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Biology

Probenvorbereitung für die Massen Cytometry-Analyse

Published: April 29, 2017 doi: 10.3791/54394
Automatic Translation
1, 1, 1
1Epigenetics and Molecular Carcinogenesis, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

Abstract

Massen-Zytometrie verwendet mit Schwermetalletiketten konjugierte Antikörper, ein Ansatz, der stark erhöht die Anzahl der Parameter und Möglichkeiten für tiefe Analyse weit über hat, was möglich ist mit herkömmlichen fluoreszenzbasierten Durchflusszytometrie. Wie bei jeder neuen Technologie gibt es wichtige Schritte, die die zuverlässige Erzeugung von qualitativ hochwertigen Daten sicherzustellen. Dargestellt ist hier ein optimiertes Protokoll, das mehrere Techniken für die Verarbeitung von Zellproben für die Massen Zytometrie Analyse einbezieht. Die hier beschriebenen Methoden helfen dem Benutzer häufige Fehler zu vermeiden und konsistente Ergebnisse erzielen durch Variabilität zu minimieren, die zu ungenauen Daten führen kann. Um experimentelles Design zu informieren, die Gründe für optionale oder alternative Schritte in dem Protokoll und ihre Wirksamkeit bei der Aufdeckung neue Erkenntnisse in der Biologie des Systems wird untersucht, behandelt. Schließlich wird repräsentative Daten vorgelegt erwarteten Ergebnisse der Techniken presente zu illustrierenhier d.

Introduction

Cytometry ermöglicht die gleichzeitige Messung mehrerer Antikörper Ziele in einer einzelnen Zelle Ebene über große Populationen von Zellen. In herkömmlichen fluoreszenzbasierten Durchflusszytometrie, die Anzahl der Parameter, die quantifiziert werden kann, wird durch spektrale Überlappung zwischen dem Emissionsspektrum von mehreren Fluorophoren begrenzt, die immer komplexer werdenden Kompensationsberechnungen wie die Anzahl der Parameter ansteigt erfordert. Diese Einschränkungen werden durch Massen adressiert Cytometry, wo Schwermetall-konjugierten Antikörper nachgewiesen werden, und durch Flugzeit (TOF) Massenspektrometrie quantifizieren stark die Anzahl der Parameter gesammelt gleichzeitig expandiert und ein hohes Dimensionsprotein Überfluß Profil für jede einzelne Zelle zu ergeben.

Ein grundlegendes Verständnis der Funktionsweise des Massen Zytometrie Instrument ist für den Benutzer von Vorteil und kann für die Fehlersuche wesentlich sein. Für eine ausführliche Beschreibung der Abstimmung und eine Masse-Zytometrie Maschine ausgeführt wird,finden Sie im verwandten Manuskript 1. Kurz gesagt, wird eine Zellprobe mit einem Panel von Antikörpern , konjugiert Metallzielzelloberflächenmarker, cytoplasmatische Proteine, nukleäre Proteine, Chromatin-gebundene Proteine oder andere Epitope von Interesse (Figur 1i) markiert. Die markierten Zellen werden auf die Maschine geladen wird, entweder einen nach dem anderen durch manuelle Injektion oder mit Hilfe eines automatischen Probennehmer, dass die Proben von einer 96-Well-Platte. Die beladenen Zellen werden durch einen Zerstäuber injiziert wird , die einen Sprühnebel aus Flüssigkeitströpfchen erzeugt , um die Zellen einkapseln (Abbildung 1II). Dieses Spray wird so positioniert, dass die Zellen durch einen Argonplasmabrenner ionisiert werden. Diese Ionisierung erzeugt eine Partikelwolke aller konstituierenden Atome jeder Zelle (Abbildung 1III) umfasst. Da diese Partikelwolke zu dem Detektor bewegt werden geringe Atommassen Atome aus den Ionen mit hohen Masse durch einen Quadrupol-Massenfilter getrennt. Die verbleibenden Ionen mit hohen Masse weiter zu dem Detektor, wo der abundance jedes Isotop wird (Abbildung 1IV) quantifiziert. Die Rohdaten vom Detektor gesammelt werden, werden von den Massen Cytometry Gerätesoftware analysiert, um Zellereignisse zu identifizieren. Für jedes identifizierte Zelle Ereignis, das Signal in jedem Kanal detektiert wird quantifiziert und mit einem Ausgang .fcs Datei gespeichert. Die Massenkanäle verwendet für das Schwermetall konjugiert Nachweis von Antikörpern eine minimale spektrale Überlappung, die mit den meisten Beiträgen unter 1% von 0-4% liegt. Aufgrund dieses geringen Übersprechens zwischen den Kanälen, ist es in der Regel nicht erforderlich , die Daten mit einer Kompensationsmatrix vor der Analyse 2 zu transformieren. Allerdings sollte Sorgfalt bei der Gestaltung der experimenteller Gruppe von Antikörpern getroffen werden, um sicherzustellen, dass ein Antikörper mit einem Hochfluss-Epitop nicht zu einem Masse Kanal zugeordnet ist, das Signal an einen Kanal zu einem Low-Fülle-Antikörper, da dies zugewiesen trägt eine künstlich hohe Population in dem Kanal erzeugt den Signalbeitrag zu empfangen.

3, 4. Durchführen von Zelloberflächen - Antikörper - Färbung an lebenden Zellen kann für einige Antikörper erforderlich sein, aber dies schließt die Möglichkeit zur Antikörpermarkierung vor Strichkodierung da die meisten Strichcodes Verfahren nach der Fixierung durchgeführt werden , obwohl 5 Antikörper-basierte Strichkodierung 6, 7 ist eine Ausnahme.

