Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Перепрограммирование эмбриональных фибробластов мыши с транскрипционных факторов для индуцирования кроветворения программы

Published: December 16, 2016 doi: 10.3791/54372
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2,3, 1,3,5, 1,3
1Department of Developmental and Regenerative Biology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2The Graduate School of Biomedical Science, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 5Department of Pharmacology and Systems Therapeutics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Introduction

Гемопоэз представляет собой сложный процесс развития , при котором гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) бутона от гемогенного эндотелий присутствовать в различных эмбриональных сайтах гемопоэтических такие как аорта-гонад-мезонефрос и плацента 1,2. Неспособность культуры ГСК в пробирке предотвращает глубокий анализ этого процесса, а также клиническое применение этих исследований. Чтобы обойти это ограничение, предыдущие исследования попытались вывести ГСК заново либо с помощью дифференциации плюрипотентных стволовых клеток (ЭСК) 3, или индуцированной пластичности в соматических клетках и направленной дифференцировки с помощью перепрограммирования СМИ 4,5. Эти исследования, однако, не приводят к клинически безопасных engraftable клеток или позволяют изучение окончательного кроветворения развития "в чашке".

Роман работа устанавливается Яманака и его коллеги, чтобы генерировать индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) из соматической фибробласты рrovides рамки для фактора транскрипции (TF) стратегий избыточной экспрессии на основе клеток в судьбе перепрограммирования 6,7. Эта работа побудила исследователей в различных областях, чтобы генерировать типы клеток выбора через TF перепрограммирования легкодоступных соматических клеток. Цель стратегии перепрограммирования , описанного здесь , чтобы вызвать гемогенного процесс от мыши соматических клеток с использованием TF на основе перепрограммирования подхода с целью воплощения этих результатов в человеческой системе перепрограммировать фибробласты конкретного пациента для того , чтобы изучить человека кроветворение в пробирке и генерировать пациента конкретных продуктов крови для моделирования заболевания, тестирования на наркотики и трансплантации стволовых клеток.

Первым шагом для обеспечения надлежащего перепрограммирование в этой системе мыши было разработать линию репортер, который служил в качестве чтения-аута для экспрессии CD34, известным маркером в эндотелиальных клетках-предшественниках и ГСК. Для этого, трансгенные линии мыши huCD34-TTA и Teto-H2BGFP были использованы для гenerate двойной трансгенной мыши эмбриональные фибробласты (МЭФ), теперь обозначается 34 / H2BGFP, что флуоресцировать зеленым при активации промотора CD34 8. Это позволило скрининг различных ТФ, как известно, требуется в различных точках во время кроветворной спецификации и развития. Начиная с 18-ТФ в PMX retrovial векторов (определяется путем добычи и профилирования GFP этикетки удерживающих ГСК из ранее литературы описаны 34 мышей / H2BGFP), 34 / H2BGFP MEFs были трансдуцированных со всеми факторами и культивируют на AFT024 HSC поддерживающих стромальных клеток. После обнаружения 34 активации / H2BGFP, ТФ были впоследствии удалены из перепрограммирования коктейля, пока не был идентифицирован оптимальный набор ТФ для активации репортера. После этого начального экрана, факторы, были переведены в DOX индуцибельной векторной системы pFUW, чтобы позволить управляемое экспрессию ТФ. Так как эти две управляемые системы DOX несовместимы (34 / H2BGFP клетки и индуцируемые векторы pFUW), MEFs изтребовалось 6 мышей дикого типа C57BL /. Кроме того, необходимо обеспечить соответствующую микросреду, чтобы позволить гемопоэз, чтобы продолжить и создать мультилинейной клоногенные клетки-предшественники.

Современные исследования пытаются перепрограммировать соматические клетки в гемопоэтических стволовых клеток и клеток - предшественников (HSPCs) встречались различные уровни успеха 9-11. На сегодняшний день, поколение как мыши и перевиваемых HSPCs человека с длительным сроком и самообновлению заселив способность не была достигнута с использованием того же набора ТФ. В этом протоколе, мы приводим подробное описание ранее установленной стратегии воспроизводимо индуцируют гемопоэз в MEFs. Показано , что введение минимального набора ТФ (Gata2, Gfi1b, CFO , и Etv6) способен подстрекательстве комплексную программу развития в пробирке , которая обеспечивает платформу , с помощью которого кроветворения развития и клиническое применение гемопоэтических перепрограммирования может быть дополнительно изучена 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Заявление по этике: клеточные линии мышей получены следуя инструкциям по уходу за животными в Икан школы медицины на горе Синай, и должно быть сделано в соответствии с любым принимающим учреждением.

1. мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) Выделение мышей C57BL / 6

  1. Настройка приурочен спаривание 13. После того, как вагинальная пробка визуализируется, рассмотреть этот день 0,5.
  2. Отделить засоряющихся самок на дату подключи и проверить их на День 10-11, чтобы подтвердить беременность.
  3. В день 13.5-14.5 эвтаназии беременных самок мышей с помощью CO 2 ингаляции с последующим смещением шейных позвонков.
  4. Замочите беременных женщин живота с 70% этанола, рассекают в брюшную полость с стерильными ножницами и щипцами вниз по средней линии, и хирургическим путем удалить маточные рога , содержащие эмбрионов 14. Выньте эмбрионы осторожно, пока отрезав оставшиеся брюшной ткани.
    Примечание: Восстановление около 8 эмбрионов с 4 на каждой стороне.
  5. Поместите матки часorns, содержащие эмбрионы в 10 см чашку с 5-10 мл стерильной охлажденным фосфатным буферным раствором (PBS).
  6. Стерильными ножницами и щипцами, делают надрез вдоль рогов матки, чтобы изолировать мешочки, несущие эмбрионов. Передача мешочки на новую 10 см чашку с 5-10 мл стерильной охлажденной PBS и место на льду.
  7. Поместите несколько из мешочков в новую 10 см чашку с 5-10 мл стерильной охлажденной PBS. Используя стерильные ножницы и пинцет аккуратно разрезать мешочки (без резки слишком глубоко), чтобы избежать прокалывания эмбрионов.
  8. Отдельные эмбрионы из плаценты путем перерезания пуповины.
  9. Перенос эмбрионов на новую 10 см чашку, содержащую 5-10 мл охлажденного PBS и оставить на льду во время завершения оставшихся вскрытий.
  10. Обезглавьте эмбрионов с использованием стерильного пинцета. Тщательно вырубить средней линии эмбриона, используя стерильные ножницы и пинцет, начиная с обезглавленной области, чтобы открыть живот. Позиция щипцов под тон висцеральные органы (включая сердце, печень, и легкие) и скрести их 15.
  11. Обрежьте оставшиеся ткани на мелкие кусочки с помощью ножниц и щипцов и передачи в 50 мл коническую пробирку, содержащую 10 мл трипсина.
  12. Пипеткой вверх и вниз с 10 мл пипеткой 20-30 раз перемешать и диссоциируют ткани.
  13. Выдержите ткани и трипсин смесь в ванну воды С 37 ° С в течение 45 мин, закрученной время от времени.
  14. Пипеткой вверх и вниз с 10 мл пипеткой в ​​течение приблизительно 5 минут, чтобы перемешать содержимое.
  15. Добавить трипсином клетки в 3 раза объем стандартной Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 10 мкг / мл пенициллина / стрептомицина (P / S), и 1 мМ L-глутамина (L-GLUT) в 10 см чашках (~ 10 мл) и культуры при 37 ° С до сливающихся (около 2-4 дней). Культура около 1-2 эмбрионов на 10 см чашку.
    Примечание: Замораживание клетки один раз пластин вырожденная. Замороженные клетки могут быть разморожены и пассировать еще 2 раза. Клетки могут быть альтернативноразделить 2 раза до замораживания, а затем еще раз после того, как оттаивают.

