera cellule staminali emopoietiche in buona fede tra le cellule facilmente raggiungibili paziente-specifici. In sintesi, qui descriviamo una strategia per generare cellule HSC-come provenienti da un processo di sviluppo indotto in fibroblasti di topo via inducibile GATA2, Gfi1b, i CFO, esovraespressione Etv6. Questa tecnologia sarà tradotto al sistema umano, dove, in combinazione con altri studi pubblicati, consentirà generazione di prodotti sanguigni paziente-specifici adatti per una varietà di applicazioni cliniche.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| 0.45 μM filters | Corning | 430625 | |
| Amicon Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| FBS | Gemini's Benchmark | 100-106 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| 18 G needles | BD | 305195 | |
| 20 G needles | BD | 305175 | |
| 25 G needles | BD | 305125 | |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130-100MG | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605-010 | |
| Myelocult media | Stem Cell Technologies | M5300 | |
| SCF | R & D Systems | 455-MC | |
| Flt3L | R & D Systems | 427-FL | |
| IL-3 | R & D Systems | 403-ML | |
| IL-6 | R & D Systems | 406-ML | |
| TPO | R & D Systems | 488-TO | |
| Doxycycline | Sigma | D9891-1G | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | AL-118 | |
| Durapore 0.65 μM membrane filters | Millipore | DVPP14250 | |
| Methylcellulose media | Stem Cell Technologies | Methocult M3434 | |
| Hydrocortisone | Stem Cell Technologies | 07904 | |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Gelatin | Sigma | G-1890 100g | |
| pFUW-tetO | Addgene | Plasmid #20321 | |
| Gata2 | Origene | MR226728 | |
| Gfi1b | Origene | MR204861 | |
| cFos | Addgene | Plasmid #19259 | |
| Etv6 | Origene | MR207053 | |
| psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | |
| pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670-100g | |
| FUW-M2rtTA | Addgene | Plasmid #20342 | |
| 35 mm x 10 mm culture dishes | Thermo Scientific | 171099 |
References
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