Summary
Den enzymatiske aktiviteten av laktase er viktig for katabolske behandlingen av smakløst laktose. Her er aktiviteten til laktase i kosttilskudd assayed bruker en kolorimetrisk analysen. Dette gir studentene en eksperimentell plattform for å forstå aktiviteten til laktase og enzym kinetics.
Abstract
Forstå hvordan enzymer fungerer, og om dette reelle eksempler, er avgjørende for et bredt utvalg av undergraduate grader i biologiske og biomedisinsk vitenskapene. Denne lett å følge protokollen ble utviklet for første års undervisning apotek studenter og gir en entry-level innføring enzymreaksjoner og analytisk prosedyrer for enzym analyse. Enzymet av valget er laktase, da dette er et eksempel på en kommersielt tilgjengelig enzym relevant for menneskelig sykdom/farmasøytisk praksis. Laktase er Hentet fra kosttilskudd tabletter, og vurdert ved hjelp en kolorimetrisk analysen basert på hydrolyse av en kunstig substrat for laktase (Orto-nitrophenol -beta-D-galactopyranoside, ONPG). Utgivelsen av Orto-nitrophenol etter hydrolytisk spalting av ONPG av laktase er målt ved en endring i absorbans ved 420 nm og effekten av temperatur på enzymatiske reaksjonen evalueres ved reaksjonen på is, ved romtemperatur og 37 ° C. Mer avansert analyse kan implementeres ved hjelp av denne protokollen vurdere enzymaktiviteten under ulike forhold og bruker annet reagenser.
Introduction
Enzymer er en spesialisert type protein som biologiske katalysatorer for kjemiske reaksjoner i levende organismer1. Handlingen av enzymer er avgjørende for liv, å gi energi, avhending av avfall og tillater organismer å fungere. Forståelse enzymer er derfor avgjørende for en full forståelse av livet. Slik kunnskap er viktig for en rekke universitet grad programmer, alt fra de medisinske basalfag til biologi. Mens en detaljert bakgrunn mellom prinsipper katalyse teoretiske modeller av enzym aktivitet kan gis til studenter bruker forelesninger og lesestoff, er egenskapene til enzymreaksjoner best forstått av hendene på praktisk erfaring med enzymer i aksjon som tidligere viste2. Denne protokollen gir en enkel å følge eksperimentelle paradigmet for å måle enzym aktivitet under laboratorieforhold, bruker laktase som et eksempel på et enzym med en aktivitet gjelder menneskelige ernæring og helse.
Glycosidic hydrolase laktase (EU 3.2.1.23/26) er et enzym av sentrale ernæringsmessige pattedyr3. Aktiviteten til laktase er svært bevart gjennom evolusjon, og stammer fra beta-galactosidase familien av enzymer, en familie presentere fra Escherichia coli gjennom Homo sapiens (figur 1, PDB 1JZ8)4. Den kritiske viktigheten av laktase i en menneskelig ernæringsmessige stammer fra sin rolle i slik at nedbryting av laktose i konstituerende enkle sukkerarter komponentene, som deretter kan brukes til å generere energi i kroppen. Laktase gir hydrolyse av glycosidic bånd i smakløst laktose, slippe galaktose og glukose (figur 2)5. Disse monosaccharides blir så brukt primært for generering av adenosin trifosfat (ATP) via citric acid syklus og oxidative fosforylering6. Under neonate og spedbarn utvikling, er laktase svært uttrykt i menneskets fordøyelsessystem, bryte ned laktose mottatt fra morsmelk som laktose er komponenten primære karbohydrater, og en av de viktigste kildene til ernæring i tidlige årene 7. medisinsk betydningen av laktase er markert med medfødt laktasemangel (CLD), en sjelden autosomalt recessiv tilstand forårsaket av mutasjoner i genet laktase (€ LCT) koding for laktase enzym8. Nyfødte babyer med CLD utstillingen lite laktase aktivitet, derfor de ikke kan bli lei på morsmelk, andre typer melk eller formel som inneholder laktose.
I løpet av barndommen, er laktase uttrykk vanligvis redusert; men varierer denne reduksjonen etter avvenning geografisk, med ca 35% av voksne over hele verden fortsetter å uttrykke enzym9. Vedvarende uttrykk for laktase, kjent som laktase utholdenhet, kan enkeltpersoner fortsette å fordøye melk og melkeprodukter produkter fra en rekke kilder. Omvendt, tap av laktase uttrykk kan føre til laktoseintoleranse, også kjent som voksen-type hypolactasia (ATH), som følge av manglende evne til å bryte ned laktose i tarmen. ATH er preget av en bygge opp av laktose i tykktarmen etter inntak av laktose inneholder matvarer. I tykktarmen, er den akkumulerte laktose gjæret av tarmen mikrobiell fauna, slippe gasser som hydrogen, metan og CO2. Produksjon av disse gassene i personer med laktase enzym mangler fremme abdominal oppblåsthet, økt flatulens, smerte, kvalme og borborygmi (magen buldrende)7. Økte nivåer av laktose i fordøyelseskanalen kan også føre til løs avføring.
Kontroll av € LCT genuttrykk modulert av polymorfismer i introns av nærliggende MCM6 genet. Personer med vedvarende uttrykk for laktase bære polymorfismer som fungerer som sterk distale enhancers for € LCT genuttrykk, slik kompenserende normal ned regulering av € LCT transkripsjon under avvenning, og dermed opprettholde laktase uttrykk i voksen alder3. Enhancer polymorfismer er foreslått å positivt kåret etter domestication av storfe og kameler i Midtøsten over fem tusen år siden9,10.
Symptomene skyldes ATH kan administreres ved å redusere laktose inntak, for eksempel ved å fjerne melkeprodukter fra kostholdet. En alternativ tilnærming for ATH, og tilnærming til valg for CLD, er bruken av laktase kosttilskudd, tilgjengelig fra apotek. Disse kosttilskudd gir laktase isolert fra en rekke kilder, inkludert gjær og bakterier, i et flytende eller pille-baserte skjema som kan være tatt med eller lagt til laktose inneholder mat. I tillegg vil hydrolyze en andel av laktose stede i maten til glukose og galaktose produkter, dermed tillater sin og hindre akkumulering av ufordøyd laktose underlaget i tarmen.
Basert på bruk av laktase kosttilskudd som en diett hjelp, har vi utviklet en enkel enzymology laboratory eksperimentet egnet for første år biomedisinsk vitenskap eller apotek studenter. Dette laboratoriet eksperimentet utnytter kommersielt tilgjengelig laktase kosttilskudd, og bruker Orto-nitrophenol -beta-D-galactopyranoside (ONPG) å gi en kolorimetrisk endepunktet for å måle spalting av glycosidic obligasjoner ved laktase ( Figur 3)11. ONPG fungerer en kunstig substrat for laktase, som når de utsettes for hydrolyse av dette enzymet produserer D-galaktose og Orto-nitrophenol. Sistnevnte produktet har en gul farge, absorbere lys på en bølgelengde på 420 nm. Av kvantifisere endringer i absorbans ved 420 nm følgende eksponering for ONPG laktase, er det mulig å beregne aktiviteten til dette enzymet. Dette laboratoriet eksperimentet gir en demonstrasjon av enzymatisk hydrolase aktivitet. Bygning i flere gjentak og utføre analyser i ulike forhold, er det mulig å innlemme mer avanserte analyser av enzymet kinetikk, å gi en verdifull virkelige eksempel på enzymer i aksjon gjelder for helse.
Protocol
Merk: Protokollen nedenfor ble utviklet for å holdes i løpet av to timer (inkludert ferdigstillelse av i klassen regneark) i et spesialbygd undervisning laboratorium. Eksperimentell trinnene var bevisst satt sammen for å utelukke mer detaljert analyse av enzymet kinetics (utført i forbindelse med dette kurset bruker modelldataene); Men, som nevnt i diskusjonen-protokollen gir en mal for mer avanserte analyser avhengig av tid, fasiliteter og student oppnåelse nivå.
SIKKERHET: Denne praktiske skal utføres i samsvar med reglene for god kjemisk laboratorium praksis (GCLP)-personlig verneutstyr, inkludert festet laboratoriet frakk, engangs hansker og vernebriller bør brukes på alle tider i laboratoriet .
1. utpakking enzymet
- Knuse en laktase tablett, som inneholder 200 mg enzym, til en selv pulver med en morter.
- Plasser den resulterende pulveret i en 15 mL tube merket "suspensjon" og resuspend i 10 mL 100 mM fosfat bufret saltoppløsning (PBS).
- Vortex for 1 min å maksimere enzym utvinning.
- Overføre 1 mL fra suspensjon i en 1,5 mL sentrifuge rør og sentrifuge for 1 min 10 000 x g til sediment faste partikler.
- Overføre 500 µL nedbryting av til en ren 1,5 mL tube merket "Laktase ekstra".
2. observere kolorimetrisk reaksjonen
- Sted 390 µL av 100 mM PBS i en 1,5 mL tube merket "Reaksjon A".
- Legg 100 µL av 5 mM ONPG løsning og bland godt av vortexing.
Advarsel: Denne praktiske bruker Orto-Nitrophenol -beta-D-galactopyranoside (ONPG) som en erstatning for laktose. Siden ONPG er en Flavanolene sammensatt, bør det håndteres med forsiktighet. I tilfelle hudkontakt med ONPG, bør den utsatte huden vaskes umiddelbart. Noen søl tørkes umiddelbart med papirhåndklær skal avhendes i riktig avfallsstrømmen. - Legge til 10 µL av ekstrakt i reaksjon A rør og bland godt av vortexing.
- Observere reaksjonsblandingen i 5 minutter og Merk kolorimetrisk endringer i løsningen.
3. måle enzym aktivitet
- Definere to 1,5 mL rør: en merket "Reaksjon B", en merket "kontroll".
- Legge til 390 µL av 100 mM PBS reaksjonen B tube, 400 µL av 100 mM PBS til kontroll røret og deretter legge til 100 µL av 5 mM ONPG hver rør.
- Bland innholdet ved vortexing.
- Legge til 10 µL av laktase ekstrakt reaksjon B røret, blande av vortexing og la reaksjonen å fortsette i 1 min i romtemperatur.
- Når 1 min har gått, legge 500 µL av 1 M natriumkarbonat til både rør å hemme laktase enzym ved å øke pH, dermed avslutter reaksjonen.
- Overføre 500 µL fra hver rør til ren spektrofotometer cuvettes og måle absorbans ved 420 nm bruker spektrofotometeret.
- Noter absorbansen for reaksjon B og kontroll prøver, og deretter trekke fra kontrollverdien fra reaksjon verdien å utlede endringen i absorbansen på grunn av hydrolyse av ONPG i nærvær av aktiv enzym.
4. effekten av temperatur på enzymaktiviteten
- Sette opp tre kontroll rør og tre reaksjon rør som beskrevet i del 3 og merke disse "4 ° C", "romtemp" og "37 ° C".
- Etter tillegg av enzymet pakke, Inkuber en tube på is, en ved romtemperatur og på 37 ° C (i en forvarmet vannbad).
- Tillate reaksjonene å gå for 1 min og deretter avslutte reaksjonen ved å legge 500 µL av 1 M natriumkarbonat hver rør.
- Måle absorbans ved 420 nm for hver rør som beskrevet i del 3. Registrere verdier, trekke kontrollverdien fra reaksjon verdien i hvert tilfelle.
Representative Results
Representant resultater for del 2 av protokollen er vist i figur 4A. Kontroll reaksjonen, i fravær av laktase enzym, forblir klart mens reaksjon løsningen, som inneholder ekstrakt fra laktase tavle, gulner etterhvert som ONPG er hydrolyzed lanserer Orto- nitrophenol. Figur 4B viser kvantifisering med vilkårlig enheter fra del 4 av protokollen, følgende analyse av prøver ved spektrofotometeret. Produksjon av Orto-nitrophenol er laveste når reaksjonen er ruges på is, og høyeste når reaksjonen utføres på 37 ° C.
Figur 1 : E. coli beta-galactosidase. (A) krystallstruktur av beta-galactosidase fra Escherichia coliviser tetramerisk strukturen i aktivt komplekse. (B) Allolactose (vises i rødt) bundet til det aktive området av beta-galactosidase. Bilder som genereres fra PDB 1JZ84. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Enzymatisk handling laktase. Hydrolyse av laktose av laktase beta-D-galaktose og beta-D-glukose. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Hydrolyse av Orto-nitrophenol - beta -D-galactopyranoside. ONPG hydrolyse av laktase beta-D-galaktose og Orto-nitrophenol (som er gul farge), slik at estimering av laktase aktivitet ved måling av absorbans ved 420 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : ONPG hydrolyse. Representant resultatene av ONPG hydrolyse, viser kontrollen og reaksjon rør (A) og representative data fra del 4 av protokollen registrert på i klassen regneark, viser rå absorbansen i vilkårlig enheter på 420 nm, korrigert for bakgrunnen og ved tre forskjellige temperaturer (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Eksperimentell tilstand | Eksperimentell variabler |
| Temperatur | 0 ° C, 10 ° C, 20 ° C, 30 ° C, 50 ° C |
| Substrat konsentrasjon | 0 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM ONPG |
| Konkurrerende | 5 mM ONPG pluss 0 mM, 1 mM, 5 mM eller 10 mM laktose |
| Tid avhengighet | 0 s, 15 s, 30 s, 1 min, 5 min, 10 min, 20 min |
| Varme rødsprit | Laktase ekstrakt oppvarmet til 100 ° C i 10 min før analysen |
Tabell 1: potensial utvidet eksperimentelle tilstand. Foreslått utvidet eksperimenter, utføres i tre eksemplarer, undersøke bestemte aspekter av laktase biologi.
Discussion
En detaljert kunnskap og forståelse av enzymer, enzymatiske reaksjoner og enzym kinetics kreves for et bredt spekter av emner som spenner over biologi, biomedisin og farmakologi. Protokollen beskrevet ovenfor bruker laktase som et eksempel på et enzym som er relevante for helse for demonstrere enzymatiske reaksjoner, gir viktige ferdigheter som kan brukes i mer avanserte laboratorie-baserte eksperimenter.
Denne protokollen er bevisst utviklet for å være så robuste som mulig, slik at studenter med liten eller ingen våt laboratorium erfaring å produsere interpretable resultater i løpet kort tid. I 2014/2015 studieåret ved University of Reading School of apotek, totalt 144 studenter, ordnet i grupper på 3, utført "måle laktase" eksperimentet, med alle grupper kjøpedyktig merker noen grad av enzymatisk aktivitet fra laktase tavle trekker ut.
Det finnes en rekke viktige trinn i denne protokollen. Først er det viktig at den første ekstraksjonen er effektivt, slik at solubilization av nok aktiv enzym for senere analyser. I vår erfaring, første år studenter kan oppnå dette ved å følge protokollen som skissert; men litt veiledning fra laboratoriet demonstranter var nødvendig på dette punktet. Selv om det synes en selvinnlysende punkt, er en nøkkelfaktor i suksessen til denne protokollen nøye måle volumer, riktig etikett rør og følger instruksjonene. Mens et visst nivå av ferdigheter kan antas for mange studenter, nøye overvåking og en tømmingsforespørsel for studenter å be om hjelp som de er usikker på gir hva du skal gjøre neste størst sannsynligheten for et vellykket analysen.
Student evaluering kan utføres i klassen regnearket (tilgjengelig som supplerende materiale), ber elevene å merke data fra eksperimentene, kommentere sine resultater og link bakgrunn informasjon/leser fra forelesning materiale, eller mer detaljert, av klassen vurderingen modelldataene fra gir kinetic analyser prøvde og vurderes.
Protokollen presenteres her er et eksempel på en laktase aktivitet analysen under undervisning laboratorium, og det er rikelig anledning til å øke kompleksiteten ved å tillate mer avanserte analyser. Spesielt presentert protokollen gir en innføring i begrepet enzym kinetikk, men tillater ikke kinetisk analyse av prøvedata. Derfor anbefaler vi ser beskrevet protokollen som en første mal for klasser, med presise detaljer tilpasset bestemte mål og talenter av student kohorten gjennomføre eksperimenter. Eksempler på utvidede eksperimenter kan omfatte: gjentatte målinger ved forskjellige temperaturer, bruker forskjellige substrat konsentrasjoner tillate statistisk analyse, kinetisk analyse av data (egnet for biokjemi studenter/hovedfag), starter med flere forskjellige tabletter og slik at studentene til å evaluere ulike aktivitet av enzymet i hver (med tillegg av kontroll tabletter, egnet for rettsmedisinske vitenskap studenter/hovedfag), vurdere effekten av varme rødsprit eller gjennomføre konkurransen Eksperimenter med tillegg av laktose eller hemmere av laktase (tabell 1). En detaljert protokoll for kinetisk analyse av laktase har tidligere blitt publisert12.
En viktig styrken til denne protokollen er at den kombinerer en grunnleggende innføring i enzymology og enzym kinetics med en virkelige case studie av enzymology i medisin. Dette gjør dette laboratoriet eksperimentet av spesiell relevans for studenter av medisin, farmasi, biomedisinsk vitenskap og relaterte emner. Viktigere, gir at det er både en alvorlig medisinsk tilstand og en mer utbredt kosttilskudd problem forbundet med laktose katabolisme muligheten til å høyne en rekke medisinske og etiske problemer med studentene. Dette kan omfatte spørsmålene rundt genetisk testing for sykdommer og tilknyttede diskusjoner om genterapi og genetisk veiledning, samt bruk og salg av medisinske kosttilskudd. Ettall større begrensningen er at protokollen ikke tillater for nøyaktig estimering av enzymet konsentrasjon, på grunn av utgangsmaterialet brukes for utvinning. En modifikasjon til kontoen for dette, men ville være å bruke reagens klasse enzymet for analysen. Viktigere, vil dette også tillate for mer nøyaktig beregning av kinetics for laktase enzym.
Avslutningsvis assaying aktiviteten av laktase i en undervisning lab miljø gir en robust, engasjerende og interessant innføring i feltet enzym biologi for tidlig stadium studenter.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre.
Acknowledgments
PAL ble finansiert av en Parkinson's UK forskningsstipend (grant F1002). Dette arbeidet ble støttet av en MRC nye etterforsker Research Grant (MR/L010933/1) og MRC program gir MR/N026004/1 PAL, og BBSRC studentship BB/M017222/1 til JET. Vi takker 2014-15 kohort av MPharm del 1 studenter ved University of Reading for å delta i den første iterasjonen av denne praktisk, og påfølgende kohorter for deres tilbakemeldinger og inndata.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lactase tablet | Lamberts | 8511-60 | |
| Phosphate buffered saline (powdered) | Sigma | P3813 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM |
| ONPG | Sigma | N1127 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM |
| Sodium Carbonate | Sigma | 451614 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M |
| De-ionized water | NA | NA | |
| Pestle and mortar | VWR | ||
| Spectrophotometer | Jenway 6315 | ||
| Pipettes | Gilson | ||
| 15 mL tubes | VWR | ||
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | ||
| Spectrophotometer cuvettes | Jenway | ||
| Vortex | Vortex genie 2 | ||
| Centrifuge | Beckman | ||
| Ice bucket | VWR | ||
| Water bath | Thermo-Scientific | ||
| Weighing scales | Thermo-Scientific |
References
- Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, J. G., Stryer, L. Biochemistry. , 8th, Palgrave Macmillan. (2015).
- Jittam, P., et al. Red seaweed enzyme-catalyzed bromination of bromophenol red: An inquiry-based kinetics laboratory experiment for undergraduates. Biochemistry and Molecular Biology Education. 37, 99-105 (2009).
- Troelsen, J. T. Adult-type hypolactasia and regulation of lactase expression. Biochimica et biophysica acta. 1723, 19-32 (2005).
- Juers, D. H., et al. A structural view of the action of Escherichia coli (lacZ) beta-galactosidase. Biochemistry. 40, 14781-14794 (2001).
- Plimmer, R. H. On the presence of lactase in the intestines of animals and on the adaptation of the intestine to lactose. Journal of Physiology. 35, 20-31 (1906).
- Krebs, H. A., Salvin, E., Johnson, W. A. The formation of citric and alpha-ketoglutaric acids in the mammalian body. The Biochemical journal. 32, 113-117 (1938).
- Vesa, T. H., Marteau, P., Korpela, R. Lactose intolerance. Journal of the American College of Nutrition. 19, 165S-175S (2000).
- Robayo-Torres, C. C., Nichols, B. L. Molecular differentiation of congenital lactase deficiency from adult-type hypolactasia. Nutrition Reviews. 65, 95-98 (2007).
- Swallow, D. M. Genetics of lactase persistence and lactose intolerance. Annual Review of Genetics. 37, 197-219 (2003).
- Enattah, N. S., et al. Independent introduction of two lactase-persistence alleles into human populations reflects different history of adaptation to milk culture. American Journal of Human Genetics. 82, 57-72 (2008).
- Lowe, G. H. The rapid detection of lactose fermentation in paracolon organisms by the demonstration of beta-D-galactosidase. Journal of Medical Laboratory Technology. 19, 21-25 (1962).
- Russo, S. F., Moothart, L. Kinetic study of the Enzyme Lactase. Journal of Chemical Education. 63, 242 (1986).
