Summary
Den enzymatiska aktiviteten av laktas är viktigt för katabola bearbetning av disackarid laktos. Här, har aktiviteten av laktas som finns i kosttillskott analyserats med hjälp av en kolorimetrisk test. Detta ger eleverna en experimentell plattform för att förstå aktiviteten av laktas och enzym kinetik.
Abstract
Förstå hur enzymer fungerar, och om detta till exempel från verkliga livet, är kritisk till ett brett utbud av grundutbildningsprogram grader inom biologisk och biomedicinsk vetenskap. Detta lätt att följa protokollet utvecklades för första året grundutbildningsprogram apotek studenter och ger en nybörjar introduktion till enzymreaktioner och analytiska förfaranden för enzym analys. Enzymet val är laktas, som detta utgör ett exempel på ett kommersiellt tillgängliga enzym som är relevanta för mänskliga sjukdom/farmaceutiska praxis. Laktas utvinns från kosttillskott tabletter, och utvärderas med hjälp av en kolorimetrisk test utifrån hydrolys av ett artificiellt substrat för laktas (ortho-nitrofenol -beta-D-galactopyranoside, ONPG). Release av ortho-nitrofenol efter hydrolytiska klyvning av ONPG av laktas mäts genom en förändring av absorbans vid 420 nm, och effekten av temperaturen på den enzymatiska reaktionen utvärderas genom att utföra reaktionen på isen, i rumstemperatur och på 37 ° C. Mer avancerad analys kan genomföras använder det här protokollet genom att bedöma enzymaktiviteten under olika förhållanden och med olika reagens.
Introduction
Enzymer är en specialiserad typ av protein som fungerar som biologiska katalysatorer för kemiska reaktioner i levande organismer1. Handlingen av enzymer är avgörande för liv, ger energi, avfallshantering och låta organismer ska fungera. Förståelse enzymer är därför avgörande för en fullständig förståelse av livet. Sådan kunskap är viktigt för en mängd olika universitet nivå utbildningsprogram, alltifrån de medicinska vetenskaperna till biologi. Medan en detaljerad bakgrund som sträcker sig från principerna för katalys till teoretiska modeller av enzymaktivitet kan ges till elever med hjälp av föreläsningar och läsa material, är egenskaper för enzymreaktioner bäst förstås av händerna på praktisk erfarenhet av enzymer i handling visat som tidigare2. Detta protokoll ger en enkel att följa experimentella paradigm för att mäta enzymaktiviteten i laboratoriemiljö, med laktas som exempel av ett enzym med en verksamhet som är relevant för mänsklig näring och hälsa.
Glycosidic hydrolas laktas (EG 3.2.1.23/26) är ett enzym av central näringsmässiga betydelse för däggdjur3. Aktiviteten av laktas är starkt bevarad genom evolutionen och härrör från beta-galaktosidas familj av enzymer – en familj som är närvarande från Escherichia coli genom att Homo sapiens (figur 1, PDB 1JZ8)4. Den avgörande betydelsen av laktas i en mänsklig näringsmässiga inställning härrör från dess roll i att låta nedbrytningen av laktos i dess konstituerande monosackarid beståndsdelar, som sedan kan användas för att generera energi i kroppen. Laktas katalyserar hydrolys av glykosidbindning i disackarid laktos, galaktos och glukos (figur 2)5. Dessa monosackarider används primärt för generering av adenosintrifosfat (ATP) via citronsyracykeln och oxidativ fosforylering6. Under nyfödda och spädbarn utveckling uttrycks mycket laktas i mänskliga matsmältningssystemet, att bryta ner laktos fick från bröstmjölk som laktos är komponenten primära kolhydrat, och en av de viktigaste källorna till näring under tidiga år 7. medicinska betydelsen av laktas markeras av medfödd laktasbrist (CLD), en sällsynt autosomalt recessiv sjukdom orsakas av mutationer i genen laktas (LCT) som kodar för laktas enzym8. Nyfödda barn med CLD uppvisar mycket lite laktas aktivitet, således de matas inte på bröstmjölk, någon annan typ av mjölk eller formel som innehåller laktos.
