Abstract
질량은 세포 계측법 중금속 라벨, 잘 세포 계측법 기존의 형광 기반의 흐름을 가능한 것 이상으로 매개 변수와 깊은 분석을위한 기회의 수를 크게 증가하고있다 접근 방식으로 결합하는 항체를 사용합니다. 새로운 기술로서, 고품질 데이터의 안정적인 발전을 보장 중요한 단계가 있습니다. 질량 계측법 분석 세포 샘플의 처리를 위해 다수의 기술을 통합 최적화 프로토콜은 여기에 제시 하였다. 여기에 설명 된 방법은 사용자가 일반적인 실수를 방지하고 데이터의 부정확성을 초래할 수 변동을 최소화함으로써 일관된 결과를 달성 할 수 있도록한다. 실험 설계를 알리려면, 프로토콜 및 조사되고 시스템의 생물학의 새로운 연구 결과를 폭로에서의 효능에 옵션 또는 대체 단계 뒤에있는 근거가 덮여있다. 마지막으로, 대표 데이터는 기법 presente 예상 결과를 설명하기 위해 제시여기 거라고.
Introduction
세포 계측법은 세포의 큰 개체군에 걸쳐 단일 세포 수준에서 여러 항체 표적의 동시 측정을 가능하게한다. 전통적인 형광 계 유동 세포 계측법으로 정량화 될 수있는 매개 변수의 수는 파라미터의 수가 증가함에 따라 점점 더 복잡한 보정 계산을 필요로 여러 형광체의 발광 스펙트럼과 스펙트럼 오버랩에 의해 제한된다. 이러한 제한은 중금속 복합 항체가 검출 크게 동시에 수집 매개 변수의 수를 확장하고 각 셀의 고차원 단백질 풍부 프로파일을 수득 비행 (TOF) 질량 분석 시간 정량화 질량 계측법에 의해 다루어진다.
악기 세포 계측법 질량의 동작의 기본적인 이해는 사용자에게 유용 및 문제 해결에 필수적인 수 있습니다. 보다 철저한 튜닝의 설명과 대량 세포 계측법 기계를 실행하는 경우,관련 원고 1 참조. 간략하게, 세포 시료를 세포 표면 마커, 세포질 단백질, 핵 단백질, 염색질 - 결합 단백질 또는이자 (도 1I)의 다른 에피토프를 표적 금속 복합 항체의 패널로 라벨링된다. 표지 된 세포는 오토 샘플러를 사용하여 컴퓨터 상에 로딩이든 수동 주입하여 한 번에 하나되는 96- 웰 플레이트의 샘플. 로드 셀은 셀 (도 1II)를 봉입 액 적의 분무를 생성하는 분무기를 통해 주입된다. 세포를 아르곤 플라즈마 토치에 의해 이온화되도록이 스프레이가 배치된다. 이 이온화 각각의 셀 (도 1iii)의 모든 구성 원자 이루어진 입자 구름을 생성한다. 이 입자 구름 검출기로 이동함에 따라, 낮은 원자 질량 원자 사중 극 질량 필터에 의해 고 이온 질량 분리된다. 나머지 높은 질량 이온 검출기의 abund 계속각각의 동위 원소는 ANCE (도 1iv)를 정량화 하였다. 검출기에 의해 수집 된 원시 데이터는 세포 이벤트를 식별하기 위해 대량 세포 계측법 악기 소프트웨어에 의해 분석된다. 각각의 식별 된 셀의 경우, 각 채널에서 검출 된 신호는 수치화되어 출력 .fcs 파일에 저장. 중금속 접합 된 항체를 검출하기 위해 사용 된 질량 채널은 1 % 이하로 가장 기여 0-4 %의 범위를 최소한의 스펙트럼 중첩을 나타낸다. 이 때문에 채널 간의 낮은 누화, 분석 전에 2 보상 매트릭스로 데이터를 변환하는 것은 일반적으로 불필요하다. 그러나, 의료이 있으므로, 높은 풍부한 항원과 항체는 미량 항체에 할당 된 채널의 신호 기여 질량 채널에 할당되지 않는 것을 보장하는 항체의 실험 패널의 설계시주의해야 신호 기여를 수신하는 상기 채널에서의 인공 높은 인구를 생성한다.
3,4- 얼룩 발생하는 것으로 알려져 일부 고정 세포 표면 항체 적절한 착색을 방지 할 수있다. 생균의 세포 표면 항체 염색을 수행하면 어떤 항체 필요할 수 있지만,이 항체 기반 바코드 6,7 예외이지만 대부분 바코드 방법은 고정 5 이후에 수행되는 항체 라벨링 전에 바코드의 옵션을 배제 할 수있다.
세포의 수를 결정하는 분석을 위해 준비 될 때, 컴퓨터에로드 셀의 일부만이 탐지된다는 것을 알고있는 데이터를 생성하는 것이 중요하다. 분무기 토치에서 시료를 분무 할 때의 손실은 효율성에 주로 기인한다. 정확한 퍼센트의 손실은 50~85%에 이르기까지 다양 기계 설치 및 세포 유형하지만 세포 계측법 질량에 의존하고 있어야한다실험을 설계 할 때 고려했다. 이 프로토콜은 샘플 당 2 × 106 세포에 최적화되어 있지만, 크거나 작은 샘플 크기를 처리하도록 구성 될 수있다. 이 프로토콜은 그러나 샘플 크기는 실험 내의 일관성 유지하는 것이 중요하고, 4 × 106 1 × 106에서 샘플의 크기에 대한 최소한의 변경으로 사용될 수있다. 세포 수의 변화는 바코드 및 항체 염색의 강도에 영향을 미칠 수있는 샘플을 직접 비교할 수 걸쳐 대략 일치 유지되어야한다.