2. Вирусный Производство

  1. Expand 293Т в 10 см пластинах с 10 мл DMEM с 10% FBS, 1% P / S, и 1% L-GLUT для трансфекции.
    1. Trypsinize 293T клетки с 2 мл трипсина, инкубировать при 37 ° С в течение 5 мин, собирают клетки в 15 мл пробирки, спиновые при 300 мкг, и пластины соответствующим образом (10 мл на 10 см чашку).
  2. 24 ч до трансфекции, разделить сливающийся 10 см Столешница из клеток 293Т, 1: 6 и семян в 10 см покрытые желатином (0,1% желатина в PBS) пластин.
    Примечание: 4 пластины на вирус будет требоваться.
    1. Для покрытия пластин в желатин, добавить по меньшей мере, 2 мл 0,1% раствора желатина, чтобы покрыть дно 10 см пластинах. Инкубируют при 37 ° С в течение по меньшей мере 20 мин. Аспирируйте от желатина перед добавлением клеток к пластинам.
  3. В 15 мл пробирку, добавляют 84 мкг плазмиды (например, Gata2, Gfi1b, финансовые директора, или Etv6 (субклонировали в Vect pFUW-Tetoили 16) или FUW-M2rtTA 17), 84 мкг psPAX2, и 42 мкг pMD2.G. Добавляют воду (H 2 O) , чтобы компенсировать объем до 2 мл. Подготовьте трубку для каждого фактора (например. Gata2, Gfi1b, финансовые директора, Etv6 и FUW-M2rtTA).
  4. Добавить 250 мкл 2 М CaCl 2 в каждую пробирку , содержащую смесь в 2 мл , состоящую из 84 мкг выбранного гена (Gata2, Gfi1b, финансовые директора, Etv6 или FUW-M2rtTA) + 84 мкг psPAX2 + 42 мкг pMD2.G + Н 2 O ,
  5. С помощью пипетки Пастера , вставленный в пипетки помощи, выпуск пузырьков в 2,25 мл ДНК + H 2 O + 2 смеси М CaCl 2. Как производятся пузырьки, поместите кончик P1000 против стеклянной пипеткой и медленно выталкивать 2 мл 100 мМ N, N-бис (2-гидроксиэтил) -2-аминоэтан сульфокислоты (BES) физиологического раствора вниз Пастера пипеткой 1 мл за один раз.
  6. Инкубируйте все пробирки в культуре шкафу при комнатной температуре в течение не менее 15 мин.
    Примечание: Смесь 4,25 мл ( в настоящее время ДНК + Н 2 О + 2M CaCl 2
  7. По мере того как смесь высиживает, аспирация СМИ выключения 293T пластин и добавьте 10 мл DMEM + 10% FBS + 1 мМ L-глутамина + 25 нм хлорохин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данный носитель не содержит P / S.
  8. После того, как по меньшей мере 15 мин инкубации (или до смены носителей на клетках 293Т), добавляйте 4,25 мл ДНК + H 2 O + 2 М CaCl 2 + BES солевой смеси по каплям к 293Т, распределяя равномерно по 4 клеточных пластин в трубке (т.е. немногим более 1 мл смеси на чашку).
  9. Инкубируйте пластин в течение ночи (O / N) при 37 ° С.
  10. 24 часов после инкубации, заменить средства массовой информации на всех пластинах с 4 мл стандартной DMEM (см шаг 1.15).
  11. Держите клетки в инкубаторе C 32 ° с этого момента.
  12. 24 ч после шага 2.10, сбор средств массовой информации в отдельные 50 мл пробирки. Заменить собранные средства массовой информации из каждой пластины с 4 мл стандартной DMEM.
    Примечание: 4 пластины на первоначальные результаты трубки смеси в 16 мл собранных средств массовой информации.
    1. осле 12 ч инкубации, собирают средства массовой информации снова в те же 50 мл пробирки и заменить еще 4 мл стандартной DMEM.
    2. После 12 ч инкубации, собирают средства массовой информации и добавить в те же 50 мл пробирки.
      Примечание: каждая труба должна теперь содержать около 48 мл среды, содержащей вирус.
  13. Для того, чтобы сосредоточить собранный вирус, первый фильтр собранных средств массовой информации через 0,45 мкм с низким уровнем связывания с белками фильтров.
  14. Налейте отфильтрованные носители, содержащие вирус в концентрации вируса центрифужные пробирки (около 16 мл за один раз).
  15. Спин при 4000 х г при температуре 4 ° С в течение 25 мин и удалить проточные.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшой объем концентрированных сред и вирус будет виден в фильтре.
  16. Добавить еще 16 мл фильтрованной вируса средах, содержащих в концентрированном объеме медиа + вируса, оставшегося в фильтре и взболтайте трубку.
  17. Спин трубка снова при 4000 х г при 4 ° С в течение 25 мин и Выбросить проскок.
  18. Добавить остальные фильтруютсбор концентрированного медиа + объема вируса остается в фильтре и взболтайте трубку.
  19. Спин еще раз при 4000 х г при температуре 4 ° С в течение 10-20 мин (в зависимости от объема в фильтре) и гарантировать, что остаточный объем концентрированного медиа + вируса, оставшегося в фильтре составляет около 1 мл. Если больше 1 мл концентрированной медиа + вирус остается в фильтре, спина снова при 4000 мкг в течение 1 мин и повторяют до 1 мл не остается в фильтре.
  20. Аликвоты по 200 мкл концентрированного вируса в 1,5 мл пробирки и замораживают при температуре -80 ° С или использовать немедленно.