Under barndomen minskas normalt laktas uttryck; men varierar denna minskning efter avvänjning geografiskt, med cirka 35% av vuxna i världen fortsätter att uttrycka de enzym9. Ihållande uttryck av laktas, kallas laktas uthållighet, tillåter individer att fortsätta att smälta mjölk och mejeri produkter från en rad källor. Förlusten av laktas uttryck kan däremot leda till laktosintolerans, även känd som vuxen-typ hypolactasia (ATH), följd av oförmåga att bryta ner laktos i tarmen. ATH kännetecknas av en bygga upp laktos i kolon efter intag av laktos som innehåller livsmedel. I kolon fermenteras ackumulerade laktos av gut mikrobiell fauna, släppa gaser inklusive väte, metan och koldioxid. Produktionen av dessa gaser hos personer med laktasbrist enzymbrist främja buk uppblåsthet, ökad gasbildning, smärta, illamående och borborygmi (mage mullrande)7. Ökade nivåer av laktos i mag-tarmkanalen kan också leda till lös avföring.
Kontroll av LCT genuttryck moduleras av polymorfismer i introner av närliggande MCM6 genen. Individer med ihållande uttryck av laktas bära polymorfismer som fungerar som starka distala förstärkare för LCT genuttryck, således kompensera normalt nedreglering av LCT transkription under avvänjning, och följaktligen upprätthålla laktas uttryck i vuxen ålder3. Enhancer polymorfismer har föreslagits till har valts positivt efter domesticeringen av boskap och kameler i Mellanöstern över fem tusen år sedan9,10.
Symtomen uppkommer ATH kan hanteras genom att minska laktos intag, till exempel genom att ta bort mejeriprodukter från kosten. Ett alternativt tillvägagångssätt för ATH, och att närma sig av val för CLD, är användningen av laktas tillskott, allmänt tillgänglig från apotek. Dessa tillskott ge laktas som isolerats från en mängd källor, inklusive jäst och bakterier, i ett flytande eller piller-baserade formulär som kan tas med eller läggas till laktos som innehåller mat. Tillägget kommer att hydrolysera andelen laktos förekommer i maten till glukos och galaktos produkter, således tillåta deras absorbering och förhindra ansamling av osmält laktos substrat i tarmen.
Baserat på användningen av laktas kosttillskott som en kost stöd, har vi utvecklat en enkel Enzymologi laboratorium experiment lämplig för biomedicinsk vetenskap eller apotek förstaårsstudenter. Detta laboratorium experiment tar fördel av kommersiellt tillgängliga laktas kosttillskott och använder ortho-nitrofenol -beta-D-galactopyranoside (ONPG) att tillhandahålla en kolorimetrisk slutpunkt för att mäta klyvning av glycosidic obligationer av laktas ( Figur 3)11. ONPG fungerar en konstgjord substrat för laktas, som när de utsätts för hydrolys av detta enzym producerar D-galaktos- och ortho-nitrofenol. Den senare produkten har en gul färg, absorberar ljus med en våglängd på 420 nm. Genom att kvantifiera eventuella förändringar i absorbans vid 420 nm efter exponeringen av ONPG att laktas, det är möjligt att uppskatta aktiviteten hos detta enzym. Detta laboratorium experiment ger en demonstration av enzymatisk hydrolas aktivitet. Genom att bygga i ytterligare replikat och utföra analyser i olika förhållanden, är det möjligt att införliva mer sofistikerade analyser av enzymkinetik, ger ett värdefullt verkliga livet exempel på enzymer i åtgärder som är relevanta för människors hälsa.
Protocol
Obs: Protokollet nedan utvecklades för att hållas under loppet av två timmar (inklusive slutförande av i klassen kalkylblad) i ett specialbyggt undervisning laboratorium. Experimentell stegen var medvetet sätta samman för att utesluta mer detaljerad analys av enzymkinetik (som utförs inom ramen för denna kurs använder modelldata); dock — som nämnts i diskussionen — protokollet innehåller en mall för mer avancerade analyser beroende på tid, faciliteter och studenten uppnå nivå.
SÄKERHET: Denna praktiska bör utföras enligt reglerna av bra kemiska laboratorium praxis (GCLP) — personlig skyddsutrustning, inklusive fäst laboratorierock, engångshandskar och skyddsglasögon bör användas på alla gånger i laboratoriet .
1. extrahera enzymet
- Krossa en laktas tablett, som innehåller 200 mg enzym, till en jämn pulver med en mortel och stöt.
- Placera det resulterande pulvret i en 15 mL tub märkt ”avstängning” och blandas i 10 mL 100 mM fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Virvel för 1 min att maximera enzym utvinning.