모든 실험 설계되지 않은 경우 등의 죽은 세포 라벨 및 DNA 라벨과 같은 일부 절차는, 대부분에서 수행되어야한다. 오직 표면 마커 분석 실험 사균의 라벨링 Rh103를 사용하여 달성 될 수 있지만, Rh103는 염색의 손실 결과로서 permeabilization이 필요한 실험 피해야한다. permeabilization을 포함하는 실험의 경우, 시스플라틴 (cisplatin)을 사용하는 것이 좋습니다 바코드 샘플은 항체 소비를 줄이기 획득 시간을 감소 및 제거 할 수있는 샘플 간 가변성 9. 바코드의 과정은 기원의 샘플로 각 셀을 할당하는 데 사용되는 모든 세포에 고유 한 예제 특정 코드를 적용하는 것을 포함한다. 샘플 바코드 항체 염색 후, 모든 샘플이 동일하게 보장 염색 처리 전에 풀링 될 수있다. 실험 오차를 최소화하기 위해서는 바코드에 신중하고 서로 직접 비교할 수있는 모든 샘플을 풀. 현재 (아래 참조) 여기서 제시되는 두 분석 5, 6, 7, 계측법 질량에 대한 샘플 바코드위한 여러 방법이 존재한다. 현재 reagen로38 개 항체 타겟 풍부 정량화 S 상 (10)에서 셀을 식별 라이브 사균 8 구별 복수 샘플들의 다중화 실험 저산소증 (11)의 세포 농도를 측정 할 수있다 화면 반전. 대형 세포 집단 높은 파라미터 단일 셀 데이터를 수집하는 능력은 매우 이종 세포 집단의 개선을 가능 프로파일 이미 신규 생물학적 통계 12, 13, 14, 15, 16의 숫자를 제작했다. 해석 가능한 정보로 생성 된 복소 데이터를 증류시켜 스패닝 트리 밀도 정규화 행사 진행 (SPADE) 17 및 18을 포함 viSNE 계산 알고리즘의 사용을 요구했다. 이 문서에 액세스를 제공합니다방법의 개요는 설계 및 실험 세포 계측법 질량을 수행하고 데이터 세포 계측법 대량의 기본적인 분석을 소개합니다.
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Protocol
1. 세포 수확
- 주요 조직에서 수확 세포
참고 : 주요 조직에서 채취 세포에 대해 설명하는 과정은 마우스 유방 종양 조직에 구체적으로 적용되며 다른 소스의 주요 조직에 그대로 적용되지 않을 수 있습니다.- 5 mg을 히알루 조직의 그램 당 10 ㎖의 DMEM / F12 배지에서 30 mg을 용해시킴으로써 콜라게나 제를 분해 완충액을 준비하는 처리한다. 소화 버퍼를 소독 필터.
- 마우스와 기록 종양 무게에서 주요 유선 종양을 분리합니다.
- 적어도 5 분 동안 # 10 메스와 조직을 말하다.
- 분해 완충액 (조직의 그램 당 10 ㎖의 완충액)의 적절한 부피 다진 조직을 추가한다.
- 37 ℃에서 1-3 시간 동안 100 rpm으로 소화 버퍼 다진 조직을 흔들어.
- 50 ㎖의 튜브에 0.4 ㎛의 필터를 통해 세포를 통과시켜 단일 세포 현탁액을 얻는.
- 39 °에서 10 분 동안 원심 분리기 (300) XG 세포;기음. 가만히 따르다거나 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음.
- 재현 탁의 4 mL의 DMEM / F12에서 펠릿 5 ㎖ 둥근 바닥 튜브에 전달.
- 조직 배양에서 수확 세포
- 워시 플레이트를 실온에서 칼슘 및 마그네슘없는 인산염 완충 식염수 (PBS)와 부착 세포의 플라스크.
참고 : 수확 세포에 대한 설명이 기술은 인간 배아 줄기 세포 (hESC의) 배양 세포를 부착하기 위해 특별히 적용 할 수있다. 그러나, 설명 된 프로토콜의 나머지 부분은 다른 배양 세포주의 비 - 부착 선 및 일차 전지에 광범위하게 적용될 수있다. - 부착 성 세포의 단일 세포 현탁액을 달성하기위한 최적의 가온 (37 ° C) 또는 다른 트립신 소화 효소 시약을 추가한다. 제조 업체의 프로토콜을 따르십시오.
참고 : 트립신 및 기타 효소 해리 시약은 세포 마커에 영향을 미칠 수 있습니다. - 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션2-5 분 세포를 분리하기 위해 C를 °. 높은 자랄 문화를 들면, 부드럽게 세포를 분리하는 데 도움이 판을 누릅니다.
- 5 mL의 둥근 바닥 튜브에 플레이트로부터 완전히 분리 된 세포를 부드럽게 이동 세포를 해리하는 1 mL를 피펫을 이용하여 피펫.