3. MEF Перепрограммирование

  1. Предварительное покрытие 6 а-планшеты с 0,5 мл 0,1% желатина в PBS на лунку, гарантируя, что желатин покрывает всю площадь колодца. Место в инкубаторе при 37 ° C и инкубировать в течение по крайней мере 20 мин. После инкубации удалить пластины и аспирация желатин.
  2. Пластинчатые MEFs со стандартной DMEM при плотности 25000 клеток на лунку (150000 клетокна 6-луночный планшет) на желатинизированный 6-луночного планшета (ов) со стадии 3.1, и дают отстояться O / N в 37 ° С инкубатор.
  3. Приготовьте коктейль вируса 100 мкл путем смешивания 50 мкл M2rtTA, а остальные 50 мкл смесь Gata2, Gfi1b, CFOs и Etv6 (12,5 мкл каждый).
  4. Аспирируйте средств массовой информации из MEFs и добавляют 2 мл стандартного DMEM с 8 мкг / мл бромистого hexadimethrine.
  5. Преобразовывают каждую лунку MEF пластин с 15 мкл вируса коктейле и инкубировать O / N при 37 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это день 0 процесса перепрограммирования.
  6. На 1-й день, после 16-20 ч инкубации, заменить носитель с 2 мл свежей стандартной DMEM, дополненной 1 мкг / мл DOX на лунку.
  7. Подготовьте гемопоэтических культуральной среды , дополненной гидрокортизона (10 -6 М), 100 нг / мл фактора стволовых клеток (SCF), 100 нг / мл FMS-связанных тирозинкиназы 3 лиганда (Flt3L), 20 нг / мл интерлейкина-3 (IL - 3), 20 нг / мл интерлейкина-6 (ИЛ-6), и 1 мкг / мл DOX.
  8. На 4 день aspiratе средства массовой информации из каждой лунки и мыть клетки с 1 мл PBS на лунку.
  9. Отберите PBS, диссоциируют клеток с использованием 1 мл 0,05% трипсина на лунку и собирают клетки.
  10. Граф клеток с помощью гемоцитометра, вращаются со скоростью 300 мкг в течение 5 мин, вновь суспендируют в 12 мл гемопоэтических сред, описанных в пункте 3.7 и пластины 60000 клеток на 6-луночный планшет на 0,1% желатином покрытием пластин (2 мл на лунку, 10000 клеток на лунку ).
  11. Заменить СМИ со свежими, дополненной кроветворной культуральной среды через каждые 6 дней в течение всего срока культуры (от 35 до 36 дней).
  12. Анализировать либо промежуточные клетки или возникающие кроветворные клетки, как с помощью иммуно-окрашивания 12, анализа FACS 8,12, QRT-PCR 12 и мРНК последовательности 12 , чтобы подтвердить приобретение гемогенного эндотелиальной или HSC-подобных маркеров и экспрессии генов.

4. Блок формирования (CFU) Анализы плацентарной агрегация и колонии в метилцеллюлозы