- Över 1 mL från suspensionen i en 1,5 mL centrifugrör och Centrifugera i 1 minut vid 10 000 x g till sediment fasta partiklar.
- Överföra 500 μl av supernatanten till en ren 1,5 mL tub märkt ”laktas Extract”.
2. att observera kolorimetrisk reaktion
- Plats 390 µL av 100 mM PBS i ett 1,5 mL rör märkta ”A reaktion”.
- Tillsätt 100 µL av 5 mM ONPG lösning och blanda väl genom vortexa.
Varning: Denna praktiska använder ortho-nitrofenol -beta-D-galactopyranoside (ONPG) som ett substitut för laktos. Eftersom ONPG är en fenoliska förening, bör det hanteras med försiktighet. I händelse av hudkontakt med ONPG, skall den utsatta huden tvättas omedelbart. Eventuella spill torkas omedelbart med hushållspapper för att slängas in i lämpliga avfallsflödet. - Lägg till 10 µL av extraktet i reaktionsröret A och blanda väl genom vortexa.
- Observera reaktionsblandningen i 5 minuter och notera ändringar kolorimetriska lösningen.
3. mäta enzymaktiviteten
- Ställa in två 1,5 mL rör: en märkt ”reaktion B”, en märkt ”kontroll”.
- Tillsätt 390 µL 100 mM PBS i reaktionen B tube, 400 µL av 100 mM PBS till kontroll röret och sedan Tillsätt 100 µL av 5 mM ONPG i varje rör.
- Blanda innehållet genom vortexa.
- Tillsätt 10 µL av laktas extrakt i reaktionsröret B, blanda genom vortexa och tillåta reaktionen att gå vidare för 1 min i rumstemperatur.
- När 1 min förflutit, lägga till 500 µL 1 M natriumkarbonat i båda rören att hämma enzymet laktas genom att öka pH, därmed avsluta reaktionen.
- Överföra 500 µL från varje rör i ren spektrofotometer kyvetter och mäta absorbans vid 420 nm med en spektrofotometer.
- Observera absorbansen för reaktion B och kontrollprover och subtrahera sedan kontrollvärdet från värdet reaktion att härleda förändringen i absorbansen på grund av hydrolys av ONPG i närvaro av aktiva enzym.
4. temperaturens inverkan på enzymaktivitet
- Ställa in tre kontroll rör och tre reaktionsrören som beskrivs i avsnitt 3 och märka dessa ”4 ° C”, ”rumstemperatur” och ”37 ° C”.
- Efter tillsats av enzym extrakt, inkubera en tub på isen, en vid rumstemperatur, och en vid 37 ° C (i en förvärmd vattenbad).
- Att reaktionerna på gå vidare för 1 min och sedan avsluta reaktionen genom att lägga 500 µL 1 M natriumkarbonat till varje rör.
- Mät absorbansen vid 420 nm för varje tub som beskrivs i avsnitt 3. Registrera värdena, subtrahera kontrollvärdet från reaktion värdet i varje fall.
Representative Results
Representativa resultat för avsnitt 2 i protokollet visas i figur 4A. Kontrollreaktionen, i avsaknad av laktas enzym, förblir klar medan den reaktion lösning, som innehåller utdrag ur laktas tabletten, blir gul som ONPG hydrolyseras släppa ortho- nitrofenol. Figur 4B visar kvantifiering med godtyckliga enheter från avsnitt 4 i protokollet, följande analys av prover med spektrofotometern. Produktionen av ortho-nitrofenol är när reaktionen är ruvade på is, och högsta när reaktionen utförs vid 37 ° C.