주 : 모든 단계는 대안 적으로 96 웰 둥근 바닥 플레이트에서 수행 될 수있는 다수의 샘플을 처리. 96 웰 형식으로 시료를 처리하기위한 모든 세척은 250 μL의 부피에서 수행 될 수있다. 총 부피 300 μL를 초과하지 않도록, 다른 단계들에서 설명 된 볼륨이 조절 될 수있다. - (PBS에 0.5 % BSA 및 0.02 %의 아 지드 화 나트륨), 같은 부피의 세척 완충액으로 소화 효소 시약을 켄칭.
참고 : 아 지드 화 나트륨이 유해 화학 물질이다. 적절한 안전 조치는 준비와 처리를 위해 준수해야합니다. - 37 ° C에서 5 분 동안 원심 분리기 (300) XG 세포. 가만히 따르다거나 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음.
- 재현 탁1 개 ㎖의 혈청이없는 배지에서 세포.
- 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 세포 현탁액 10 μL를 전사함으로써 세포를 카운트. 트립 판 블루 및 혈구로 전송 또는 자동 셀 카운팅 시스템에서 공지 된 비율로 분취 액을 희석.
- 워시 플레이트를 실온에서 칼슘 및 마그네슘없는 인산염 완충 식염수 (PBS)와 부착 세포의 플라스크.
- S 상 인구의 라벨링
참고 : S 상 표시가되지 수행되는 1.4 줄기로 진행합니다.- 각각의 2 × 106 세포를 분석하는 무 혈청 DMEM F12의 또는 다른 적절한 매체를 10 μM 5- 요오도 -2'- 데 옥시 우리 딘의 1 ㎖ (IDU)을 준비한다.
- 각 2 × 10 6 세포에 대한 혈청이없는 배지에서 10 μM IDU의 500 μL를 추가합니다.
참고 : IDU 라벨 혈청을 포함하는 배지에서 수행 할 수 있지만, 무료 단백질이 죽은 세포의 적절한 라벨을 방지, 시스플라틴 (cisplatin)과 반응. 혈청을 포함하는 미디어 라벨 IDU 동안 사용하는 경우 추가 세척 단계는 혈청이없는 배지는 시스플라틴 라이브 / 죽은 역 전에 혈청 단백질을 제거 할 필요가있다ining. - 1 mL를 조심스럽게 피펫으로 펠렛을 재현 탁.
- 부드럽게 흔들 37 ° C에서 10 분 동안 인큐베이션.
- 라이브 / 죽은 라벨
- 각 샘플에 대해 무 혈청 DMEM-F12 또는 세포 유형에 적절한 미디어 50 μM 시스플라틴 500 μL를 준비한다.
주 : IDU으로 S 상 인구의 표시가 아닌 수행 될 경우, 4 × 106 세포 / ㎖의 농도로 재현 탁 샘플. 시스플라틴을 추가하는 것은 균일 한 라이브 / 죽은 라벨링 솔루션의 빠른 혼합을 가능하게하기 전에 세포를 재현 탁. - 시료에 2 × 106 세포 당 50 μM 시스플라틴 500 μL를 추가한다.
- 일정한 믹싱 오비탈 진탕 기에서 1 분 동안 실온 (RT)에서 인큐베이션.
- 세척 완충액 동량 시스플라틴 담금질.
- RT에서 5 분 동안 원심 분리기 (300) XG 세포. 가만히 따르다거나 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음.
- 두 번 세척 샘플500 μL 세척 완충액으로 과량의 시스플라틴을 제거한다.
- 두 번 500 μL PBS로 세척 샘플은 과잉 단백질을 제거합니다.
- 각 샘플에 대해 무 혈청 DMEM-F12 또는 세포 유형에 적절한 미디어 50 μM 시스플라틴 500 μL를 준비한다.
- 샘플 고정
- 500 μL PBS에 재현 탁 샘플.
- 2 %의 최종 농도를 위해 PBS로 4 % PFA 동량 추가; 피펫 믹스합니다.
주 : 6.9의 pH를 조절하고, 0.44 ㎛의 필터를 통과 분말을 4 % PFA 신선하게 준비한다. PBS 4 % PFA는 최대 2 주 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다. 종종 질량 측정 채널을 방해 할 수있는 금속 오염 물질을 포함로서, 구체적 않는 테스트 앰풀에 제공된 사전 제작 포르말린을 피한다. PFA의 저농도로 충분하고 결합 항체에 고정시키는 효과를 최소화 할 수 있지만, 실험적으로 테스트되어야 할 수있다. - 혼합하면서 일정한 오비탈 진탕 기에서 실온에서 15 분 동안 인큐베이션.
- 4 ℃에서 5 분 동안 원심 분리기 (300) XG 세포. 가만히 따르다거나 조심스럽게 뜨는 위스콘신 대기음보없이이 펠렛을 방해.
- PBS로 세척 샘플 PFA 솔루션을 제거합니다.
참고 :이 단계에서 샘플은 4 ℃에서 간단히 저장할 수 있습니다. 39 ° C에서 장기간 보관 시료의 열화 발생 및 염색을 감소 할 수있다.
2. 바코드
참고 : 모노 이소 시스플라틴 바코드 및 팔라듐 바코드를 이용하기위한 방법을 동시에 제시하면서, 하나가 독립적으로 사용할 수 있습니다 또는 실험에 의해 필요하지 않은 경우 완전히 피했다.