  1. Рассеките плацент от беременных C57BL / 6 мышей , как описано выше 18 на E12.5 и держать ткани на льду.
  2. Для того, чтобы начать плацента диссоциации 19, моют плацентарной ткани в 2-5 мл 0,2% коллагеназы типа I в PBS с 20% FBS и механически диссоциируют с 18G иглой устанавливают в 5 мл шприца путем пересева плаценту и PBS через иглу , по крайней мере 3 раза.
  3. После механической диссоциации, держать клетками плаценты 2-5 мл раствора коллагеназы при 37 ° С в течение 1,5 ч.
  4. Прохождение клетки через 20-25 г хвои монтировали на 5 мл шприцев несколько раз, чтобы дополнительно механически диссоциируют плацентарных клеток.
  5. Фильтр одноклеточных суспензий через клеточные сита 70 мкм.
  6. Граф клеток с гемоцитометра и облучают при 2000 сГр для митотического инактивация 20.
  7. Добавьте 10 мл кроветворной культуральной среды, дополненной 100 нг / мл SCF, 100 нг / мл Flt3L, 20 нг / мл IL-3, 20 нг / мл IL-6, и 10 нг / мл тромбопоэтина (ТПО) до 10 см блюдо.
    Примечание: DOX не требуется на данном этапе.
  8. Поместите фильтр на 0,65 мкм непосредственно на гемопоэтических культуральной среды в чашке, что позволяет ему плавать, чтобы создать поверхности раздела жидкость-газ и установить чашку в сторону.
  9. Диссоциируют день 25 трансдуцированных MEFs (полученного на стадии 3.11), как описано в пунктах 3.8-3.10 и смешать 33,000 из преобразованных MEFs с 167,000 клетками плацентарных агрегатов из шага 4.6 (соотношение 1: 6).
  10. Чтобы создать агрегат 18,21, первый спин вниз MEF и плацентарный смесь клеток со стадии 4.9 , в течение 5 мин при 300 х г. Аспирата СМИ и ресуспендирования осажденные клетки в 30-50 мкл стандартной среды DMEM с использованием P200 пипетка, рисование одноклеточной суспензии клеток в 200 мкл nonbevelled кончика пипетки.
  11. Закупоривать кончик пипетки с парафиновой пленки. Поместите заблокированного наконечник в центрифужную пробирку объемом 15 мл и спином вниз в течение 5 мин при 300 х г Таким образом, гранулы формы на охватываемый конец наконечника.
  12. Удалите наконечник из 15 мл трубки тщательно и местонаконечник на конце P200 пипеткой. Выбросьте парафиновую пленку и выдавливать осадок клеток на плавающий фильтр с шага 4.8.
    Примечание: Тарелка не более 3 агрегатов на фильтре.
  13. Культура агрегаты на плавающих фильтров 0,65 мкм в течение 4-5 дней в 37 ° C с 5% CO 2.
  14. Сбор агрегатов (не более 3 на один фильтр) с клеточным скребком, объединить их и переваривают с 0,2% коллагеназы, следуя тому же протоколу, как это сделано с целыми плацентами диссоциировать клетки (шаги 4.2-4.5).
  15. После диссоциации, мыть агрегаты с 2-5 мл PBS с добавлением 5% FBS и спином вниз клетки при 300 мкг в течение 5 мин.
  16. Ресуспендируют агрегатов в 500 мкл DMEM без FBS, P / S или L-GLUT. Возьмите этот 500 мкл ресуспендирования и добавить его к 3 мл 1% метилцеллюлозы среде с добавлением 10 нг / мл TPO, тщательно избегая образования пузырьков. Пластинчатые равные объемы этой смеси в 3 35 х 10 мм необработанной блюда культуры дляКОЕ анализах 12.
  17. В качестве контроля культуры облучали плацентарные агрегаты без перемешивания в перепрограммирован MEFs 4-5 дней и место в КОЕ анализах, как описано выше в пунктах 4.7-4.16.
    Примечание: Эти агрегаты сами по себе не образуют колоний.
  18. Граф гемопоэтические колонии вручную под микроскопом через 10-14 дней культивирования при 37 ° С с 5% CO 2.
  19. Cytospin 22 отобранных колоний , чтобы показать морфологический фенотипа отдельных клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Кровотворение представляет собой сложный процесс развития, который начинается в различных эмбриональных сайтах. Гемогенного эндотелиальные клетки находятся в этих местах и дают начало ГСК через ячейку почкованием 23. Этот процесс в настоящее время не могут быть воспроизведены путем размещения ГСК или гемопоэтических предшественников в культуре, что вызывает необходимость методологии каким - то образом получить эти клетки в пробирке, либо путем расширения HSPC ех естественных условиях или генерации де Novo. Этот протокол демонстрирует нашу новую технологию, которая пытается получить эти клетки через сверхэкспрессией TF в MEFs.

На рисунке 1 показан общий процесс перепрограммирования. После того, как MEF генерации и расширения клетки трансдуцированных с Gata2, Gfi1b, CFOs, Etv6 и FUW-M2rtTA. После 3-х дней расширения и воздействия DOX начать активацию трансгена, клетки диссоциируют и разделить на 4-й день на покрытые желатином пластин ивыращенные в дополненной кроветворной средах.

После длительной культуры пост трансдукции с перепрограммирования СМИ, клетки принять четкие морфологические изменения. На 20-й день клетки принимают эндотелиальную морфологию, отличную от MEFs. Дальнейшая культура 35 -й день результаты в нескольких круглых кроветворных-подобных клеток , выходящих из эндотелиальных подобных промежуточных соединений , которые являются GFP + (при использовании 34 / H2BGFP MEFs) и пятна положительный для СЦА1 маркеры гемопоэтических и CD45 (Рисунок 2). Это окрашивание показывает, что эти клетки получить фенотипических маркеров, указывающие на гемогенного индукции. Далее культура приводит в клетках, экспрессирующих CD45, сохраняя при этом экспрессию репортера huCD34. После культивирования клетки плацентарного агрегации принимают клоногенных потенциал и генерировать колонии в метилцеллюлозы , содержащих различные гемопоэтические морфологию и нагнетающий типа клеток (рисунок 3).