Bei der Bestimmung der Anzahl von Zellen für die Analyse vorbereitet werden, ist es wichtig zu wissen, dass nur ein Bruchteil der auf die Maschine geladen Zellen werden die Daten erfasst werden und produzieren. Dieser Verlust ist hauptsächlich auf Ineffizienzen, wenn der Zerstäuber um die Probe bei der Fackel Sprays. Der genaue prozentuale Verlust hängt von der Masse Zytometrie Maschinenaufbau und Zelltyp, sondern kann von 50 bis 85% liegen und solltebetrachtet, wenn das Experiment zu entwerfen. Dieses Protokoll wurde für 2x10 6 Zellen pro Probe optimiert, kann aber für die Verarbeitung von kleineren oder größeren Probengrößen angepasst werden. Dieses Protokoll kann von 1 × 10 6 bis 4 x 10 6, mit minimalen Modifikationen für Probengrößen verwendet werden , aber es ist wichtig , dass Fallzahl innerhalb eines Versuchs konsistent gehalten werden. Änderungen in der Zellzahl können die Intensität von Barcodes und Antikörper-Färbung beeinflussen und sollte in etwa konsistent gehalten werden, über Proben direkt miteinander verglichen werden.

Einige Verfahren, wie tote Zellmarkierung und DNA-Markierung, sollen in der überwiegenden Mehrheit durchgeführt werden, wenn nicht alle experimentellen Designs. Die Kennzeichnung von toten Zellen in den Experimenten nur Oberflächenmarker Analyse kann mit Rh103 erreicht werden, aber Rh103 sollte für Experimente vermieden werden, in denen Permeabilisierung erforderlich ist, wie es in Färbung Verlust zur Folge hat. Für Experimente mit Permeabilisierung, ist es ratsam, Cisplatin zu nutzen

Strichkodierung Proben können Antikörper Verbrauch verringern Erfassungszeit reduzieren und eliminieren Probe zu Probe Variabilität 9. Der Prozess der Strichkodierung beinhaltet einen einzigartigen probenspezifischen Code für alle Zellen Anwendung, die verwendet wird, um jede Zelle in seine Ursprungsprobe zuzuordnen. Nachdem die Proben Strichkodierung kann vor der Antikörperfärbung gepoolt werden, ein Verfahren, dass alle Proben gefärbt werden gleichermaßen gewährleistet. Um experimentelle Fehler zu minimieren, ist es ratsam, auf Barcode und bündelt alle Proben, die direkt miteinander verglichen werden. Derzeit gibt es mehrere Methoden für Strichkodierung Proben für Massen Zytometrie Analyse 5, 6, 7, von denen zwei hier vorgestellt werden (siehe unten).

Mit derzeit erhältlichen reagents ist es möglich , die Fülle von 38 Antikörper Targets identifizieren Zellen in S-Phase 10, unterscheiden lebenden und toten Zellen und 8 messen zelluläre Niveaus von Hypoxie 11 in einem gemultiplexten Experiment mehrerer Proben zu quantifizieren. Diese Fähigkeit , hohe Parameter Einzelzellendaten für große Zellpopulationen zu sammeln , ermöglicht eine verbesserte Profilieren von sehr heterogenen Zellpopulationen und hat bereits eine Reihe von neuartigen biologischen Erkenntnissen 12, 13, 14, 15, 16 hergestellt. Destillieren der resultierenden komplexen Daten auf interpretierbare Informationen hat 18 die Verwendung von Computer - Algorithmen , einschließlich Spanning Tree Progression der Dichte Normalized Ereignisse (Pik) 17 und Visne erforderlich.

Dieser Artikel stellt eine leicht zugänglicheÜberblick darüber, wie zu entwerfen und eine Masse-Zytometrie Experiment durchzuführen und stellt grundlegende Analyse von Massendaten-Zytometrie.