- 모노 이소 시스플라틴 바코드
참고 : 라이브 / 죽은 얼룩 채널 관리를 중복에 의존 시스플라틴 바코드 및 시스플라틴은 살아있는 세포에서 그 배경 시스플라틴 라이브 / 죽은 얼룩을 보장하기 위해주의해야하기 때문에 시스플라틴 바코드의 정확성을 방해 할 수있는이 최소화된다.- PBS에서 200 μM에 1 mM의 모노 이소 시스플라틴 원액을 희석.
- 전자의 경우ACH 고유 시스플라틴 바코드는 바코드를 수신하는 각각의 2 × 106 세포에 500 ㎕의 PBS로 1.5 ㎖의 튜브를 준비한다.
- 각각의 고유 바코드가 200 nm의 최종 농도로 각각 적용 모노 이소 시스플라틴을 추가 할 준비를합니다.
- 2 × 106 세포 당 PBS 500 μL에 재현 탁 세포.
- 각 샘플에 상응하는 바코드 용액 동량을 추가한다.
- 일정한 믹싱 오비탈 진탕 기에서 5 분 동안 실온에서 샘플을 인큐베이션.
- 세척 완충액 동량 시스플라틴 담금질.
- 4 ℃에서 5 분 동안 원심 분리기 (300) XG 세포. 가만히 따르다거나 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음.
- 배 500 μL 세척 버퍼 워시 샘플 초과 시스플라틴 (cisplatin)를 제거합니다.
- 팔라듐 바코드
참고 : 팔라듐 바코드 시약 중 하나 준비 5 또는 상업적으로 구입할 수 있습니다.- 부분 과도permeabilization (19)
주 : 시약은 세포막을 통과하고 견고 셀 라벨하는 팔라듐 킬레이트 바코드 부분 permeabilization이 필요하다.- 500 μL PBS로 세척 샘플.
- 500 μL PBS 플러스 0.02 % 사포닌과 워시 샘플.
- 잔류 부피를 Resuspend 펠릿.
- 팔라듐 바코드를 적용합니다.
- 1 ㎖의 얼음 - 냉각 된 PBS 더하기 0.02 % 사포닌 팔라듐 바코드 시약 100X 스톡을 희석.
- 신속 재현 탁 샘플 희석 바코드 시약을 추가한다.
- 일정한 믹싱에서 오비탈 쉐이커상에서 RT에서 15 분 동안 인큐베이션.
- 워시 샘플을 500 μL로 두 번 세척 완충액.
- 부분 과도permeabilization (19)
3. 세포 표면 얼룩
참고 : 세포 표면 염색 전에 고정에 살아있는 세포에서 수행 할 수 있습니다. 이 파묻혀에 대한 친화력을 잃게 항체 필요할 수 있습니다고정 후 R 에피토프. 일부 세포 샘플은 배경을 줄이기 위해 이전에 항체 라벨에 백혈구에의 Fc 차단으로 추가 차단 혜택을 누릴 수 있습니다. 최적의 차단은 경험적으로 특정 샘플 유형에 대한 결정되어야한다.
- 세포 표면 항체 염색 패널을 준비한다.
- 1.5 ㎖의 튜브에 샘플 당 각각 0.5 ㎎ / ㎖ 세포 표면 항체의 0.5 μL, 또는 경험적으로 결정된 양을 겸용. 샘플 당 10 μL에 볼륨을 가지고 필요한 경우 세척 버퍼를 추가합니다. 피펫으로 섞는다.
참고 : 적정 실험에 의해 경험적으로 실험하기 전에 각 항체 희석 작업을 결정합니다. - 마찬가지로 각 샘플에 대해 하나 개를 1.5 ml의 튜브로 나누어 세포 표면 항체의 풀을 염색한다.
- 각 샘플 1.5 ㎖의 튜브에 세척 완충액 500 μL를 준비한다.
- 1.5 ㎖의 튜브에 샘플 당 각각 0.5 ㎎ / ㎖ 세포 표면 항체의 0.5 μL, 또는 경험적으로 결정된 양을 겸용. 샘플 당 10 μL에 볼륨을 가지고 필요한 경우 세척 버퍼를 추가합니다. 피펫으로 섞는다.
- 모든 샘플에 대한 정규화 된 양의 샘플을 세포 표면 염색을 적용한다.
참고 : ENS으로여러 샘플에서 우레 일치 항체 라벨은 신중 샘플 볼륨 및 항체 농도를 제어하는 것이 중요합니다. 다음 단계에서는, 항체를 첨가 한 후, 최종 샘플 볼륨이 균일하도록 보장하여 일관성을 유지하는 것을 목표로.- 4 ℃에서 5 분 동안 원심 분리기 (300) XG 세포. 가만히 따르다거나 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음.
- 50 μL에 200 μL 피펫 세트의 분취 세포 표면 항체의 풀 튜브에 시료 펠릿 양도 잔류 용액을 제거한다.
- 피펫 팁으로 공기를 흡입없이 표본 튜브의 모든 액체를 피펫.
- 피펫 플런저를 유지하는 드로잉 방지하면서 공기가 버퍼와 플런저를 공개 워시 500 μL를 튜브로 제조 된 선단을 이동.
- 샘플에 피펫 팁의 내용을 다시 추가하고 부드러운 피펫과 액체의 샘플을 재현 탁.
- 1에 대한 샘플을 품어일정한 믹싱 오비탈 쉐이커상에서 RT에서 H.
- 500 μL 회 세척 완충액으로 세척 샘플은 모든 자유 항체 씻겨되도록.
- 500 μL PBS로 세척 샘플.
- 500 μL PBS에있는 세포 펠렛을 resuspend.
- PBS에서 4 % PFA의 동일한 볼륨을 추가; 피펫 믹스합니다.
- 오비탈 진탕 기에서 10 분 동안 인큐베이션.
4. 셀 Permeabilization 및 세포 내 염색
- 셀 permeabilization
- 4 ℃에서 5 분 동안 원심 분리기 (300) XG 세포. 가만히 따르다거나 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음.
- 펠릿 해리 될 때까지 가볍게 볼 텍싱에 의해 잔류 부피의 세포를 재현 탁.
주 : 메탄올이 함께 부착 된 세포에서 발생한다 첨가 불완전한 샘플 손실 될 박막을 제조하기 전에 세포를 해리 장애. - 즉시 1 mL를 2 × 106 개 당 100 %의 MeOH 추가 </ SUP> 세포와 섞어 부드럽게 피펫.
주의 : 다른 permeabilization 방법을 MeOH 치환 될 수 있고, 일부 세포 유형에 대한 최적 permeabilization을 달성하기 위해 필요할 수있다. 여전히 일관된 permeabilization을 제공하는 동안 일부 셀 소스의 0.1 % 트리톤 X-100, permeabilization위한 PBS 용액 중 0.2 % 트윈 20 0.1 % 사포닌 나은 셀 무결성을 유지할 수있다. - permeabilization 4 ° C에서 24 시간의 최대 최소 1 시간 또는 최대 샘플을 인큐베이션.
참고 : 메탄올의 샘플은 -80 ° C에서 최대 1 개월로 저장할 수 있습니다이 단계에서. - 4 ℃에서 5 분 동안 원심 분리기 (300) XG 세포. 가만히 따르다거나 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음.
- 각 샘플의 MeOH를 사용하는 Permeabilize 하시려면 ML 위해 세척 완충액 1 ㎖를 추가한다. 부드럽게 세포 펠렛을 재현 탁.
- 500 μL를 세척 완충액으로 두 샘플을 씻는다.
- 세포 항체 염색 패널을 준비한다.
- 1.5 ㎖의 튜브에 샘플 당 각각 0.5 ㎎ / ㎖의 세포 내 항체 0.5 μL, 또는 경험적으로 결정된 양을 겸용. 샘플 당 10 μL에 볼륨을 가지고 필요한 경우 세척 버퍼를 추가합니다. 피펫으로 섞는다.
- 동일 샘플마다 한 1.5 ㎖의 튜브에 세포 항체 풀 분열.
- 각 샘플 1.5 ㎖의 튜브에 세척 완충액 500 μL를 준비한다.
- 모든 샘플에 대한 정규화 된 볼륨 샘플 세포 염색을 적용합니다.
참고 :이 조심스럽게 샘플 볼륨 및 항체 농도를 제어하는 것이 중요합니다 여러 샘플에서 일관성 항체 라벨을 확인하십시오.- 4 ℃에서 5 분 동안 원심 분리기 (300) XG 세포. 가만히 따르다거나 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음.
- 50 μL로 설정 200 μL 피펫 함께 분주 세포 표면 항체의 풀 튜브에 시료 펠릿 양도 용액 나머지 제거한다.
- 피펫가입 분취 액 튜브 모든 피펫 팁으로 공기를 흡입하지 않고.
- 피펫 플런저를 유지하는 드로잉 방지하면서 공기가 50 μL의 총 샘플 부피를 위해 세척 완충액을 드로잉하는 버퍼와 플런저를 공개 워시 500 μL를 튜브로 제조 된 선단을 이동.
- 샘플에 피펫 팁의 내용을 다시 추가하고 부드러운 피펫과 액체의 샘플을 재현 탁.
- 혼합하면서 일정한 오비탈 진탕 기에서 실온에서 1 시간 동안 샘플을 인큐베이션.
- 워시 샘플을 500 μL로 두 번 세척 완충액.
- 500 μL PBS로 세척 샘플.
5. 이리듐 라벨링
- 수정 샘플
- PBS 500 μL에 재현 탁 샘플.
- PBS에 4 % PFA의 500 μL를 추가합니다.
- 일정한 믹싱 오비탈 쉐이커상에서 RT에서 15 분 이상 동안 인큐베이션.
- DNA의 이리듐 라벨 적용
- 샘플 500 μL 62.5 nm의 이리듐 PFA 솔루션을 추가합니다.
참고 : overstaining을 피하기 위해 2000 : 투과성이 세포를 이용한 실험을 위해, 하나의 최종 희석의 500 배 Ir191 / 193 주식을 희석. - 혼합하면서 일정한 오비탈 진탕 기에서 실온에서 15 분 동안 인큐베이션.
참고 : 강력한 Ir193 신호가 Pt194 매스 채널에 기여 부정적인 바코드 품질에 영향을 미칠 수 있기 때문에 모노 이소 시스플라틴 바코드를 수행하는 15 분 이상 이리듐과 샘플을 품어하지 마십시오. - 4 ℃에서 5 분 동안 원심 분리기 (300) XG 세포. 가만히 따르다거나 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음.
- 회 여과 탈 이온수 500 μL, 0.1 % BSA로 세척 샘플.
참고 : 일단 가능하다면 우리는 24 시간 이내에 샘플을 실행하는 것이 좋습니다 준비했다. 준비된 샘플은 39 ° C에서 단기간 저장 될 수있다하지만주의 저하를 방지하기 위해주의해야한다. 이기구 세척 감소 시스템의 스프레이 챔버 샘플러 콘 침착을 감소하여 최종 세척은 여과 BSA 않고 증류수에 수행되어야 가능한 경우. hESCs는 것이 BSA가 튜브 표면에 부착되는 샘플의 손실을 피하기 위해 포함하면서 이러한 세척을 수행하는 것이 필요하다.
- 샘플 500 μL 62.5 nm의 이리듐 PFA 솔루션을 추가합니다.
6. 취득을 위해 샘플을 준비
- 세포를 카운트
- 여과하고, 탈 이온수 500 μL 0.1 % BSA에 재현 탁하고 세포를 35 μm의 셀 스트레이너 캡 통해 새로운 튜브로 필터링.
참고 : 최종 세척을위한 BSA 수준을 낮추는는 대량 세포 계측법 분무기에 남아있는 잔류 물을 감소시킨다. 비 접착 세포를 세정하고, 여과, 탈 이온수에 재현 탁 될 수있다. - 미세 원심 분리 튜브에 세포 현탁액 10 μL를 전사함으로써 세포를 카운트. 공지의 비율로 희석 분취트리 판 블루는 (셀 시각화를 돕기 위해)와 혈구 또는 자동 세포 계수 시스템에 전송할 수 있습니다.
- 4 ℃에서 5 분 동안 원심 분리기 (300) XG 세포. 가만히 따르다거나 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음.
- 여과하고, 탈 이온수 500 μL 0.1 % BSA에 재현 탁하고 세포를 35 μm의 셀 스트레이너 캡 통해 새로운 튜브로 필터링.
- 준비 및로드 샘플
- 교정 비즈 냉장고에서 제거하고 재 부유 적극적으로 흔들 준비합니다.
- 오토 샘플러 계측법 질량을 이용한 샘플을 실행하는 경우에, 분석 될 셀의 수를 추가 샘플 플레이트의 각 웰에 교정 구슬 50 μL를 추가한다. 수동 주입에 의해 실행 샘플이 샘플 교정 구슬 50 μL를 추가하는 경우, 필터링 된 탈 이온수에서 샘플을 희석 잘 혼합 및 대량 세포 계측법 샘플 주입 포트에 부하 샘플. 적절한 샘플 희석은 분석되는 세포 유형에 따라 달라질 수 있으나, 10 (6)의 희석 (1) 일반적으로 적절하다.
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Representative Results
여기에 제시된 프로토콜은 광범위 약간만 변형 배양 및 일차 전지 샘플의 다양한 적용 할 수있다. 이러한 바코드 또는 세포 표면 염색과 같은 특정 구성 요소가 필요하지 않은 경우의 실험 조건에 따라,이 모듈 형 방식으로 수행 될 수있다. 전체 이용이 프로토콜은 사균 배제 S 상 인구 식별 표지 최대 38 개 항체 타겟의 정량 시료 염색 계측법 다중화 질량의 제조를 가능하게한다.
이 프로토콜 (도 2)에서 설명하는 방법에 의해 제조 된 기대 결과를도 3에 도시된다. 데이터를 수집하면, 교정 비드 강도에 기초하여 신호 강도의 정규화 질량 계측법 소프트웨어에서 수행 될 수있다. 정상화 후, 초기 데이터 proce을단일 세포 교정 비즈 게이트를 제거하고 죽은 세포를 제거하기 ssing 데이터는 유세포 분석을 할 수있는 임의의 소프트웨어를 사용하여 수동으로 수행 될 수있다. 교정 비드의 제거는 Ir191 + Ce140- 인구 (도 3a)이나 MATLAB 기초 알고리즘 (20)에 의해 게이팅 수동으로 수행 될 수있다. Ir193 및 이벤트 길이 (그림 3B)의 축 플롯에 게이팅에 의해, 파편과 세포 다중 상태를 제거하는 동안 단일 세포 이벤트 (검정 개요, 그림 3B) 문이 될 수있다. 죽은 세포의 시스플라틴 라벨은 세포 사멸의 양을 정량화하는데 활용 될 수있다; 로우 (도 3D), 및 사균의 이상 (도 3e) 양과 시료의 예로는 제시된. 죽은 세포는 Pt198 + 인구 (그림 3E)를 오프 게이팅하여 데이터에서 제거 할 수 있습니다. 샘플 바코드, 모노 이소 시스플라틴 또는 팔라듐 시약, SA의 별개의 분리의 결과인지세포 수있는 바 코딩 파라미터들 (도 3c) 내의 mples 원래 샘플 ID에 할당된다. 이러한 IDU 라벨 등 추가의 선택 방법은, 예를 들어, 특정 집단의 검출을 허용, S 상 세포 (도 3f). 초기 정규화 debarcoding 게이팅 이어 고차원 데이터는 데이터 분석 및 가시화 계측법 18 질량 설계된 SPADE 17 등 여러 다른 알고리즘의 다양한 활용 분석 될 수있다. 이러한 SPADE 같은 알고리즘은 직접 고차원 상태에서 가시화 될 수 없기 때문에 해석하기 어려울 수 고차원 데이터를 받아, 시각 해석 (도 3G) 더 의무가있는 데이터의 하부 차원 표현을 생성한다.
그림 1 : 측정 세포 계측법 대량의 기본 원칙. 계측법 분석 용 질량 세포 샘플의 제조 소자의 란타나 이드 계열에서 주로 금속 동위 원소로 표지 된 항체로 염색 된 세포를 포함한다. 이 방식에서, 특정 항원에 대해 발생 된 항체는 각각의 동위 원소가 표면, 세포질이 국부적 핵 또는 염색질 잠재적으로 사용될 수있는 이러한 에피토프에 대해 항체 사마륨 (154) 고유의 원자량을 갖는 표지된다. 표지화 된 세포를 주입하고 아르곤 플라즈마 토치에 의해 이온화되는 단일 세포 계측법 분무기 액적으로서 대량으로 분사된다. 더 큰 원자 질량 이온이 풍부 검출기로 측정하는 동안 생성 된 입자 구름은 사중 극 질량 필터 낮은 원자 질량 스트립된다. 각 유일한 질량의 이온의 측정 량은 관련된 항체의 표적 항원의 세포 풍부에 대응한다. 이론적 리터 동안100 파라미터 IMIT이 방법을 이용하여 정량화 될 수있는, 현재 시판되는 시약은 셀 당 40 개 이상의 매개 변수의 검출을 허용한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 실험 절차 및 선택적 단계의 워크 플로우도이다. 대량 세포 계측법에 대한 세포를 준비 프로토콜에 관련된 주요 단계의 묘사. 옵션 단계는 오렌지 상자로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: m 계측법 분석 엉덩이에서 생성되는 데이터의 예. (A) 세포 (하이 Ir191 낮은 Ce140), 비드의 분리 (낮은 Ir191 높은 Ce140) 비드 세포 이중선 (높은 Ir191 높은 Ce140)를 나타내는 이축 플롯. 이벤트 길이 대 Ir193의 예상 모습을 보여주는 (B) 이축 줄거리. 세포 파편 및 세포 다중 상태를 제거 단셀 게이팅 나타낸다. (C) 이축 플롯 시스플라틴 바코드 두 질량 채널들의 예시적인 도면을 도시. (D - E) 낮은 비율 (D) 및 사균의 높은 비율 (E)과 시료 시스플라틴 라이브 / 죽은 염색의 데이터 예. (F) 이축 S 단계에서 세포를 구별 IDU 표지 H9 hESC의 셀의 플롯 또한 세포주기를 구별하기 사이클린 B1에 대한 항체. (G 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시된 프로토콜이 성공적으로 다양한 배양 된 세포주 (H1 및 H9 hESCs는, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) 및 주 조직 샘플 (마우스 골수, 마우스 배아 간 마우스 성인의 처리를 위해 사용되어왔다 간, 마우스 종양). 관계없이 소스, 휴대 상태를 유지하면 세포 계측법 질량 분석 의무해야하지만, 어떤 프로토콜 최적화해야하는 동안 하나의 세포로 해리 될 수있는 조직. 몇 가지 항원이 사용되는 특정 해리, 고정 및 permeabilization 치료에 의해 영향을받을 수 있으며, 이러한 방법은 샘플 별 최적화를 받아야 할 필요가 있으므로주의하는 것이 중요하다. 낮은 신호는 항체에 대해 관찰되는 경우는, 생균의 세포 표면 라벨링을 행하는 방법을 permeabilization 변경 또는 고정 시간을 감소시킴으로써 개선시킬 수있다.
가능하면 실험 설계에서, 일에 바코드를 포함하여즉 시료 처리 흐름 세포와 항체의 농도 수준에서 샘플 사이의 일관성을 보장한다. 바코드없이 많은주의가 샘플 처리 제어를 수행하는 경우에도, 항체 농도과 세포 농도에 약간의 차이는 샘플 사이에 도입 될 가능성이있다. 특정 에피토프에 대한 양성 세포의 백분율은 샘플 사이 가능성을 다양 더욱이, 효과적인 항체 대 항원 비율은 반드시 전체 항체 농도 잠재적 항체 염색 불일치를 초래 일관성 유지 되더라도 샘플 간의 차이가있다. 높은 매개 변수 실험을 수행 및 관리는 데이터 분석 중에 찍은되지 않으면 생물학적 의미로 해석 될 수있는 경우 단일 채널을 관찰 일반적으로 작은 동안 이러한 변화는 크게 악화 될 수 있습니다.
실험 세포 계측법 대량의 결과 데이터의 분석은 많은 양식 및 computa의 숫자를 취할 수적인 접근 방법이 응용 프로그램을 위해 특별히 맞게 조정되었습니다. 대량 유용한 알고리즘의 철저한 조사를 제공하면서 데이터 분석 계측법이 원고의 범위를 벗어 성공적으로 사용되어왔다 접근이 강조되며, 관심있는 독자는이 주제에 21, 22, 23을 포함하는 여러 자원에 전달됩니다. 데이터 세포 계측법 질량 분석을 위해 가장 널리 채택, 현재 사용할 수있는 방법 두 가지가 밀도의 나무 진행 스패닝하는이 이벤트 (SPADE)와 viSNE을 정상화. SPADE 비슷한 마커 식 세포 집단에서의 클러스터를 형성하고, 각 노드의 클러스터를 나타낸다. 이러한 노드는 유사한 노드 라인 (도 3G)에 의해 접속되어 SPADE 트리로 배치된다. viSNE는 2 차원 표현을 생성하기 위해 알고리즘 (24)을 매립 t 분포 확률 이웃을 이용하는고 차원 데이터는 전체 데이터 구조를 유지하면서. SPADE와 viSNE 모두가 MATLAB로 작성된 소스 코드를 자유롭게 사용할 수 있으며 MATLAB을 가진 사용자가 실행할 수 있습니다. 또한, 스페이드의 독립 실행 형 버전을 사용할 수 있습니다.
대량 세포 계측법 현재 매개 변수의 가장 높은 숫자의 컬렉션을 허용하는 동안, 형광 태그를 기반으로 세포 계측법 일부 응용 프로그램을위한 더 나은 방법이 될 수 있습니다. 형광 유세포 최대 계측법 미사 500-1,000에 비해 5 × 4 초당 더 많은 세포를 분석 할 수 있고, 항체 (25)를 더 사용할 검증했다. 이러한 초 미세 분광 세포 계측법 (26)과 새로운 형광 모두를위한 실행 가능한 대안 세포 계측법 (27) 메이크업 형광 흐름하지만 매우 높은 매개 변수 실험 등 세포 계측법 형광 흐름의 추가 발전,. 이러한 이전 RNA 28 만 측정 가능한 추가적인 기법형광 기반의 흐름에 의해 세포 계측법 최근 단백질과 RNA (29)의 동시 검출을 허용 계측법 질량에 적응되었다. 가능한 동위 원소 및 시약의 미래 확장은 더 완전하게 측정 동위 원소의 질량 창을 활용하고 세포 계측법 질량 가능한 프로파일의 깊이를 확대 할 측정 세포 특성의 레퍼토리를 확장합니다.
질량 계측법에 의해 동시에 분석 할 수있는 파라미터의 다수 크게 조사 할 수있는 실험 질문을 확장한다. 우리는이 문서와 첨부 된 비디오 프로토콜을보다 효과적으로 연구를 사전에 대량 세포 계측법 활용하는 관심있는 연구자 수있게되기를 바랍니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mTeSR1 medium kit | Stem Cell technologies | 05850 | Warm at room temperature before use |
| DMEM F-12 | ThermoFisher | 11330-032 | Warm at 37 °C before use |
| Accutase | Stem Cell technologies | 07920 | Warm at 37 °C before use |
| Bovine serum albumin | Equitech | BAH62 | |
| phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.01 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Cell ID Pt194 | Fluidigm | Provided at 1 mM | |
| Cell ID Pt195 | Fluidigm | Provided at 1 mM | |
| Cell ID Pt196 | Fluidigm | Provided at 1 mM | |
| Cisplatin | Enzo Life Sciences | ALX-400-040-M250 | Soluble to 25 mg/mL in DMSO |
| Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit | Fluidigm | 201060 | |
| 5-Iodo-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | I7125 | Soluble to 74 mg/mL in 0.2 N NaOH |
| Rhodium 103 intercelating agent | Fluidigm | 201103A | |
| Methanol | Fisher | BP1105-4 | Chill at -20 °C before use |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 5 mL round bottom tubes | Falcon | 352058 | |
| 5 mL 35 μm filter cap tubes | Falcon | 352235 | |
| EQ four element calibration beads | Fluidigm | 201078 | |
| Hyaluronidase Type I-S | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Disposable Scalpel #10 | Sigma-Aldrich | Z69239 |
References
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. J Vis Exp. , e4398 (2012).
- Leipold, M. D. Another step on the path to mass cytometry standardization. Cytometry A. 87, 380-382 (2015).
- Newell, E. W., et al. Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization. Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).
- Leong, M. L., Newell, E. W. Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).
- Zunder, E. R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).
- Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry A. 87, 369-374 (2015).
- Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).
- Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry A. 81, 467-475 (2012).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3, 361-368 (2006).
- Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81, 552-566 (2012).
- Edgar, L. J., et al. Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry. Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).
- Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Horowitz, A., et al. Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry. Sci Transl Med. 5, 208ra145 (2013).
- Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry. Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).
- Han, L., et al. Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells. Cytometry A. 87, 346-356 (2015).
- Bendall, S. C., et al. Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development. Cell. 157, 714-725 (2014).
- Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).
- Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).
- Behbehani, G. K., et al. Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining. Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).
- Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83, 483-494 (2013).
- Chester, C., Maecker, H. T. Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data. J Immunol. 195, 773-779 (2015).
- Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data. Methods. 82, 55-63 (2015).
- Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).
- van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizaing Data using t-SNE. J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).
- Kling, J. Cytometry: Measure for measure. Nature. 518, 439-443 (2015).
- Gregori, G., et al. Hyperspectral cytometry. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).
- Chattopadhyay, P. K., et al. Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments. Cytometry A. 81, 456-466 (2012).
- Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).
- Frei, A. P., et al. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nat Methods. 13, 269-275 (2016).
