Summary
Lactase의 효소 활동의이 당 유 당 catabolic 처리를 위해 필수적 이다. 여기, 식이 보조 제에 lactase의 활동 색도계 분석 결과 사용 하 여 분석 이다. 이 lactase, 효소 활동의 활동을 이해 하기 위한 실험 플랫폼으로 학생을 제공 합니다.
Abstract
효소를 작동 하는 방법, 이해 하 고 실제 사례에이 관련 된 다양 한 생물 학적 및 생물 의학 과학에 있는 학사 학위에 중대 하다. 이 따라 쉽게 첫 해 학부 약 학 학생에 대 한 개발 되었다 프로토콜과 효소 분석에 대 한 효소 반응 및 분석 절차에 엔트리 레벨 소개를 제공 합니다. 선택의 효소는 lactase,이 인간의 질병/제약 연습에 관련 된 상업적으로 이용 가능한 효소의 예를 나타냅니다. Lactase 식이 보충 정제에서 추출 되 고 lactase는 인공 기판의 가수분해에 따라 색도계 분석 결과 사용 하 여 평가 (ortho-nitrophenol-베타-D-galactopyranoside, ONPG). 직교 nitrophenol ONPG의 가수분해 분열 lactase 다음의 릴리스 420에 흡 광도 있는 변화에 의해 측정 됩니다, 그리고 및 효소 반응에 온도 효과 얼음, 실내 온도에 37에 반응 밖으로 운반 하 여 평가 ° C. 고급 분석은 다른 조건 하에서 효소의 활동을 평가 하 고 다른 시 약을 사용 하 여이 프로토콜을 사용 하 여 구현할 수 있습니다.
Introduction
효소는 특수 유형의 생활에서 화학 반응에 대 한 생물학적 촉매 역할 단백질 유기 체1. 효소의 활동은 생활, 에너지 제공, 폐기물의 처분 및 유기 체 기능을 수 있도록 중요 합니다. 따라서, 이해 효소는 생활의 완전 한 이해에 중요 합니다. 이러한 지식은 다양 한 의료 과학에서 생물학에 이르기까지 대학 수준의 학위 프로그램에 대 한 필수적입니다. 효소 반응의 속성은의 실제적인 경험에 손에 의해 비로소 최고의 촉매의 원리에서 효소 활동의 이론적 모델에 이르기까지 자세한 배경 독서 자료와 강의 사용 하 여 학생 들에 게 제공 될 수 있다, 하는 동안 행동에 효소 이전2를 시연 했다. 이 프로토콜 제공 인간의 영양 및 건강에 관련 된 활동으로 효소의 예를 들어 lactase를 사용 하 여 실험실 조건 하에서 효소의 활동을 측정 하기 위한 실험 패러다임에 따라 간단을 합니다.
Glycosidic 가수분해 효소 락 타 아 제 (적 능력 3.2.1.23/26) 이다 효소 포유류3중앙 영양 중요성의. Lactase의 활동 높은 진화를 통해 보존 하 고 효소의 베타-galactosidase 가족에서 파생- 호모 사피엔스 (그림 1, PDB 1JZ8)4를 통해 대장균 에서 현재 가족. 인간 영양에 lactase의 중요 구성 단 당 류 구성, 시체에서 에너지를 생성 하기 위해 사용할 수 있는 유 당 분해를 허용 하는 역할에서 유래. Lactase catalyzes이 당 유 당, 갈 락 토스와 포도 당 (그림 2) 방출에 있는 glycosidic 유대의 가수분해5. 이 단은 아데노신 3 인산 염 (ATP)를 통해 6구 연산 산 성 주기 및 산화 인 산화 생성을 위해 주로 사용 됩니다. 신생아 및 유아 개발, lactase은 인간의 소화 시스템, 유 방 우유는 유 당입니다 기본 탄수화물 구성 요소, 그리고 영양의 주요 소스 중 하나 초기 동안 에서 받은 유 당을 무 너 뜨에 매우 표현 7. 선천적인 lactase 결핍증 (CLD), lactase 효소8코딩 lactase 유전자 (LCT)에 돌연변이 의해 발생 한 드문 상 염색체 열성 상태에 의해 lactase의 의학 중요성 강조. CLD와 새로운 태어난 아기 전시 거의 lactase 활동, 따라서 그들은 유 방 우유, 모든 다른 종류의 우유, 또는 유 당을 포함 하는 수식에 먹이 수 없습니다.