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Protocol

1. Zellernte

  1. Ernten von Zellen von primärem Gewebe
    HINWEIS: Das Verfahren zum Ernten von Zellen aus Primärgeweben beschrieben ist spezifisch für Maus-Brusttumorgewebe und kann nicht anwendbar sein, wie an primäre Gewebe aus anderen Quellen ist.
    1. Bereiten Verdauungspuffer durch Auflösen von 5 mg Hyaluronidase und 30 mg Kollagenase in 10 ml DMEM / F12-Medium pro Gramm Gewebe verarbeitet werden. Filter Verdauungspuffer sterilisieren.
    2. Isolieren primären Brustdrüsentumor aus der Maus und aufzeichnen Tumorgewicht.
    3. Mince Gewebe mit # 10 Skalpell für mindestens 5 min.
    4. Hinzufügen zerkleinerte Gewebe zu geeigneten Volumen Verdauungspuffer (10 ml Puffer pro Gramm Gewebe).
    5. Schütteln zerkleinerte Gewebe in Verdauungspuffer bei 100 Umdrehungen pro Minute für 1-3 h bei 37 ° C.
    6. Erhalten Einzelzellsuspension von Zellen, die durch 0,4-um-Filter in ein 50 ml-Röhrchen übergeben.
    7. Centrifuge Zellen bei 300 · g für 10 min bei 4 & deg;; C. Dekantieren oder den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören.
    8. Resuspendieren des Pellets in 4 ml DMEM / F12 und Transfer in 5 ml Rundbodenrohr.
  2. Ernten von Zellen aus Gewebekultur
    1. Waschplatte oder Kolben von adhärenten Zellen, die mit Calcium und Magnesium-freier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Die Technik zum Ernten von Zellen beschrieben ist speziell anwendbar menschliche embryonale Stammzellen (hES) Kulturzellen haftend. Jedoch ist der Rest des beschriebenen Protokolls breit anwendbar auf andere gezüchteten Zelllinien, nicht adhärenten Linien und Primärzellen.
    2. Hinzufügen wärmten (37 ° C) Trypsin oder andere enzymatische Verdauung Reagens optimiert, um eine Einzelzellsuspension von den adhärenten Zellen zu erreichen. Folgen Protokoll des Herstellers.
      HINWEIS: Trypsin und andere enzymatische Dissoziation Reagenzien haben das Potenzial, zelluläre Marker zu beeinflussen.
    3. Inkubiere die Platte bei 37° C für 2-5 min Zellen abzulösen. Für hohe Konfluenz Kulturen, tippen Sie vorsichtig die Platte, um die Zellen zu lösen.
    4. Überträgt vollständig abgelösten Zellen von der Platte in ein 5-ml-Röhrchen mit runden Boden und sanft pipettieren eine 1-ml-Pipette unter Verwendung von Zellen zu dissoziieren.
      HINWEIS: Für die Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben alle Schritte können alternativ in einer 96-Well-Rundbodenplatte durchgeführt werden. Für die Verarbeitung von Proben in ein 96-Well-Format können alle Waschungen bei einem Volumen von 250 & mgr; l durchgeführt werden. Die Volumina in anderen Schritten beschrieben ist, kann eingestellt werden, um das Gesamtvolumen von 300 & mgr; l nicht übersteigt.
    5. Quenche das enzymatische Verdauung Reagens mit einem gleichen Volumen Waschpuffer (0,5% BSA und 0,02% Natriumazid in PBS).
      HINWEIS: Natriumazid eine gefährliche Chemikalie ist. Die richtige Sicherheitsvorkehrungen müssen zu seiner Herstellung und Handhabung zu beachten.
    6. Centrifuge Zellen bei 300 · g für 5 min bei 37 ° C. Dekantieren oder den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören.
    7. resuspendierenZellen in 1 ml serumfreiem Medium.
    8. Zählen von Zellen durch die Übertragung von 10 ul der Zellsuspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Verdünnte Aliquots auf ein bekanntes Verhältnis in Trypanblau und Übertragung auf einen Hämozytometer oder automatisierte Zellzählsystem.
  3. Kennzeichnung von S-Phasen - Bevölkerung
    HINWEIS: Wenn S-Phasen-Kennzeichnung ist nicht durchgeführt werden, gehen 1,4 einzudämmen.
    1. Bereiten 1 ml 10 & mgr; M 5-Iod-2'-desoxyuridin (IDU) in serumfreiem DMEM F12 oder anderen geeigneten Medien für je 2 x 10 6 Zellen analysiert werden.
    2. Gib 500 ul 10 uM IdU in serumfreiem Medium für je 2 x 10 6 Zellen.
      HINWEIS: Während IdU Markierung kann in Medien durchgeführt werden, das Serum enthält, wird freies Protein mit Cisplatin reagieren, korrekte Kennzeichnung von toten Zellen zu verhindern. Wenn Medien Serum, das während IdU verwendet wird Beschriftung ein zusätzlicher Waschschritt ist Serum freie Medien ist notwendig, Serumproteine ​​vor Cisplatin Live / Dead sta zu entfernenining.
    3. resuspendieren sanft Pellets mit 1-ml-Pipette.
    4. Inkubieren für 10 min bei 37 ° C unter leichtem Schütteln.
  4. Live / Dead Kennzeichnung
    1. Für jede Probe vorzubereiten 500 ul 50 uM Cisplatin in serumfreiem DMEM-F12 oder Zellart geeigneten Medien.
      HINWEIS: Wenn die Kennzeichnung der S-Phase Population von IdU nicht durchgeführt werden, Resuspendieren Proben bei einer Konzentration von 4 x 10 6 Zellen / ml. für einheitliche Live / Dead Kennzeichnung Resuspendieren der Zellen vor Cisplatin Zugabe schnelle Durchmischung von Lösungen ermöglicht.
    2. In 500 ul von 50 uM Cisplatin pro 2 × 10 6 Zellen zu den Proben.
    3. Inkubieren bei Raumtemperatur (RT) für 1 min auf einem Schüttler unter konstantem Mischen.
    4. Quenche die Cisplatin mit einem gleichen Volumen Waschpuffer.
    5. Centrifuge Zellen bei 300 g für 5 min bei RT. Dekantieren oder den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören.
    6. Wash Proben zweimalmit 500 & mgr; l Waschpuffer, um überschüssige Cisplatin zu entfernen.
    7. Waschproben zweimal mit 500 & mgr; l PBS überschüssigem Protein zu entfernen.
  5. Beispiel Fixierung
    1. Resuspendieren Probe in 500 & mgr; l PBS.
    2. Hinzufügen gleiche Volumen von 4% PFA in PBS auf eine Endkonzentration von 2%; Pipette zu mischen.
      HINWEIS: Herstellung von 4% PFA frisch aus Pulver, pH auf 6,9 einzustellen, und ein 0,44 um-Filter passieren. 4% PFA in PBS kann für bis zu zwei Wochen bei 4 ° C gelagert werden. Vermeiden premade Formalin in Ampullen geliefert, sofern nicht speziell geprüft, wie es oft Metallverunreinigungen enthält, die mit den gemessenen Massenkanälen stören können. Geringere Konzentration von PFA ausreichend sein und dazu beitragen, die Wirkung der Fixierung auf Antikörper zu minimieren Bindung sollte aber empirisch getestet werden.
    3. Inkubieren für 15 min bei RT auf einem Orbitalschüttler unter konstantem Mischen.
    4. Centrifuge Zellen bei 300 · g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren oder den Überstand vorsichtig absaugen without stören das Pellet.
    5. Waschproben mit PBS PFA-Lösung zu entfernen.
      HINWEIS: Bei diesem Schritt können Proben kurz bei 4 ° C gelagert werden. Längere Lagerung bei 4 ° C kann zu einer Verschlechterung der Probe zur Folge hat und eine verminderte Färbung.