Figur 1 : E. coli beta-galaktosidas. (A) kristallen strukturerar av beta-galaktosidas från Escherichia coli, visar den tetrameriska strukturen i aktivt komplex. (B) Allolactose (visas i rött) bunden till den aktiva platsen av beta-galaktosidas. Bilder som genereras från PDB 1JZ84. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Enzymatiska verkan av laktas. Hydrolys av laktos av laktas att producera beta-D-galaktos- och beta-D-glukos. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Hydrolys av ortho-nitrofenol - beta -D-galactopyranoside. ONPG hydrolys av laktas att producera beta-D-galaktos- och ortho-nitrofenol (som är gul i färgen), möjliggör skattning av laktas aktivitet genom mätning av absorbans vid 420 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : ONPG hydrolys. Representativa resultat av ONPG hydrolys, visar kontroll och reaktion rör (A) och representativa uppgifter från avsnitt 4 i protokollet noteras på i klassen kalkylblad, visar raw absorbansen i godtyckliga enheter vid 420 nm, korrigerat för bakgrunden och vid tre olika temperaturer (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Experimentella villkor | Experimentell variabler |
| Temperatur | 0 ° C, 10 ° C, 20 ° C, 30 ° C, 50 ° C |
| Substrat koncentrationen | 0 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM ONPG |
| Kompetitiv hämning | 5 mM ONPG plus 0 mM, 1 mM, 5 mM eller 10 mM laktos |
| Tid beroende | 0 s, 15 s, 30 s, 1 min, 5 min, 10 min, 20 min |
| Värme denaturering | Laktas extrakt hettas upp till 100 ° C i 10 min före till assay |
Tabell 1: Potential extended experimentella villkor. Föreslog utökade experiment, som skall utföras i tre exemplar, utreda specifika aspekter av laktas biologi.
Discussion
En detaljerad kunskap om och förståelse av enzymer, enzymatiska reaktioner och enzymkinetik krävs för ett brett spektrum av ämnen som spänner över biologi, biomedicin och farmakologi. Det protokoll som beskrivs ovan används laktas som exempel av ett enzym som är relevanta för människors hälsa för att demonstrera enzymatiska reaktioner, som ger viktiga färdigheter som kan användas i mer avancerade laboratoriebaserade experiment.
Detta protokoll har avsiktligt utformats för att vara lika robusta som möjligt, så att elever med liten eller ingen våt laboratorium erfarenhet att producera tolkningsbara resultat på kort tid. Läsåret 2014/2015 vid universitetet i Reading School of apotek utförs totalt 144 elever, ordnade i grupper av 3, ”att mäta laktas” experimentet, med alla grupper kan upptäcka vissa nivå av enzymaktivitet från laktas surfplatta extrakt.
Det finns ett antal kritiska steg i detta protokoll. Det första är det viktigt att första extraktionen är effektiv, att låta lösbarhet av tillräckligt aktiva enzym för efterföljande analyser. Vår erfarenhet, första året grundutbildningsstudenter kan uppnå detta genom att följa protokollet som beskrivs; men viss vägledning från laboratoriet demonstranter var skyldig på denna punkt. Även om det verkar en självklar punkt, är en viktig faktor för framgången för detta protokoll förmågan att noggrant mäta volymer, korrekt märka rören och följ instruktionerna. Medan en viss kunskapsnivå kan antas för många studenter, noggrann övervakning och en tydlig begäran om eleverna att be om hjälp i händelse av att de är osäkra ger vad du ska göra nästa största sannolikheten för en framgångsrik analys.
Utvärdera eleverna kan utföras av i klassen kalkylbladet (finns som kompletterande material), be eleverna att notera data från experimenten, kommentera deras resultat och länk till bakgrunden information/läsning från föreläsning material, eller av mer detaljerad, ur klass bedömning med modelldata som möjliggör kinetiska analyser försökt och utvärderas.
Det protokoll som presenteras häri är ett enkelt exempel på en laktas aktivitet assay under undervisning laboratorieförhållanden, och det finns stora möjligheter att öka komplexiteten i experimentet att tillåta mer avancerade analyser. I synnerhet presenterade protokollet ger en introduktion till begreppet enzymkinetik men låter inte för kinetiska analys av experimentella data. Som sådan, skulle vi rekommendera visning protokollet beskrivs som ett inledande mall för klasser, med de exakta detaljerna som anpassas till de särskilda målen och talanger av student kohorten företag experimenten. Exempel på utökade experiment kunde: upprepade mätningar vid olika temperaturer, med hjälp av olika substrat koncentrationer för att möjliggöra statistisk analys, kinetic analys av data (lämplig för biokemi studenter/majors), börjar med flera olika tabletter och att studenterna skulle utvärdera olika aktivitet av enzymet i varje (med tillägg av control tabletter, lämplig för forensisk vetenskap studenter/majors), bedömning av inverkan av värme denaturering, eller utföra konkurrens experiment av tillägg av laktos eller hämmare av laktas (tabell 1). Ett detaljerat protokoll för kinetiska analys av laktas har tidigare varit publicerade12.
En viktig styrka i detta protokoll är att den kombinerar en grundläggande introduktion till Enzymologi och enzym kinetik med en verklig fallstudie av Enzymologi i medicin. Detta gör detta laboratorium experiment av särskild betydelse för studenter i medicin, farmaci, biomedicin och relaterade ämnen. Allt erbjuder det faktum att det finns både ett allvarligt medicinskt tillstånd och ett mer utbrett kosten problem associerade med laktos katabolism möjlighet att höja ett brett utbud av medicinska och etiska frågor med eleverna. Detta skulle kunna omfatta frågorna kring genetisk testning för medicinska tillstånd och associerade diskussionerna om genterapi och genetisk rådgivning, samt användning och försäljning av läkemedel kosttillskott. En stor begränsning är att protokollet inte tillåter exakt uppskattning av enzym koncentration, på grund av ett utgångsmaterial som används för utvinning. En ändring av konto för detta, dock vore att använda reagens grade enzym för analysen. Allt skulle detta också möjliggöra för mer exakt beräkning av kinetik för enzymet laktas.
Sammanfattningsvis, testmetoder aktiviteten av laktas i undervisning labb miljö ger en robust, engagerande och intressant introduktion till fältet av enzym biologi för tidigt universitetsstuderande.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter avslöja.
Acknowledgments
PAL har finansierats av en Parkinson UK Research Fellowship (grant F1002). Detta arbete stöddes av en MRC nytt utredare forskningsanslag (herr/L010933/1) och av MRC-programmet ge herr/N026004/1 till PAL, och av BBSRC STUDENTTILLVARO BB/M017222/1 till JET. Vi tackar 2014-15 kohorten av MPharm Del1 studenter vid universitetet i Reading för att delta i den första iterationen av denna praktiska och efterföljande kohorter för deras feedback och input.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lactase tablet | Lamberts | 8511-60 | |
| Phosphate buffered saline (powdered) | Sigma | P3813 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM |
| ONPG | Sigma | N1127 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM |
| Sodium Carbonate | Sigma | 451614 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M |
| De-ionized water | NA | NA | |
| Pestle and mortar | VWR | ||
| Spectrophotometer | Jenway 6315 | ||
| Pipettes | Gilson | ||
| 15 mL tubes | VWR | ||
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | ||
| Spectrophotometer cuvettes | Jenway | ||
| Vortex | Vortex genie 2 | ||
| Centrifuge | Beckman | ||
| Ice bucket | VWR | ||
| Water bath | Thermo-Scientific | ||
| Weighing scales | Thermo-Scientific |
References
- Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, J. G., Stryer, L. Biochemistry. , 8th, Palgrave Macmillan. (2015).
- Jittam, P., et al. Red seaweed enzyme-catalyzed bromination of bromophenol red: An inquiry-based kinetics laboratory experiment for undergraduates. Biochemistry and Molecular Biology Education. 37, 99-105 (2009).
- Troelsen, J. T. Adult-type hypolactasia and regulation of lactase expression. Biochimica et biophysica acta. 1723, 19-32 (2005).
- Juers, D. H., et al. A structural view of the action of Escherichia coli (lacZ) beta-galactosidase. Biochemistry. 40, 14781-14794 (2001).
- Plimmer, R. H. On the presence of lactase in the intestines of animals and on the adaptation of the intestine to lactose. Journal of Physiology. 35, 20-31 (1906).
- Krebs, H. A., Salvin, E., Johnson, W. A. The formation of citric and alpha-ketoglutaric acids in the mammalian body. The Biochemical journal. 32, 113-117 (1938).
- Vesa, T. H., Marteau, P., Korpela, R. Lactose intolerance. Journal of the American College of Nutrition. 19, 165S-175S (2000).
- Robayo-Torres, C. C., Nichols, B. L. Molecular differentiation of congenital lactase deficiency from adult-type hypolactasia. Nutrition Reviews. 65, 95-98 (2007).
- Swallow, D. M. Genetics of lactase persistence and lactose intolerance. Annual Review of Genetics. 37, 197-219 (2003).
- Enattah, N. S., et al. Independent introduction of two lactase-persistence alleles into human populations reflects different history of adaptation to milk culture. American Journal of Human Genetics. 82, 57-72 (2008).
- Lowe, G. H. The rapid detection of lactose fermentation in paracolon organisms by the demonstration of beta-D-galactosidase. Journal of Medical Laboratory Technology. 19, 21-25 (1962).
- Russo, S. F., Moothart, L. Kinetic study of the Enzyme Lactase. Journal of Chemical Education. 63, 242 (1986).