어린 시절, 동안 lactase 식 일반적으로 감소 된다; 그러나,이 감소 이유 다음 효소9표현 하 성인 전세계 계속의 약 35% 지리적으로, 변화 한다. Lactase, lactase 지 속성로 알려진의 지속적인된 표현 계속 다양 한 소스에서에서 우유 및 낙농 제품을 소화 하는 개인을 허용 한다. 반대로, 유 당 편협로 알려진 또한 성인 형 hypolactasia (ATH) 용기에 유 당을 분해 하는 무 능력에서 유래 lactase 식의 손실 될 수 있습니다. ATH는 빌드를 유 당 유 당 포함 된 식품의 섭취 다음 콜론에서의 특징 이다. 콜론, 축적 된 유 당 창 자 미생물 동물군, 수소, 메탄, 이산화탄소 등 가스를 방출 하 여 발효 이다. Lactase 효소 부족으로 개인에이 가스의 생산 촉진 복 부 bloating, 증가 자만심, 고통, 구역 질, 및 borborygmi (위 소리)7. 유 당 소화 관에서의 증가 수준을 또한 느슨한 발판 이어질 수 있습니다.
LCT 유전자 발현의 통제는 근처 MCM6 유전자의 introns에 있는 동 질 다 상으로 변조 됩니다. Lactase의 지속적인 식이 개인 수행 따라서 이유, 하는 동안 LCT 전사의 규정 아래 정상적인 보상 LCT 유전자 발현에 대 한 강한 원심 강화 기능 동 질 다 상 그리고 결과적으로 성인3유지 lactase 식입니다. 증강 동 질 다 상 긍정적으로 선택 된 가축과 낙 타 중동 지역에서의 순화에 따라 5 천 년 전을 제안 되었습니다9,10.
예를 들어 식단에서 유제품을 제거 하 여 유 당 섭취를 줄여 ATH에서 발생 하는 증상을 관리할 수 있습니다. ATH에 대 한 다른 접근 방법 및 CLD 위한 선택의 접근 lactase 보충, 약국에서 널리 사용할 수의 사용 이다. 이러한 보충제 lactase 촬영 하거나 유 당 포함 된 음식에 추가 수 있는 액체 또는 알 약 형태로 효 모와 박테리아 등의 다양 한 절연을 제공 합니다. 보충 유 당을 포도 당과 갈 락 토스 제품, 따라서 그들의 흡수를 허용 하 고 창 자에서 소화 되지 않은 유 당 기판의 축적을 방지 하는 식품에 존재의 비율은 것 이다.
규정식 도움으로 lactase 보충의 사용을 바탕으로, 첫 해 생물 의학 과학 또는 약 학 학생에 적합 한 간단한 enzymology 실험실 실험을 개발 했습니다. 이 실험실 실험은 상용 lactase 보충, 그리고 사용 하는 직교 활용-nitrophenol-베타-D-galactopyranoside (ONPG) lactase ( 여 glycosidic의 분열을 측정 하기 위한 색도계 끝점을 제공 하 그림 3)11. ONPG 역할 lactase 위한 인공 기질이 있는이 효소에 의해 가수분해 생산 직 nitrophenol D-갈 락 토스를 때. 후자의 제품은 노란색, 흡수 하는 420의 파장에 빛 nm. 420 nm 다음에서 흡 광도 변화를 측정 하 여 lactase ONPG의 노출,이 효소의 활동을 예측 가능 하다. 이 실험실 실험 효소 가수분해 효소 활동의 데모를 제공합니다. 추가 복제에서 서로 다른 조건에서 분석 실험을 수행 함으로써, 효소 반응 속도 론, 인간의 건강에 관련 된 행동에 효소의 귀중 한 실제 예제를 제공의 더 정교한 분석을 통합 가능 하다.
Protocol
참고: 프로토콜 아래 목적 교육 실험실에서 개최 되는 2 시간 (를 포함 하 여 클래스에 워크시트의 완료)의 과정을 통해 개발 되었다. 실험 단계 했다 의도적으로 제외 (실시 모델 데이터를 사용 하 여이 과정의 맥락에서); 효소 활동의 더 상세한 분석을 함께 넣어 그러나-토론에 설명 했 듯이-프로토콜 시간, 시설 및 학생 달성 수준에 따라 고급 분석에 대 한 템플릿을 제공 합니다.
안전:이 실제 실행 되어야 좋은 화학 실험실 연습 (GCLP)의 규칙에 따라-걸린된 실험실 외 투, 안전 안경, 일회용 장갑 등 개인 보호 장비를 착용 한다에 항상 실험실에 .
1. 효소 추출
- 효소, 박격포 및 방 앗 공이 사용 하 여도 분말의 200 mg를 포함 한 lactase 태블릿 호감.
- "정지"를 붙인 15 mL 튜브에 결과 분말을 놓고 100 mM 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 10 mL에 resuspend.
- 소용돌이 1 분 효소 추출 극대화입니다.
- 침전 물 고체 입자를 현 탁 액 1.5 mL 원심 분리기 튜브와 10000 x g 에서 1 분 동안 원심 분리기 1 mL 전송.
- "Lactase 추출" 셔 서 깨끗 한 1.5 mL 튜브에는 상쾌한의 500 µ L를 전송.
2. 색도계 반응 관찰
- 1.5 mL 튜브에 100 m m PBS의 장소 390 µ L 이라는 "반응 A".
- Vortexing에 의해 잘 100 µ L 5mm ONPG 솔루션 및 믹스를 추가 합니다.
주의:이 실제 사용 하 여 ortho-Nitrophenol-베타-D-galactopyranoside (ONPG) 유 당에 대 한 대용으로. ONPG 페 놀 화합물 이기 때문에, 그것은 신중 하 게 처리 되어야 합니다. ONPG와 피부 접촉 시 노출 된 피부 즉시 세척 되어야 한다. 모든 유출 적절 한 폐기물 스트림으로 처리를 종이 타 올 즉시 닦아 해야 합니다. - Vortexing에 의해 잘 반응 A 관 및 혼합 추출 물 10 µ L를 추가 합니다.
- 5 분 동안 반응 혼합물을 관찰 하 고 솔루션에 색도계 변경 합니다.
3. 효소 활동 측정
- 두 개의 1.5 mL 튜브를 설정: "반응 B" 이라는 "컨트롤"을 표시 한.
- B 관, 제어 튜브를 100 m m PBS의 400 µ L 반응에 100mm PBS의 390 µ L을 추가 하 고 각 튜브를 100 µ L 5 m ONPG m의 추가.
- Vortexing에 의해 내용을 혼합.
- 반응 B 관에 lactase 추출의 10 µ L을 추가 하 고 vortexing에 의해 혼합 반응 실내 온도에서 1 분 동안 진행을 허용.
- 1 분이 경과 되 면 반응 함으로써 종료 pH를 증가 하 여 lactase 효소를 억제 하기 위해 두 튜브를 1 M 탄산 나트륨의 500 µ L를 추가 합니다.
- 깨끗 한 분 광 광도 계 큐 벳에 각 관에서 500 µ L를 전송 하 고 420에서 흡 광도 측정 nm은 분 광 광도 계를 사용 하 여.
- B 반응과 컨트롤 샘플에 대 한 흡 광도 및 반응 값을 파생 하는 ONPG의 활성 효소의 가수분해로 인해 흡 광도 있는 변화에서 컨트롤 값을 뺍니다.
4입니다. 효소 활동에 온도 효과
- 섹션 3에에서 설명 된 대로 3 제어 튜브 및 3 개의 반응 관을 설정 하 고 이러한 레이블 "4 ° C", "방 온도", 그리고 "37 ° C".
- 효소의 추가 따라 추출, 얼음, 실내 온도에, 및 37 ° c (에서 미리가 열된 물 욕조)에 대 한 튜브를 품 어.
- 다음 각 튜브를 1 M 탄산 나트륨의 500 µ L을 추가 하 여 반응을 종료 1 분을 반응 수 있습니다.
- 420에 흡 광도 측정 섹션 3에에서 설명 된 대로 각 튜브에 대 한 nm. 각 경우에 반응 값에서 컨트롤 값을 뺀 값을 기록 합니다.
Representative Results
프로토콜의 섹션 2에 대 한 대표적인 결과 그림 4A에 표시 됩니다. Lactase 정제에서 추출 포함 된 반응 솔루션으로 ONPG 방출 분해는 노란색 동안 제어 반응 lactase 효소의 부재에서 명확한 남아 직교-nitrophenol. 그림 4B 정량화는 분 광 광도 계를 사용 하 여 샘플의 다음과 같은 분석 프로토콜의 섹션 4에서 임의의 단위를 사용 하 여 표시 합니다. 직교 nitrophenol의 생산은 반응은 얼음에 알을 품을 때 최저 / 최고 반응 37 ° c.에 실시
그림 1 : 대장균 베타-galactosidase. (A)에서 대장균, 복잡 한 활성의 tetrameric 구조를 보여주는 베타-galactosidase의 결정 구조. (B) Allolactose (빨간색으로 표시)의 베타-galactosidase 활성 사이트에 바인딩된. PDB 1JZ84에서 생성 된 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 의 lactase 효소 행동. 베타-D-갈 락 토스와 베타-D-포도 당을 생산 lactase에 의해 유 당 가수분해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 의 직교 가수분해-nitrophenol- 베타 -D galactopyranoside. Lactase 베타-D-갈 락 토스와 직교-nitrophenol (색상에 노란색이), 420에 흡 광도의 측정에 의해 lactase의 활동의 추정을 허용 하 여 ONPG 가수분해 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : ONPG 가수분해. ONPG 가수분해의 대표적인 결과, 420에 임의의 단위로 원시 흡 광도 보여주는 클래스에 워크시트에 기록 제어 및 반응 튜브 (A) 및 프로토콜의 섹션 4에서 대표 데이터를 보여주는 nm, 배경에 대 한 수정 및 3 다른 온도 (B)에서 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 실험 조건 | 실험 변수 |
| 온도 | 0 ° C, 10 ° C, 20 ° C, 30 ° C, 50 ° C |
| 기질 농도 | 0 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM ONPG |
| 경쟁 저해 | 5 mM ONPG 플러스 0 m m, 1 mM, 5 m m 또는 10 m m 유 당 |
| 시간 의존 | 0 s, 15, 30 s, 1 분, 5 분, 10 분, 20 분 |
| 열 변성 | Lactase 추출 시험 하기 10 분 전에 100 ° C에가 열 |
표 1: 실험 상태를 확장 하는 잠재력. Lactase 생물학의 특정 측면을 조사 하는 3 중에 실시 하는 확장된 실험을 제안 했다.
Discussion
효소, 효소 반응 및 효소 활동의 이해와 상세한 지식은 생물학, 의학 및 약 학에 걸친 주제의 넓은 범위에 대 한 필요 합니다. 위에서 설명한 프로토콜 보여주는 더 많은 고급 실험실 기반 실험에 사용할 수 있는 핵심 기술을 제공 하는 효소 반응에 대 한 인간의 건강에 관련 된 효소의 예를 들어 lactase를 사용 합니다.
이 프로토콜 시간의 짧은 공간에서 해석할 결과를 거의 또는 전혀 젖은 실험실 경험을 가진 가능한, 허용 학생 수를 의도적으로 설계 되었습니다. 2014/2015 학년도 약 학 대학의 독서 학교에서 총 144 학생, 3의 그룹으로 구성 된 모든 그룹이 lactase 정제에서 효소 활동의 어느 정도 감지할 수 있는 "lactase 측정" 실험 실시 추출합니다.
이 프로토콜에서 중요 한 단계는 여러 가지가 있습니다. 첫째, 초기 추출 후속 분석을 위해 충분 한 활성 효소의 가용 화를 수 있도록 효율적이 필수적 이다.입니다. 우리의 경험에서는, 첫 해 대학생이 달성할 수 있는 설명;는 프로토콜에 따라 그러나 실험실 논증 자에서 몇 가지 지침이 시점에서 필요 했다. 자명한 포인트 것입니다, 하지만이 프로토콜의 성공에 핵심 요소 신중 하 게 볼륨을 측정, 올바르게 레이블 튜브 및 지시의 수입니다. 동안 많은 학생 들, 주의 깊은 모니터링과의 확실 하지 않은 경우에 도움을 요청 하는 학생에 대 한 취소 요청에 대 한 일정 정도의 능력을 추측 될 수 있다 무엇을 해야할지 다음 성공적인 분석 결과의 가장 큰 가능성을 제공 합니다.
학생 평가 클래스에 워크시트 (보충 자료로 사용 가능), 학생 들이 참고 실험, 그들의 결과 배경 정보/읽기 강의 자료에서 개인에서에서 데이터를 요청 하거나 더 밖으로 실행 될 수 있다 자세한 모델 데이터 제공 시도 하 고 평가 하는 운동 분석에 대 한 허용 클래스 평가에서.
여기에 소개 하는 프로토콜은 가르치는 실험실 조건에서 lactase 활동 분석 결과의 간단한 예 이며 고급 분석을 허용 하는 실험의 복잡성이 증가 하는 충분 한 기회. 특히, 제시 프로토콜에서는 효소 활동의 개념을 소개 하지만 실험 데이터의 운동 분석을 허용 하지 않습니다. 이와 같이, 우리가 세밀 하 게 특정 목표와 학생 코 호트 사업 실험의 재능에 맞게 적응와 클래스에 대 한 초기 템플릿으로 설명된 프로토콜 보기 권하고 싶습니다. 확장 된 실험의 예 포함 될 수 있습니다: 서로 다른 온도에서 통계 분석, 운동 데이터를 분석 (생화학 학생/전공 적합), 시작 수 있도록 다른 기질 농도 사용 하 여 측정 반복 여러 다른 정제 및 효소 (제어 정제, 법의학 과학 학생/전공 적합의 추가)와 함께 각각의 다른 활동 평가, 열 변성의 영향을 평가 또는 경쟁 수행 유의 추가 또는 억제제 lactase (표 1)의 실험. Lactase의 운동 분석에 대 한 자세한 프로토콜 이전 게시12되었습니다.
이 프로토콜의 중요 한 강도 의학에서 enzymology의 진짜-생활 사례 연구와 함께 enzymology 및 효소 활동에 대 한 기본적인 소개는 결합입니다. 이것은이 실험실 의학, 약 학, 생물 의학 및 관련된 과목의 학생 들에 게 특정 한 관련성의 실험. 중요 한 것은, 심각한 건강 상태와 관련 된 유 당 놓과 더 광범위 한 식이 문제는 사실 다양 한 학생 들과 의료 및 윤리적인 문제를 기회를 제공 한다. 이 의료 조건에 대 한 유전자 검사를 둘러싼 문제를 포함할 수 있습니다 및 유전자 치료 및 유전 상담, 뿐 아니라 사용과의 약 보조 식품의 판매에 관련 된 토론. 한 가지 주요 한계는 프로토콜 추출에 사용 된 시작 물자로 인해 효소 농도의 정확한 예측에 대 한 허용 하지 않습니다. 그러나, 수정이를 담당 하는 시 약 학년 효소를 사용 하 여 분석 결과 대 한 것. 중요 한 것은,이 것 또한 lactase 효소에 대 한 속도의 더 정확한 계산에 대 한 허용.
결론적으로, 활동 시 금 교육 연구소에 lactase의 환경 소개를 제공 합니다 강력 하 고 매력적인 하 고 재미 있는 분야에 효소 생물학의 초기 단계에 대 한 대학생.
Disclosures
저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.
Acknowledgments
PAL는 파 킨 슨 병 영국 연구 친교 (그랜트 F1002)에 의해 투자 되었다. 이 일과 MRC 새로운 조사 연구 그랜트 (미스터/L010933/1)에 의해 지원 되었다 MRC 프로그램에 의해 권한을 부여 미스터/N026004/1 PAL, 고 BBSRC 재학 BB/M017222/1 JET. 우리는 그들의 의견 및 입력에 대 한이 실용적인, 그리고 이후 동료의 첫 번째 반복에 대 한 읽기의 대학에서 학생 들 MPharm 파트 1의 2014-15 일대 감사.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lactase tablet | Lamberts | 8511-60 | |
| Phosphate buffered saline (powdered) | Sigma | P3813 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM |
| ONPG | Sigma | N1127 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM |
| Sodium Carbonate | Sigma | 451614 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M |
| De-ionized water | NA | NA | |
| Pestle and mortar | VWR | ||
| Spectrophotometer | Jenway 6315 | ||
| Pipettes | Gilson | ||
| 15 mL tubes | VWR | ||
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | ||
| Spectrophotometer cuvettes | Jenway | ||
| Vortex | Vortex genie 2 | ||
| Centrifuge | Beckman | ||
| Ice bucket | VWR | ||
| Water bath | Thermo-Scientific | ||
| Weighing scales | Thermo-Scientific |
References
- Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, J. G., Stryer, L. Biochemistry. , 8th, Palgrave Macmillan. (2015).
- Jittam, P., et al. Red seaweed enzyme-catalyzed bromination of bromophenol red: An inquiry-based kinetics laboratory experiment for undergraduates. Biochemistry and Molecular Biology Education. 37, 99-105 (2009).
- Troelsen, J. T. Adult-type hypolactasia and regulation of lactase expression. Biochimica et biophysica acta. 1723, 19-32 (2005).
- Juers, D. H., et al. A structural view of the action of Escherichia coli (lacZ) beta-galactosidase. Biochemistry. 40, 14781-14794 (2001).
- Plimmer, R. H. On the presence of lactase in the intestines of animals and on the adaptation of the intestine to lactose. Journal of Physiology. 35, 20-31 (1906).
- Krebs, H. A., Salvin, E., Johnson, W. A. The formation of citric and alpha-ketoglutaric acids in the mammalian body. The Biochemical journal. 32, 113-117 (1938).
- Vesa, T. H., Marteau, P., Korpela, R. Lactose intolerance. Journal of the American College of Nutrition. 19, 165S-175S (2000).
- Robayo-Torres, C. C., Nichols, B. L. Molecular differentiation of congenital lactase deficiency from adult-type hypolactasia. Nutrition Reviews. 65, 95-98 (2007).
- Swallow, D. M. Genetics of lactase persistence and lactose intolerance. Annual Review of Genetics. 37, 197-219 (2003).
- Enattah, N. S., et al. Independent introduction of two lactase-persistence alleles into human populations reflects different history of adaptation to milk culture. American Journal of Human Genetics. 82, 57-72 (2008).
- Lowe, G. H. The rapid detection of lactose fermentation in paracolon organisms by the demonstration of beta-D-galactosidase. Journal of Medical Laboratory Technology. 19, 21-25 (1962).
- Russo, S. F., Moothart, L. Kinetic study of the Enzyme Lactase. Journal of Chemical Education. 63, 242 (1986).