2. Barcodierung

HINWEIS: Während Methodik monoisotopischen Cisplatin Barcodes und Palladium Barcodes für die Nutzung gleichzeitig präsentiert wird, entweder verwendet unabhängig ganz oder vermieden werden kann, wenn nicht durch das Experiment erforderlich.

  1. Monoisotopischen Cisplatin Barcodierung
    HINWEIS: Da Cisplatin Barcodes und Cisplatin Lebend- / Tot-Färbung beruhen auf den Kanälen Pflege überlappen sollten, dass Hintergrund Cisplatin Lebend- / Tot-Färbung in den lebenden Zellen, da dies minimiert wird sichergestellt werden, kann mit der Genauigkeit des Cisplatin Barcode stören.
    1. Verdünne 1 mM monoisotopischen Cisplatin Stammlösungen zu 200 & mgr; M in PBS.
    2. für eACH einzigartige Cisplatin Barcode ein 1,5 ml - Röhrchen mit 500 & mgr; l PBS für je 2 x 10 6 Zellen herzustellen , den Strichcode empfangen.
    3. Zur Vorbereitung jeder eindeutigen Barcode jeweils anwendbaren monoisotopischen Cisplatin zu einer Endkonzentration von 200 nM hinzuzufügen.
    4. Die Zellen in 500 ul PBS pro 2 x 10 6 Zellen.
    5. In jede Probe ein gleiches Volumen der entsprechenden Barcode-Lösung.
    6. Inkubieren Proben bei RT für 5 min auf einem Schüttler unter konstantem Mischen.
    7. Cisplatin mit einem gleichen Volumen an Waschpuffer quenchen.
    8. Centrifuge Zellen bei 300 · g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren oder den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören.
    9. Waschproben zweimal mit 500 & mgr; l Waschpuffer überschüssige Cisplatin zu entfernen.
  2. Palladium Barcodierung
    HINWEIS: Palladium Barcodierung Reagenzien können im Handel entweder bereit , 5 oder gekauft werden.
    1. Vorübergehende TeilPermeabilisierung 19
      HINWEIS: Palladium Chelat Strichkodierung Teil Permeabilisierung erfordert für die Reagenzien durch die Zellmembran passieren und robust die Zelle beschriften.
      1. Wasch Proben mit 500 & mgr; l PBS.
      2. Wasch Proben mit 500 & mgr; l PBS plus 0,02% Saponin.
      3. Pellet in Restvolumen.
    2. Bewerben Palladium Barcodes.
      1. Verdünnte 100X Stammlösung von Palladium Strichkodierung Reagenz in 1 ml eiskaltem PBS plus 0,02% Saponin.
      2. Schnell verdünnte Strichkodierung Reagenz zu resuspendierten Probe hinzuzufügen.
      3. Inkubieren für 15 min bei RT auf einem Orbitalschüttler bei unter konstantem Mischen.
      4. Wash Proben zweimal mit 500 & mgr; l Waschpuffer.

3. Zeiloberflächenfärbung

HINWEIS: Die Zelloberflächenfärbung kann an lebenden Zellen vor der Fixierung durchgeführt werden. Dies kann zum Nachweis von Antikörpern notwendig sein, die Affinität zu verlieren für their Epitop nach der Fixierung. Einige Zellproben können von zusätzlichen Sperr profitieren, wie Fc Blockierung für Leukozyten, vor der Antikörpermarkierung Hintergrund zu reduzieren. Optimale Blockierung sollte empirisch für bestimmten Probentyp bestimmt werden.