ер-together.within-страница = "1"> Рисунок 1
Рисунок 1: Стратегия гемогенного индукции в MEFs. Схема, иллюстрирующая процесс перепрограммирования, и каждый шаг в ней. Общий процесс перепрограммирования сначала включает MEF расширение, с последующим расщеплением при соответствующей плотности в покрытые желатином 6-луночных планшетах. Затем клетки трансдуцированных с коктейлем из Gata2, Gfi1b, CFOs, Etv6 и FUW-M2rtTA. Клетки культивировали со стандартной DMEM, дополненной DOX. На 4-й день клетки обрабатывают трипсином и разделены на 6-луночных планшетах. Через каждые 6 дней средства массовой информации изменяется и в выбранных временных точках клетки могут быть проанализированы с помощью FACS, КОЕ или экспрессии генов анализов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

нагрузка / 54372 / 54372fig2.jpg "/>
Рисунок 2: Индуцирование кроветворных клеток , выходящих из предшественников. Клетки, положительные по 34 / H2BGFP окрашивали СЦА1 и CD45 демонстрируют индукцию гемогенного программы. (A) Это изображение показывает слияние клеток окрашиваются для CD45 и СЦА1 в то время как флуоресцирующих GFP с подстилающей светлопольному изображением перепрограммированных клеток. Только часть населения плоской клетки выражает СЦА1, эндотелиальных / гемогенного маркер, и только закругленные кроветворные клетки, как возникающие из этих клеток Stain красный для CD45, пан-кроветворной маркера. (B) Это изображение показывает окрашенные и GFP флуоресцентные клетки без светлопольному изображения, ясно показывая тесную ассоциацию CD45 + клеток с СЦА1 + клеток. Шкала бар = 100 мкМ. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.


Рисунок 3: Генерация CD45 + гемопоэтических клеток. (A) Около 12,7% 34 / H2BGFP MEFs трансдуцированных Gata2, Gfi1b, CFOs и Etv6 являются GFP + CD45 + после 35 дней перепрограммирования. Четкие миелоидных морфологию и воздуходувной как клетки можно видеть следующее Н & Е окрашивания (б) после цитоспина из CD45 + отсортированных клеток высевали в метилцеллюлозы в течение 10-14 дней. Это демонстрирует клонального мультилинейной потенциал перепрограммированных клеток, которые принимают кроветворную функцию после трансдукции с этим минимальным набором ТФ. Шкала бар = 100 мкМ. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Создание HSPCs De Novo из легко достижимых соматических клеток предлагает уникальный метод для изучения кроветворения в пробирке, и возможность потенциально применять эту технологию для человеческой системы. Этот перевод будет генерировать новый инструмент для изучения болезни гематологического человека в блюдо, а также обеспечить по тестированию на наркотики платформы и ген возможности таргетинга для лечения многочисленных нарушений с новой терапии или трансплантации HSC. В этой области, недавние исследования расширили на способности генерировать HSPCs De Novo, демонстрируя важность нескольких особенностей процесса перепрограммирования. Они включают в себя выбор исходных клеточных популяций и коктейлей TF, а также , как условия культуры (совместно культуры нишу) и добавки (цитокины, небольшие молекулы и т.д.) оказывают существенное влияние на эффективность перепрограммирования 24-26. Несколько исследований применяют технологию перепрограммирования к человеческой системе без прохожденияплюрипотентная промежуточный продукт , 27,28 нежелательным шагом в этих процессах.

Вот протокол, который был первым, чтобы генерировать HSC-подобные клетки из соматических клеток через процесс развития, избегая при этом использования факторов плюрипотентности и образование плюрипотентных промежуточных продуктов. Сформированные ГСК-подобные клетки, по-видимому, развиваются через процесс развития, в первую очередь требует клеток проходить через кроветворный эндотелиальный промежуточный похож на EHT. На 20-й день перепрограммирования эндотелиальные подобных промежуточных форм, которые содержат эндотелиальные и кроветворные профили экспрессии генов. HSC-подобные клетки появляются из этих промежуточных клеток на 35-й день, которые содержат клеточной поверхности, иммуно-фенотип и профили экспрессии генов очень похожи на ГСК и могут производить эритроидных и миелоидных колоний в КОЕ анализах. Это говорит о том, что, в отличие от большинства других исследований, этот протокол перепрограммирование резюмирует сложный процесс развития в лабораторных условиях , и может завивкуэто дальнейшее изучение кроветворения и болезней гематологические процессы, приводящие к эмбриональное кроветворение. Эти исследования позволяют дальнейшие исследования о том, как лечить и вылечить множество гематологических расстройств, которые существуют, и как манипулировать кроветворения с этой целью. Это может быть сделано путем индуцирования кроветворения программы в фибробластах конкретного пациента , чтобы установить в пробирке моделей заболеваний. С помощью этих моделей, нормальной и больной гемопоэз может быть тонко рассеченные и изучены, а также подвергнуты экранам наркотиков и редактирования гена для лечения / исправить гемопоэтические дефекты, связанные с болезнью, представляющей интерес.