  1. Bereiten Zelloberflächenantikörperfärbung Tafel.
    1. Kombinieren 0,5 ul oder empirisch ermittelten Menge jeden 0,5 mg / ml Zelloberflächen-Antikörper pro Probe in ein 1,5 ml Röhrchen. In Puffer Waschen bei Bedarf Volumen pro Probe bis 10 & mgr; l zu bringen. Mischen durch Pipettieren.
      HINWEIS: Bestimmen Sie für jeden Antikörper vor dem Experiment empirisch durch Titrationsexperiment Arbeitsverdünnung.
    2. Split Zelloberflächenantikörperpool zu gleichen Teilen in ein 1,5-ml-Röhrchen für jede Probe zu gefärbt werden.
    3. Bereiten 500 ul Waschpuffer in einem 1,5 ml-Röhrchen für jede Probe.
  2. Anwenden Zelloberflächenfärbung zu Proben in normalisierten Volumen für alle Proben.
    HINWEIS: Um ensure konsequente Antikörpermarkierung über mehrere Proben ist es wichtig, das Probenvolumen und Antikörperkonzentration sorgfältig zu kontrollieren. Die folgenden Schritte zielen diese Konsistenz zu erreichen, indem sichergestellt wird, dass die endgültige Probenvolumina nach dem Antikörper einheitlich ist hinzugefügt worden.
    1. Centrifuge Zellen bei 300 · g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren oder den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören.
    2. Mit einer 200 & mgr; l-Pipette auf 50 & mgr; l, entfernen von Probepellet und in ein Rohr des aliquotiert Zelloberflächenantikörperpools verbleibenden Lösung.
    3. Pipette bis alle Flüssigkeit in dem Rohr Aliquot ohne Luft in die Pipettenspitze zu ziehen.
    4. Halten der Pipetten Plunger Luft zu vermeiden Ziehen der Spitze in eine vorbereitete Rohr von 500 ul Waschpuffer und bewegen den Kolben freizugeben.
    5. Fügen Sie den Inhalt der Pipettenspitze auf die Probe zurück und resuspendieren die Probe in der Flüssigkeit mit vorsichtigem Pipettieren.
    6. Inkubiere die Proben für 1h bei RT auf einem Orbitalschüttler unter konstantem Mischen.
    7. Wash Proben zweimal mit 500 & mgr; l Waschpuffer, um sicherzustellen, dass alle freien Antikörper weggewaschen wird.
    8. Wasch Proben mit 500 & mgr; l PBS.
    9. Resuspendieren des Zellpellets in 500 & mgr; l PBS.
    10. Hinzufügen gleiche Volumen von 4% PFA in PBS; Pipette zu mischen.
    11. Inkubieren für 10 Minuten auf einem Orbitalschüttler.

4. Zellpermeabilisierung und intrazelluläre Färbung

  1. Zellpermeabilisierung
    1. Centrifuge Zellen bei 300 · g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren oder den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören.
    2. Die Zellen in Restvolumen durch vorsichtiges Vortexen, bis das Pellet dissoziiert wird.
      HINWEIS: Failure Zellen dissoziieren vor Zugabe MeOH in Zellen führt aneinander haften und einen Dünnfilm erzeugen, die in Teilprobenverlust führen.
    3. Schnell in 1 ml 100% MeOH pro 2 x 10 6 </ Sup> Zellen und sanft Pipette zu mischen.
      Hinweis: andere Permeabilisierung Verfahren können für MeOH substituiert werden und kann erforderlich sein, eine optimale Permeabilisierung für einige Zelltypen zu erreichen. Für einige Zellquellen ein 0,1% Triton X-100, 0,2% Tween-20 oder 0,1% Saponin in PBS-Lösung für Permeabilisierung kann Zellintegrität besser halten, während immer noch konsistente Permeabilisierung bereitstellt.
    4. mindestens 1 h oder bis zu maximal 24 Stunden bei 4 ° C für Permeabilisierung inkubieren Proben.
      HINWEIS: Bei diesem Schritt Proben in Methanol können für bis zu 1 Monat bei -80 ° C gelagert werden.
    5. Centrifuge Zellen bei 300 · g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren oder den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören.
    6. 1 ml Waschpuffer für jeden ml MeOH verwendet, um die Probe permeabilisieren. resuspendieren sanft Zellpellet.
    7. Waschprobe zweimal mit 500 & mgr; l Puffer waschen.
  2. Bereiten intrazellulären Antikörperfärbung Tafel.
    1. Kombinieren 0,5 ul oder empirisch ermittelten Menge jedes 0,5 mg / ml intrazellulär Antikörper pro Probe in ein 1,5 ml Röhrchen. In Puffer Waschen bei Bedarf Volumen pro Probe bis 10 & mgr; l zu bringen. Mischen durch Pipettieren.
    2. Split intrazellulärem Antikörperpool zu gleichen Teilen in ein 1,5-ml-Röhrchen für jede Probe.
    3. Bereiten 500 ul Waschpuffer in einem 1,5 ml-Röhrchen für jede Probe.
  3. Tragen Sie die intrazelluläre Färbung an Proben in normalisierten Volumen für alle Proben.
    HINWEIS: Um eine konsistente Antikörpermarkierung über mehrere Proben sicherzustellen, ist es wichtig, das Probenvolumen und Antikörperkonzentration sorgfältig zu kontrollieren.
    1. Centrifuge Zellen bei 300 · g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren oder den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören.
    2. Mit 200 & mgr; l-Pipette auf 50 ul eingestellt Beseitigung der verbleibenden Lösung aus Probepellet und in ein Rohr des aliquotiert Zelloberflächenantikörperpools.
    3. Pipettebis die gesamte Flüssigkeit in dem Rohr Aliquot ohne Luft in die Pipettenspitze zu ziehen.
    4. Halten der Pipetten Plunger Luft zu vermeiden Ziehen der Spitze in eine vorbereitete Rohr von 500 ul Waschpuffer und bewegen den Kolben freizugeben, Waschpuffer für eine Gesamtprobenvolumen von 50 & mgr; l der Erstellung.
    5. Fügen Sie den Inhalt der Pipettenspitze auf die Probe zurück und resuspendieren die Probe in der Flüssigkeit mit vorsichtigem Pipettieren.
    6. Inkubiere die Proben für 1 Stunde bei RT auf einem Orbitalschüttler unter konstantem Mischen.
    7. Wash Proben zweimal mit 500 & mgr; l Waschpuffer.
    8. Wasch Proben mit 500 & mgr; l PBS.

5. Iridium Kennzeichnung

  1. Fix Proben
    1. Resuspendieren Proben in 500 ul PBS.
    2. In 500 & mgr; l von 4% PFA in PBS.
    3. Inkubieren Sie für mindestens 15 min bei RT auf einem Orbitalschüttler unter konstantem Mischen.
  2. Bewerben Iridium Markierung von DNA
    1. In 500 ul 62,5 nM Iridium PFA-Lösung zu den Proben.
      HINWEIS: Für Experimente permeabilisierten Zellen, verdünnt die 500x Ir191 / 193 Lager für eine endgültige Verdünnung von 1: 2.000 bis overstaining zu vermeiden.
    2. Inkubieren für 15 min bei RT auf einem Orbitalschüttler unter konstantem Mischen.
      HINWEIS: Wenn monoisotopischen Cisplatin Barcodes Durchführung brüten nicht Proben mit Iridium länger als 15 min, da starke Ir193 Signale an den Pt194 Massenkanal beitragen können und sich negativ auf die Qualität auswirken Barcodes.
    3. Centrifuge Zellen bei 300 · g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren oder den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören.
    4. Waschproben zweimal mit 500 & mgr; l 0,1% BSA in gefiltertem deionisiertem Wasser.
      HINWEIS: Wenn innerhalb von 24 h empfehlen wir die laufenden Proben hergestellt, wenn möglich. Vorbereitete Proben können kurzfristig bei 4 ° C gelagert werden,aber darauf zu achten, Abbau zu vermeiden. Wenn möglich, sollten die endgültigen Waschungen in gefiltertem deionisiertem Wasser ohne BSA durchgeführt werden, da dies die Ablagerung auf dem Sprühkammer und sampler Konen der Maschine zu verringern, die Instrumentenreinigung verringern. Für hESCs ist es notwendig, diese Waschungen durchzuführen, während einschließlich BSA Probenverlust vom Kleben an die Rohroberfläche zu vermeiden.

6. Bereiten Sie die Proben für Acquisition

  1. zählen von Zellen
    1. Die Zellen in 500 & mgr; l 0,1% BSA in gefiltertem deionisiertem Wasser und das Filter in ein frisches Röhrchen durch eine 35 & mgr; m Zellsieb Kappe.
      HINWEIS: Eine Senkung der BSA-Pegel für die endgültigen Waschungen verringert den Rückstand auf der Zytometrie Vernebler Masse verlassen. Nicht-adhärente Zellen können in gefiltertem deionisiertem Wasser gewaschen und wieder suspendiert werden.
    2. Zählen von Zellen durch die Übertragung von 10 ul der Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Verdünnte Aliquots auf ein bekanntes Verhältnis inTrypanblau (mit Zell Visualisierungen zu unterstützen) und in einem Hämozytometer oder automatisierte Zellzählsystem.
    3. Centrifuge Zellen bei 300 · g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren oder den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören.
  2. Vorbereiten und Lastproben
    1. Zur Herstellung von Kalibrierungsperlen aus dem Kühlschrank entfernen und kräftig schütteln, zu suspendieren.
    2. Wenn Proben laufen eine Masse Cytometry automatischen Probennehmer verwendet wird, werden 50 & mgr; l von Kalibrierungsperlen in jede Vertiefung der Probenplatte dann die gewünschte Anzahl von Zellen hinzuzufügen analysiert werden. Wenn Lauf Proben durch manuelle Injektion 50 & mgr; l Perlen der Kalibrierung hinzuzufügen abzutasten, verdünnte Probe in entionisiertem Wasser filtriert, gut mischen und Belastungsprobe in die Massen Cytometry Probeneinspritzöffnung. Die geeignete Probenverdünnung kann in Abhängigkeit vom Zelltyp abhängig analysiert werden, aber eine Verdünnung von 10 6 ist im Allgemeinen angemessen 1.

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Representative Results

Das Protokoll kann hier im Großen und Ganzen auf eine große Vielfalt von gezüchteten und primären Zellproben mit nur geringfügigen Modifikationen angewandt präsentiert werden. Je nach den Anforderungen des Experiments, kann es in einer modularen Art und Weise durchgeführt werden, wenn bestimmte Elemente, wie Barcodes oder Zelloberflächenfärbung, sind nicht erforderlich. Verwendetes in seiner Gesamtheit ermöglicht dieses Protokoll, um die Herstellung von Massen gemultiplexten Cytometry Proben für toten Zellausschluß gekennzeichnet, S-Phasen-Population Identifizierung und gefärbt für die Quantifizierung von bis zu 38 Antikörperzielen.

Erwartete Ergebnisse durch die in diesem Protokoll (Abbildung 2) skizzierte sind in Abbildung 3 dargestellt. Bei der Erfassung von Daten, die Intensität Normalisierung des Signals von der Kalibrierungs bead Intensität basierte, kann innerhalb der Masse-Zytometrie-Software durchgeführt werden. Folgende Normalisierung Anfangsdaten processing Kalibrierungsperlen, Tor auf einzelne Zellen zu entfernen, und tote Zellen zu entfernen, kann manuell jede Software der Durchflusszytometrie Analyse von Daten unter Verwendung der Lage durchgeführt werden. Entfernen von Kalibrierungsperlen kann durch Gating auf der 20 Ir191 + Ce140- Population (3A) oder mit einem MATLAB basierten Algorithmus manuell durchgeführt werden. Einzellige Ereignisse (schwarzer Umriss, 3B) können gated werden , während Schutt und Zell Multiplets entfernen, indem Sie auf dem zweiachsigen Grundstück von Ir193 und Event - Länge (3B) Gating. Cisplatin Kennzeichnung von abgestorbenen Zellen kann die Menge des Zelltods zu quantifizieren verwendet werden; sind Beispiele für Proben mit niedriger (3D) und höher (Abbildung 3E) Mengen an toten Zellen gezeigt. Tote Zellen können aus den Daten entfernt werden , indem der Pt198 + -Population (Abbildung 3E) Gating off. Strichcodierung von Mustern, ob mit monoisotopischen Cisplatin oder Palladium Reagents, führt zu deutlicher Trennung von samples innerhalb des Strichcodierung Parameters (3C), die zu ihrer ursprünglichen Probenidentität zugewiesen Zellen ermöglicht. Zusätzliche optionale Verfahren, wie IdU Etikettieren, erlauben den Nachweis spezifischer Populationen, beispielsweise S-Phasen - Zellen (Abbildung 3F). Nach erstmaligem Normalisierung debarcoding und Gating, können die hohe Dimensionsdaten analysiert werden , um eine Vielzahl von Algorithmen verwendet SPADE einschließlich 17 und mehrere Massen ausgelegt andere für Cytometry Datenanalyse und Visualisierung 18. Algorithmen wie SPADE nimmt die hohe Dimensionsdaten, die schwierig zu interpretieren , da sie nicht direkt in ihrem hohen Dimensions Zustand sichtbar gemacht werden können, und eine untere dimensionale Darstellung der Daten erzeugen, die empfänglichen für visuelle Interpretation (Figur 3G) ist.

Abbildung 1 Abbildung 1: Grundlagen der Massen Zytometrie Messung. Herstellung von Zellproben für die Massen-Zytometrie Analyse beinhaltet färbenden Zellen mit markierten Antikörpern mit Metallisotopen meist aus der Lanthaniden-Reihe der Elemente. In diesem Schema jeweils gegen ein bestimmtes Epitop angehobenen Antikörper mit einem Isotop besitzt eine einzigartige Atommasse, wie Samarium 154. Antikörper gegen Epitope, die markierte Oberfläche sind, zytoplasmatische, nuklear oder lokalisierte Chromatin potentiell verwendet werden kann. Markierte Zellen injiziert werden und durch die Massen-Zytometrie Vernebler als Einzelzelltröpfchen versprüht, wo sie von einem Argon-Plasmabrenner ionisiert werden. Die sich ergebende Partikelwolke wird durch einen Quadrupol-Massenfilter geringer Masse Atome abgestreift, während die Häufigkeit von größeren Atommassenionen durch den Detektor gemessen werden. Die gemessene Menge jeder einzigartigen Massenion entspricht den Zellfluss seines zugehörigen Antikörpers Zielepitop. Während ein theoretischer limit von mehr als 100 Parameter quantifiziert werden konnte diese Methodik verwendet wird, die derzeit im Handel erhältlichen Reagenzien ermöglichen Nachweis von mehr als 40 Parameter pro Zelle. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Workflow Diagramm experimentelle Verfahren und optionale Schritte. Darstellung der wichtigsten Schritte in dem Protokoll beteiligten Zellen für die Massen Zytometrie vorbereitet. Optionale Schritte werden von Orange Boxen angezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: Beispiel Daten von m ass Zytometrie Analyse erzeugt. (A) Biaxial Diagramm , das die Trennung von Zellen (hohe Ir191, niedrige Ce140), Perlen (low Ir191, hohe Ce140) und sicken Zelle Dubletts (high Ir191, hohe Ce140). (B) Biaxial Diagramm , erwartete Auftritt von Ir193 vs Ereignislänge. Gating von einzelnen Zellen, die Zelltrümmer und Zell Multiplets entfernt gezeigt. (C) Biaxial Diagramm , Beispiel Ansicht von zwei Massenkanäle von Cisplatin Strichcodes. (D - E) Beispiel Daten von Cisplatin Lebend- / Tot - Färbung für Proben mit einem geringen Anteil (D) und ein hohen Prozentsatz (E) von abgestorbenen Zellen. (F) Biaxial Stück von H9 HES mit IdU markierten Zellen Zellen in S-Phase und ein Antikörper gegen das Cyclin - B1 unterscheiden zu weiteren Zellzyklus zu unterscheiden. (G Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Das Protokoll hier vorgestellten wurde für die Verarbeitung von verschiedenen kultivierten Zelllinien (H1 und H9 hESCs, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) und primäre Gewebeproben (Maus-Knochenmark, embryonale Maus-Leber, Maus Erwachsenen erfolgreich eingesetzt Leber, die Maus-Tumor). Unabhängig von der Quelle, jedes Gewebe, das in einzelne Zellen dissoziiert werden kann, während der zelluläre Zustand bewahren sollte Zytometrie zur Analyse von Massen zugänglich sein, sondern kann eine Protokolloptimierung erfordern. Es ist wichtig zu beachten, dass einige Epitope durch die spezifische Dissoziation, Fixierung und Permeabilisierung Behandlungen verwendet und diese Verfahren müssen möglicherweise betroffen sein können probenspezifische Optimierung zu unterziehen. Wenn Low-Signal für einen Antikörper beobachtet wird, kann es möglich sein, indem Zelloberflächenmarkierung an lebenden Zellen zu verbessern, zu ändern Permeabilisierung Methoden oder Fixierungszeit abnehmen.

Wenn möglich, innerhalb des experimentellen Designs, einschließlich Barcodes in the Probenverarbeitungsablauf gewährleistet, auf der Ebene der Zelle und die Antikörperkonzentration zwischen Proben Konsistenz. Ohne Barcodes, auch wenn große Sorgfalt Probenverarbeitung zu steuern, ist es wahrscheinlich, dass geringfügige Schwankungen der Antikörperkonzentration und Zellkonzentration wird zwischen den Proben eingebracht werden. Ferner ist, wie die Prozentsätze der Zellen, die positiv für spezifische Epitope wahrscheinlich zwischen den Proben, die effektive Antikörper-to-Epitop-Verhältnis kann notwendigerweise unterscheiden zwischen den Proben variieren, selbst wenn die Gesamtantikörperkonzentration konsistent gehalten wird, was möglicherweise zu Inkonsistenzen in Antikörperfärbung führt. Diese Variationen, während in der Regel kleinere, wenn ein einzelner Kanal beobachten, setzen können erheblich verschärft, wenn ein Hoch Parameter Experiment durchführen und können als biologisch sinnvoll falsch interpretiert werden, wenn Sorgfalt bei der Datenanalyse nicht genommen wird.

Die Analyse der erhaltenen Daten aus einem Massen Zytometrie Experiment kann viele Formen annehmen, und eine Reihe von computalen Ansätze wurden speziell für diese Anwendung angepasst. Während eine erschöpfende Übersicht über nützliche Algorithmen für die Massen Zytometrie Datenanalyse bietet den Rahmen dieses Manuskripts ist, Ansätze , die erfolgreich verwendet wurden , werden hervorgehoben und interessierte Leser auf mehrere Ressourcen gerichtet decken dieses Thema 21, 22, 23. Zwei der am häufigsten verwendete, derzeit verfügbaren Ansätze zur Analyse von Massen Zytometrie Daten Spanning Tree Progression der Dichte normalisieren Ereignisse (Pik) und Visne. SPADE bildet Cluster von Gruppen von Zellen mit ähnlicher Marker-Expression und stellt jeden Cluster als einen Knoten. Diese Knoten werden in einen SPADE Baum angeordnet , wo ähnliche Knoten , die durch eine Linie verbunden sind (Figur 3G). Visne nutzt die t-Distributed Stochastic Neighbour 24 Embedding Algorithmus eine zweidimensionale Darstellung zu erzeugen ,die hohe Dimensionsdaten unter Beibehaltung der Gesamt-Datenstruktur. Sowohl SPADE und Visne in MATLAB geschrieben werden, ist der Quellcode frei verfügbar und kann von Benutzern mit MATLAB ausgeführt werden. Darüber hinaus ist eine Standalone-Version von SPADE zur Verfügung.

Während Massen Zytometrie derzeit Sammlung der höchsten Anzahl von Parametern erlaubt, kann fluoreszierende Markierung basierte Zytometrie ein besserer Ansatz für einige Anwendungen sein. Fluorescence Durchflusszytometrie kann mehr Zellen pro Sekunde analysieren, bis zu 5 x 10 4 gegenüber 500-1000 für die Massen Zytometrie und verfügbareren validierten Antikörper 25 hat. Weitere Fortschritte in der Fluoreszenz - Durchflusszytometrie, wie hyperspektralen Zytometrie 26 und neue Fluorophore 27 make Fluoreszenz Durchflusszytometrie eine brauchbare Alternative für alle , aber sehr hohe Parameter Experimente. Zusätzliche Techniken , wie die Messung von RNA 28 bisher nur möglich ,durch fluoreszenzbasierte Fluss wurden Cytometry kürzlich Masse angepasst Cytometry ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis von Protein und RNA 29. Zukünftige Erweiterung der verfügbaren Isotope und Reagenzien, um mehr vollständig die Massenfenster messbarer Isotope zu nutzen und das Repertoire von messbaren zellulären Eigenschaften erweitern die Tiefe der Profilerstellung möglich Massen Zytometrie erweitern.

Die große Anzahl von Parametern, die gleichzeitig von Massen Zytometrie analysiert werden können, erheblich erweitert die experimentellen Fragen, die untersucht werden können. Wir hoffen, dass dieser Artikel und begleitendes Video-Protokoll interessierte Forschern ermöglichen, effektive Masse Zytometrie zu nutzen, um ihre Forschung zu fördern.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
mTeSR1 medium kit Stem Cell technologies 05850 Warm at room temperature before use
DMEM F-12 ThermoFisher 11330-032 Warm at 37 °C before use
Accutase Stem Cell technologies 07920 Warm at 37 °C before use
Bovine serum albumin Equitech BAH62
phosphate buffered saline Hyclone SH30256.01
Saponin Sigma-Aldrich 47036
Cell ID Pt194 Fluidigm Provided at 1 mM
Cell ID Pt195 Fluidigm Provided at 1 mM
Cell ID Pt196 Fluidigm Provided at 1 mM
Cisplatin Enzo Life Sciences ALX-400-040-M250 Soluble to 25 mg/mL in DMSO
Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit Fluidigm 201060
5-Iodo-2'-deoxyuridine Sigma-Aldrich I7125 Soluble to 74 mg/mL in 0.2 N NaOH
Rhodium 103 intercelating agent Fluidigm 201103A
Methanol Fisher BP1105-4 Chill at -20 °C before use
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002
5 mL round bottom tubes Falcon 352058
5 mL 35 μm filter cap tubes Falcon 352235
EQ four element calibration beads Fluidigm 201078
Hyaluronidase Type I-S Sigma-Aldrich H3506
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C9891
Disposable Scalpel #10 Sigma-Aldrich Z69239

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References

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Cellular Biology Ausgabe 122 Mass-Zytometrie einzelne Zelle Barcodes Multiplexing multiparametrischer
Probenvorbereitung für die Massen Cytometry-Analyse
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McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. J. Vis. Exp. (122), e54394, doi:10.3791/54394 (2017).

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