Использование мышиных фибробластов поддерживает различные полезные качества этого процесса перепрограммирования. Сами фибробласты легко получить от мышей-доноров, что делает соте простой. Переводя эту технологию для людей, таким образом, только требует пациентов образцы кожи, что делает приобретение конкретного пациента продуктов крови и последующей клеточной тэужалить жизнеспособным вариантом для лечения болезни гематологические. Кроме того, фибробласты очень эпигенетически отличие от гемопоэтических клеток, демонстрируя способность выбранных ТФ в этом перепрограммирования протоколе к эпигенетически репрессировать идентичности фибробластов, а также провоцировать гемогенного программу путем изменения эпигенетической памяти исходных клеток 29,30. Хотя трансплантация исследования пока не демонстрируют полную мультилинейной функцию приживление этих клеток, полученных, видя, если эти факторы вызывают гемогенного программу, которая генерирует полностью функциональные гемопоэтические клетки в человеческой системе будет представлять большой интерес.

Несколько шагов в этом протоколе могут быть изменены в случае возникновения трудностей во время перепрограммирования, такие как количество посеянных клеток до трансдукции и количества вируса, используемого для трансдукции. Оптимальные результаты были получены с использованием 150000 клеток на 6-луночный планшет (этап 3.2), с ранее описанным объемом VIрус (шаги 3.3 и 3.5), но больше клеток могут быть использованы в случае гибели клеток при воздействии вируса. Точно так же, меньшие объемы вируса могут быть использованы, должны некрозу клеток быть проблемой, до тех пор, как перепрограммирования протекает, как описано (что можно проверить с помощью анализа FACS, КОЕ анализов и генного профилирования). Обеспечение того, чтобы шаги 2.13-2.19 выход надлежащего количества вируса требуется для успеха остальной части протокола. Шаги 3.5-3.7 также важны, как и успешная трансдукции клеток имеет решающее значение для стимулирования этой гемогенного программы. Соответствующее количество DOX на лунку трансдуцированных клеток должны быть последовательными и свежей, чтобы обеспечить экспрессию трансгенов (таким образом, что требует частой смены печатных носителей). Хотя это и не абсолютно необходимо, культура клеток в темноте при использовании DOX может помочь предотвратить потерю функции DOX. После того, как трансдукции клетки следует тщательно контролировать под микроскопом по морфологии и анализировали с помощью различных аналитических методов (таких, как FACS и анализов КОЕ), чтобы гарантировать, Successful вирусной трансдукции и перепрограммирование. Перепрограммировали клетки могут не принять столько морфологических изменений, как и ожидалось, требующих ранее упомянутые аналитические методы, чтобы служить в качестве наилучших показателей надлежащего перепрограммирования.

Недавние исследования использовали различные свойства этого перепрограммирования протокола, такие как Gata2 в коктейле TF или фибробластов в качестве популяции клеток начальной 31-33. Эти методики также появляются, чтобы побудить программы развития в процессе перепрограммирования. Другие стратегии показали важность гемопоэтических ниши во время перепрограммирования 9,10,25,26. Выявление всех факторов , которые помогают в перепрограммирования будет иметь важное значение для разработки протокола , который генерирует добросовестные ГСК из легко достижимых клеток конкретного пациента. Таким образом, здесь мы опишем стратегию для генерации HSC-подобные клетки от индуцированного процесса развития в мышиных фибробластов через индуцируемый Gata2, Gfi1b, финансовые директора, иEtv6 избыточная экспрессия. Эта технология будет переведена в человеческой системе, где, в сочетании с другими опубликованными исследованиями, позволит поколение пациента специфических продуктов крови подходит для различных клинических применений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 11965-092
0.45 μM filters Corning 430625
Amicon Ultra centrifugal filters Millipore UFC900324
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
FBS Gemini's Benchmark 100-106
PBS Life Technologies 14190-144
18 G needles BD 305195
20 G needles BD 305175
25 G needles BD 305125
Collagenase Type I Sigma C0130-100MG
TrypLE Express Invitrogen 12605-010
Myelocult media Stem Cell Technologies M5300
SCF R & D Systems 455-MC
Flt3L R & D Systems 427-FL
IL-3 R & D Systems 403-ML
IL-6 R & D Systems 406-ML
TPO R & D Systems 488-TO
Doxycycline Sigma D9891-1G
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma AL-118
Durapore 0.65 μM membrane filters Millipore DVPP14250
Methylcellulose media Stem Cell Technologies Methocult M3434
Hydrocortisone Stem Cell Technologies 07904
C57BL/6 mice The Jackson Laboratory 000664
Gelatin Sigma G-1890 100g
pFUW-tetO Addgene Plasmid #20321
Gata2 Origene MR226728
Gfi1b Origene MR204861
cFos  Addgene Plasmid #19259
Etv6 Origene MR207053
psPAX2 Addgene Plasmid #12260
pMD2.G Addgene Plasmid #12259
CaCl2 Sigma C5670-100g
FUW-M2rtTA Addgene Plasmid #20342
35 mm x 10 mm culture dishes Thermo Scientific 171099

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
  2. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
  3. Papapetrou, E. P., Sadelain, M. Reconstructing blood from induced pluripotent stem cells. F1000 Med Rep. 2, (2010).
  4. Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
  5. Mitchell, R., et al. Molecular evidence for OCT4-induced plasticity in adult human fibroblasts required for direct cell fate conversion to lineage specific progenitors. Stem Cells. 32 (8), 2178-2187 (2014).
  6. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  7. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  8. Qiu, J., Papatsenko, D., Niu, X., Schaniel, C., Moore, K. Divisional history and hematopoietic stem cell function during homeostasis. Stem Cell Reports. 2 (4), 473-490 (2014).
  9. Riddell, J., et al. Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors. Cell. 157 (3), 549-564 (2014).
  10. Sandler, V. M., et al. Reprogramming human endothelial cells to haematopoietic cells requires vascular induction. Nature. 511 (7509), 312-318 (2014).
  11. Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. Making a Hematopoietic Stem Cell. Trends Cell Biol. , (2015).
  12. Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
  13. Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab Anim (NY. 38 (9), 305-310 (2009).
  14. Jain, K., Verma, P. J., Liu, J. Isolation and handling of mouse embryonic fibroblasts). Methods Mol Biol. 1194, 247-252 (2014).
  15. Bryja, V., Bonilla, S., Arenas, E. Derivation of mouse embryonic stem cells. Nat Protoc. 1 (4), 2082-2087 (2006).
  16. Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (1), 157-162 (2009).
  17. Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).
  18. Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
  19. Gekas, C., K, E. R., H, K. A. M. Isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta. J Vis Exp. (16), (2008).
  20. Lewis, I. D., et al. Umbilical cord blood cells capable of engrafting in primary, secondary, and tertiary xenogeneic hosts are preserved after ex vivo culture in a noncontact system. Blood. 97 (11), 3441-3449 (2001).
  21. Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
  22. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
  23. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
  24. Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view. Genes Dev. 21 (23), 3044-3060 (2007).
  25. Butler, J. M., et al. Development of a vascular niche platform for expansion of repopulating human cord blood stem and progenitor cells. Blood. 120 (6), 1344-1347 (2012).
  26. Gori, J. L., et al. Vascular niche promotes hematopoietic multipotent progenitor formation from pluripotent stem cells. J Clin Invest. 125 (3), 1243-1254 (2015).
  27. Bar-Nur, O., et al. Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage. Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).
  28. Maza, I., et al. Transient acquisition of pluripotency during somatic cell transdifferentiation with iPSC reprogramming factors. Nat Biotechnol. 33 (7), 769-774 (2015).
  29. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  30. Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. "Epigenetic memory: phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
  31. Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372 (2014).
  32. Vereide, D. T., et al. An expandable, inducible hemangioblast state regulated by fibroblast growth factor. Stem Cell Reports. 3 (6), 1043-1057 (2014).
  33. Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Rep. 9 (5), 1871-1884 (2014).

Tags

Биология развития выпуск 118 фибробласты кроветворения гемопоэтические стволовые клетки перепрограммировать транскрипционные факторы преобразование клеток судьбы кроветворения
Перепрограммирование эмбриональных фибробластов мыши с транскрипционных факторов для индуцирования кроветворения программы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Daniel, M. G., Pereira, C. F.,… More

Daniel, M. G., Pereira, C. F., Bernitz, J. M., Lemischka, I. R., Moore, K. Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program. J. Vis. Exp. (118), e54372, doi:10.3791/54372 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter