Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Prøvepreparering for Mass Cytometry Analyse

Published: April 29, 2017 doi: 10.3791/54394
Automatic Translation
1, 1, 1
1Epigenetics and Molecular Carcinogenesis, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

Abstract

Masse cytometri benytter antistoffer konjugert med tungmetall etiketter, en tilnærming som har betydelig økt antall parametere og muligheter for dyp analyse langt utover hva som er mulig med konvensjonelle fluorescens-baserte strømningscytometri. Som med all ny teknologi, er det kritiske trinn som bidrar til å sikre pålitelig generasjon av høy kvalitet data. Presenteres her er en optimal protokoll som omfatter flere teknikker for gjenvinning av celleprøver for masse cytometri analyse. Metodene som er beskrevet her vil hjelpe brukeren unngå vanlige fallgruver og oppnå konsistente resultater ved å minimere variasjon, noe som kan føre til unøyaktige data. For å informere eksperimentell design, er begrunnelsen bak valgfrie eller alternative fremgangsmåten i protokollen og deres effekt i å avdekke nye funn i biologien til systemet som undersøkes dekket. Endelig er representative data presentert for å illustrere forventede resultater fra teknikker ented her.

Introduction

Cytometri muliggjør samtidig måling av flere antistoff-mål på et celle-nivå over store populasjoner av celler. I tradisjonell fluorescens-baserte strømningscytometri, er antallet av parametere som kan kvantifiseres begrenset av spektral overlapping mellom emisjonsspektret av flere fluoroforer, som krever stadig mer komplekse kompensasjons beregninger som antall parametre Øker. Disse begrensningene er adressert av masse cytometri, hvor tungmetall-konjugerte antistoffer blir detektert og kvantifisert ved flukttid (TOF) massespektrometri som utvider antall parametere innsamlet samtidig og gir en høy dimensjons protein-overflod profil for hver enkelt celle.

En grunnleggende forståelse av arbeidet i massen cytometri instrumentet er gunstig for brukeren og kan være avgjørende for feilsøking. For en mer grundig beskrivelse av tuning og kjører en masse cytometri maskin,se relaterte manuskriptet en. I korthet blir en celleprøve som er merket med et panel av metall-konjugerte antistoffer målrettet mot celleoverflatemarkører, cytoplasmatiske proteiner, kjerneproteiner, kromatin-bundne proteiner eller andre epitoper av interesse (figur 1i). De merkede celler blir lastet inn i maskinen, enten en av gangen ved manuell injeksjon eller ved hjelp av en automatisk prøvetaker som tar prøver fra en 96-brønns plate. De fylte celler blir injisert gjennom en forstøver, som frembringer en dusj av væskedråper som innkapsler cellene (figur 1ii). Denne sprayen er plassert slik at cellene blir ionisert av en argon-plasmabrenner. Denne ionisering genererer en partikkelskyen som består av alle de konstituerende atomene i hver celle (figur 1iii). Ettersom denne partikkel-sky reiser til detektoren, er lav atommasseenatomer adskilt fra de høye masseioner ved en kvadrupolmasse filter. De resterende høye masse ioner fortsette til detektoren, hvor abundance av hver isotop kvantifiseres (figur 1iv). De rå data som samles inn ved hjelp av detektoren, blir analysert ved hjelp av masse-cytometri instrumentet programvare for å identifisere cellearrangementer. For hver identifisert celle hendelse, blir det signal som detekteres i hver enkelt kanal kvantifisert og lagret til en utgang .fcs fil. Masse kanaler som brukes for å detektere tungmetall konjugerte antistoffer som utviser minimal spektral overlapping, som spenner 0-4% med de fleste bidrag under 1%. På grunn av denne lave krysstale mellom kanalene, er det vanligvis unødvendig å transformere dataene med en kompensering matrise før analyse 2. Imidlertid bør man være forsiktig under utformingen av den eksperimentelle panel av antistoffer for å sikre at et antistoff med en høy-overflod epitopen ikke er tilordnet til en massekanal som bidrar signal til en kanal som er tilordnet en lav-overflod antistoff, da dette kan skape en kunstig høy populasjon i kanalen å motta signalet bidrag.

3, 4. Utføre celleoverflate-antistoff farging på levende celler kan være nødvendig for noen antistoffer, men dette utelukker muligheten for barcoding før antistoffmerking som de fleste strekkode metoder blir utført etter fiksering 5 selv om antistoff-baserte strekkoding 6, 7 er et unntak.

Ved bestemmelse av antallet celler som skal fremstilles for analyse, er det viktig å vite at bare en fraksjon av cellene anbringes på maskinen vil bli detektert og produsere data. Dette skyldes først og fremst til ineffektivitet når forstøveren sprays prøven ved brenneren. Den nøyaktige prosent tap er avhengig av den masse-cytometri maskinoppsettet og celletype, men kan ligge i området 50-85% og børvurderes ved utformingen av forsøket. Denne protokollen har blitt optimalisert for 2x10 6 celler pr datautvalg, men kan tilpasses for behandling av mindre eller større prøvestørrelser. Denne protokollen kan anvendes med minimale modifikasjoner til prøvestørrelser fra 1 x 10 til 4 x 6 10 6, men det er avgjørende at prøvestørrelsen holdes konsekvent innenfor et eksperiment. Endringer i celleantallet kan påvirke den intensitet av strekkoding og antistoff farging og bør holdes omtrent lik i de prøver som skal sammenlignes direkte.

Noen fremgangsmåter, så som døde cellemerking og DNA-merking, bør utføres i de aller fleste, om ikke alle eksperimentelle design. Merkingen av døde celler i forsøk å analysere kun overflatemarkører kan oppnås ved hjelp av Rh103, men Rh103 bør unngås for forsøk hvor permeabilisering er nødvendig fordi det resulterer i farging tap. For eksperimenter som involverer permeabilization, er det tilrådelig å bruke cisplatin

Strekkoding prøver kan redusere antistoff bruken, redusere innhentingstiden og eliminere sample-til-sample variabilitet 9. Prosessen med strekkoding involverer å påføre en unik sample-spesifikk kode for alle celler, som brukes til å tildele hver enkelt celle til sin prøve av opprinnelse. Etter barcoding samplene kan samles før antistoffarging, en prosess som sikrer at alle prøvene er farget på samme måte. For å minimere eksperimentelle feil, er det klokt å strekkode og bassenget til alle prøver som skal sammenlignes direkte med hverandre. For tiden finnes det flere metoder for å barcoding prøver for masse cytometri analyse 5, 6, 7, hvorav to er angitt her (se nedenfor).

Med tiden tilgjengelig Reagents Det er mulig å kvantifisere mengde av 38 antistoff-mål, identifisere celler i S-fase 10, skille levende og døde celler 8 og måle cellulære nivåer av hypoksi 11 i en multiplekset eksperiment av flere prøver. Denne evnen til å samle høy parameter enkelt celledata for store cellepopulasjoner muliggjør forbedret profil i heterogene cellepopulasjoner, og har allerede produsert en rekke nye biologiske innsikt 12, 13, 14, 15, 16. Destillering det resulterende kompleks data til tolkbar informasjon har krevet bruk av beregningsalgoritmer blant annet omfatter tre Progresjon av tetthet normaliserte hendelser (SPADE) 17 og viSNE 18.

Denne artikkelen presenterer en tilgjengeligoversikt over hvordan man skal utforme og gjennomføre en masse cytometri eksperiment og innfører grunnleggende analyse av masse cytometri data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cell Høsting

  1. Innhøsting av celler fra primærvev
    MERK: Fremgangsmåten beskrevet for høsting av celler fra primærvev er spesielt anvendelig til musebrysttumorvevet, og vil kanskje ikke gjelde som er å primære vev fra andre kilder.
    1. Forbered nedbrytningsbuffer ved å oppløse 5 mg hyaluronidase og 30 mg kollagenase i 10 ml DMEM / F12-medium per gram av vevet som skal behandles. Filter sterilisere fordøyelsen buffer.
    2. Isoler primære brystkjerteltumor fra mus og registrering tumorvekt.
    3. Hakk vev med # 10 skalpell i minst 5 min.
    4. Legg hakket vev til passende volum av nedbrytningsbuffer (10 ml buffer pr gram vev).
    5. Rist hakket vev i nedbrytningsbuffer ved 100 rpm i 1-3 timer ved 37 ° C.
    6. Oppnå enkelt cellesuspensjon ved å føre cellene gjennom 0,4 um filter over i et 50 ml rør.
    7. Sentrifuger cellene ved 300 xg i 10 min ved 4 °; C. Dekanter eller forsiktig oppsuging av supernatanten uten å forstyrre pelleten.
    8. Oppslem pellet på nytt i 4 ml DMEM / F12 og overføring til 5 ml rundbunnet rør.
  2. Innhøsting av celler fra vevkultur
    1. Vask platene eller kolbe av adherente celler med kalsium- og magnesium-fri fosfat-bufret saltvann (PBS) ved romtemperatur.
      MERK: Teknikken som er beskrevet for høsting av celler som er spesielt anvendelig for å adherent, human embryonal stamcelle (hESC) kultur celler. Men resten av den beskrevne protokoll er bredt anvendelig på andre dyrkede cellelinjer, ikke-heftende linjer og primære celler.
    2. Legg varmet (37 ° C) trypsin eller annen enzymatisk fordøyelse reagens som er optimalisert for å oppnå en enkel cellesuspensjon fra de adherente celler. Følg produsentens protokoll.
      MERK: Trypsin og andre enzymatiske dissosiasjon reagenser har potensial til å påvirke cellulære markører.
    3. Inkuber platen ved 37° C i 2-5 minutter for å løsne cellene. For høye sammenflytning kulturer, banke forsiktig på platen for å hjelpe løsne cellene.
    4. Overfør fullstendig frigjorte cellene fra platen inn i en 5 ml rundbunnet rør og forsiktig pipettér under anvendelse av en 1 ml pipette for å dissosiere celler.
      NB: For behandling av store antall prøver alle trinn kan alternativt utføres i en 96 brønn rundbunnet plate. For behandling av prøver i en 96 brønns alle vaskinger kan utføres ved et volum på 250 ul. De volumer som er beskrevet i andre trinn kan justeres slik at totalvolumet ikke overstiger 300 ul.
    5. Reaksjonen stanses ved enzymatisk fordøyelse reagens med et like stort volum vaskebuffer (0,5% BSA og 0,02% natriumazid i PBS).
      MERK: Natriumazid er et farlig kjemikalie. Riktige sikkerhetsforanstaltninger må følges for sin forberedelse og håndtering.
    6. Sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 minutter ved 37 ° C. Dekanter eller forsiktig oppsuging av supernatanten uten å forstyrre pelleten.
    7. resuspenderceller i 1 ml serumfritt medium.
    8. Cellene telles ved å overføre 10 ul av cellesuspensjonen til et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Fortynn alikvot til et kjent forhold i trypanblått og overføring til et hemocytometer eller automatisert celletelling system.
  3. Merking av S-fase befolkningen
    MERK: Hvis S-fasen merking er ikke å bli utført fortsette å demme 1,4.
    1. Forbered 1 ml av 10 pM 5-jod-2'-deoksyuridin (IDU) i serumfritt DMEM F12 eller annet egnet medium for hver 2 x 10 celler 6 som skal analyseres.
    2. Tilsett 500 ul 10 uM IDU i serumfritt medium i hver 2 x 10 6 celler.
      MERK: Mens IDU merking kan utføres i medier inneholdende serum, vil fritt protein reagere med cisplatin, og hindrer riktig merking av døde celler. Hvis medier inneholdende serum anvendes under IDU merking av et ytterligere vasketrinn er serumfritt medium er nødvendig for å fjerne serumproteiner før cisplatin levende / død staining.
    3. Forsiktig resuspender pellets med 1 ml-pipette.
    4. Inkuber i 10 minutter ved 37 ° C med forsiktig vugging.
  4. Levende / Døde merking
    1. For hver prøve fremstille 500 mL av 50 uM cisplatin i serumfritt DMEM-F12 eller celletype passende media.
      MERK: Hvis merking av S-fasen populasjon av IDU er ikke å bli utført, resuspender prøver ved en konsentrasjon på 4 x 10 6 celler / ml. Resuspendering av cellene før tilsetning av cisplatin muliggjør raskere blanding av løsninger for uniform levende / død merking.
    2. Tilsett 500 ul 50 uM cisplatin per 2 x 10 6 celler for prøver.
    3. Inkuber ved romtemperatur (RT) i 1 minutt på en orbital rystemaskin med konstant blanding.
    4. Slukke cisplatin med et like stort volum av vaskebuffer.
    5. Sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 minutter ved RT. Dekanter eller forsiktig oppsuging av supernatanten uten å forstyrre pelleten.
    6. Vask prøver to gangermed 500 ul vaskebuffer for å fjerne overskudd av cisplatin.
    7. Vask prøvene to ganger med 500 ul PBS for å fjerne overskudd av protein.
  5. Prøvefiksering
    1. Resuspender prøven i 500 ul PBS.
    2. Legg likt volum av 4% PFA i PBS i en sluttkonsentrasjon på 2%; pipette å blande.
      NOTE: Fremstill 4% PFA frisk fra pulver, juster pH til 6,9, og passere gjennom et 0,44 um filter. 4% PFA i PBS kan lagres ved 4 ° C i opptil to uker. Unngå forhåndslagde formalin levert i ampuller, med mindre spesifikt testet, slik det ofte inneholder metalliske forurensninger som kan forstyrre de målte massekanalene. Lavere konsentrasjon av PFA kan være tilstrekkelig, og hjelpe til å minimalisere effekten av fiksering på antistoffbinding, men bør bli testet empirisk.
    3. Inkuber i 15 minutter ved RT på en orbital-rystemaskin med konstant blanding.
    4. Sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanter eller forsiktig aspirer supernatanten without å forstyrre pelleten.
    5. Vask prøver med PBS for å fjerne PFA løsning.
      NB: I dette trinnet prøvene kan lagres i kort tid ved 4 ° C. Forlenget lagring ved 4 ° C kan resultere i nedbrytning av prøven og mindre tilskitning under bruk.

2. Barcoding

MERK: Mens metoder for anvendelse av monoisotopisk cisplatin strekkoding og palladium strekkoding er presentert samtidig, kan enten brukes alene eller unngås helt hvis ikke kreves av eksperimentet.

  1. Monoisotopic Cisplatin Barcoding
    MERK: Siden cisplatin barcoding og cisplatin Levende / døde flekker stole på overlappende kanaler forsiktighet bør tas for å sikre at bakgrunnen cisplatin Levende / døde flekker i levende celler er minimalisert dette kan forstyrre nøyaktigheten av cisplatin strekkode.
    1. Fortynn 1 mM monoisotopisk cisplatin forrådsoppløsninger til 200 uM i PBS.
    2. for each unike cisplatin strekkode fremstille et 1,5 ml rør med 500 ul PBS for hver 2 x 10 6-celler som mottar det strekkode.
    3. For å fremstille hver unike strekkode legge til hver anvendelig monoisotopisk cisplatin til en sluttkonsentrasjon på 200 nM.
    4. Resuspender celler i 500 ul PBS pr 2 x 10 6 celler.
    5. Legge til et likt volum av den tilsvarende strekkode oppløsning til hver prøve.
    6. Inkuber prøver ved RT i 5 min på en orbital-rystemaskin med konstant blanding.
    7. Stans reaksjonen cisplatin med et like stort volum av vaskebuffer.
    8. Sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanter eller forsiktig oppsuging av supernatanten uten å forstyrre pelleten.
    9. Vask prøvene to ganger med 500 ul vaskebuffer for å fjerne overskudd av cisplatin.
  2. palladium Barcoding
    MERK: Palladium strekkode reagenser kan enten være forberedt på 5 eller kjøpes kommersielt.
    1. transient delvispermeabiliseringsbuffer 19
      MERK: Palladium chelatering strekkoding krever delvis permeabilisering for reagensene til å passere gjennom cellemembranen og robust merke cellen.
      1. Vask prøver med 500 ul PBS.
      2. Vask prøver med 500 ul PBS pluss 0,02% saponin.
      3. Oppslem pellet på nytt i restvolum.
    2. Påfør palladium barcoding.
      1. Fortynn 100X stamløsning av palladium strekkoding reagens i 1 ml iskald PBS pluss 0,02% saponin.
      2. Hurtig tilsette fortynnede strekkoding reagens til resuspendert prøven.
      3. Inkuber i 15 minutter ved RT på en orbital rystemaskin ved under konstant blanding.
      4. Vaskeprøver to ganger med 500 ul vaskebuffer.

3. Celleoverflatefarging

MERK: Celleoverflatefarging kan utføres på levende celler før fiksering. Dette kan være nødvendig for antistoffer som mister affinitet for their epitop etter fiksering. Noen celleprøver kan ha nytte av tilleggsblokkering, slik som Fc-blokkering for leukocytter, før antistoffmerking for å redusere bakgrunnen. Optimal blokkering skal bestemmes empirisk for spesifikk prøvetype.

  1. Forbered celleoverflate-antistoff farging panel.
    1. Kombiner 0,5 ul, eller empirisk fastlagt mengde, for hver 0,5 mg / ml celleoverflate-antistoff per prøve inn i et 1,5 ml rør. Legg til en vaskebuffer hvis det er nødvendig for å bringe volumet opp til 10 mL per prøve. Bland ved pipettering.
      MERK: Bestem arbeidsfortynnelsen for hvert antistoff før eksperimentet empirisk ved titrering eksperiment.
    2. Split celleoverflate-antistoff basseng like inn i en 1,5 ml rør for hver prøve for å bli farget.
    3. Forbered 500 pl vaskebuffer i et 1,5 ml rør for hver prøve.
  2. Anvende celleoverflatefarging til prøver normalisert volum for alle prøver.
    MERK: For å ensure konsistent antistoffmerking på tvers av flere prøver er det viktig å nøye kontrollere prøvevolumet og antistoffkonsentrasjon. De følgende trinnene tar sikte på å oppnå dette konsistens ved å sikre at de endelige prøvevolum etter at antistoffet er blitt tilsatt er ensartet.
    1. Sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanter eller forsiktig oppsuging av supernatanten uten å forstyrre pelleten.
    2. Med en 200 ul pipette satt til 50 ul, fjerne gjenværende oppløsning fra prøve-pelleten, og overføring til et rør av den alikvotert celleoverflate-antistoff bassenget.
    3. Pipettere opp all væske i alikvoten røret uten å trekke luft inn i pipettespissen.
    4. Ved å holde i pipetten stempelet for å unngå å trekke luft beveger spissen inn i en klare for rør med 500 pl vaskebuffer og frigjøre stempelet.
    5. Legg tilbake innholdet i pipetten tips til prøven og suspendere prøven i væsken med forsiktig pipettering.
    6. Prøvene inkuberes i 1h ved RT på en orbital-rystemaskin med konstant blanding.
    7. Vask prøvene to ganger med 500 ul vaskebuffer for å sikre at all fri antilegeme vaskes bort.
    8. Vask prøver med 500 ul PBS.
    9. Resuspender cellepelleten i 500 ul PBS.
    10. Legg likt volum av 4% PFA i PBS; pipette å blande.
    11. Inkuber i 10 min på en orbital-rystemaskin.

4. Cell Permeabilization og intracellulær Farging

  1. Cell permeabiliseringsbuffer
    1. Sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanter eller forsiktig oppsuging av supernatanten uten å forstyrre pelleten.
    2. Resuspender cellene i restvolum ved forsiktig virvling inntil pelleten ble dissosiert.
      MERK: Hvis ikke dissosiere celler før tilsetning av MeOH vil resultere i celler som fester seg sammen og produsere en tynn film som vil resultere i delvis tap av prøven.
    3. Umiddelbart tilsett 1 ml av 100% MeOH per 2 x 10 6 </ Sup> celler og forsiktig pipette for å blande.
      MERK: Andre permeabilisering metoder kan benyttes i stedet for MeOH, og kan være nødvendig for å oppnå optimal permeabilisering av noen celletyper. For enkelte cellekilder en 0,1% Triton X-100, kan 0,2% Tween-20 og 0,1% saponin i PBS-løsning for permeabilisering opprettholde celleintegritet bedre, samtidig som den gir konsistent permeabilisering.
    4. Inkuber prøvene i minst 1 time eller opp til et maksimum av 24 timer ved 4 ° C for permeabilisering.
      NB: I dette trinnet prøvene i MeOH kan lagres i opp til en måned ved -80 ° C.
    5. Sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanter eller forsiktig oppsuging av supernatanten uten å forstyrre pelleten.
    6. Tilsett 1 ml vaskebuffer for hver ml MeOH anvendt for å permeabilisere prøven. Forsiktig resuspender cellepellet.
    7. Vask prøven to ganger med 500 ul vaskebuffer.
  2. Forbered intracellulære antistoff farging panel.
    1. Kombiner 0,5 ul, eller empirisk fastlagt mengde, for hver 0,5 mg / mL, intracellulære antistoff per prøve inn i et 1,5 ml rør. Legg til en vaskebuffer hvis det er nødvendig for å bringe volumet opp til 10 mL per prøve. Bland ved pipettering.
    2. Splitte intracellulære antistoff basseng like inn i en 1,5 ml rør for hver prøve.
    3. Forbered 500 ul vaskebuffer i et 1,5 ml rør for hver prøve.
  3. Gjelde intracellulær farging til prøver normalisert volum for alle prøver.
    NB: For å sikre konsekvent antistoffmerking på tvers av flere prøver er det viktig å nøye kontrollere prøvevolumet og antistoffkonsentrasjon.
    1. Sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanter eller forsiktig oppsuging av supernatanten uten å forstyrre pelleten.
    2. Med 200 ul pipette satt til 50 ul fjerne gjenværende oppløsning fra prøve-pelleten, og overføring til et rør av den alikvotert celleoverflate-antistoff bassenget.
    3. pipetteopp all væske i alikvoten røret uten å trekke luft inn i pipettespissen.
    4. Ved å holde i pipetten stempelet for å unngå å trekke luft beveger spissen inn i en klare for rør med 500 pl vaskebuffer og frigjøre stempelet, og trekker opp vaskebuffer for et totalt prøvevolum på 50 ul.
    5. Legg tilbake innholdet i pipetten tips til prøven og suspendere prøven i væsken med forsiktig pipettering.
    6. Prøvene inkuberes i 1 time ved romtemperatur på en orbital-rystemaskin med konstant blanding.
    7. Vaskeprøver to ganger med 500 ul vaskebuffer.
    8. Vask prøver med 500 ul PBS.

5. Iridium Merking

  1. Fix prøver
    1. Resuspender prøvene i 500 ul PBS.
    2. Tilsett 500 ul 4% PFA i PBS.
    3. Inkuber i minst 15 minutter ved romtemperatur på en orbital-rystemaskin med konstant blanding.
  2. Påfør Iridium merking av DNA
    1. Tilsett 500 ul 62,5 nM iridium PFA løsning til prøvene.
      MERK: For eksperimenter med permeabiliserte celler, fortynne 500x Ir191 / 193 lager for en endelig fortynning på 1: 2000 for å unngå overstaining.
    2. Inkuber i 15 minutter ved RT på en orbital-rystemaskin med konstant blanding.
      MERK: Ved utføring av monoisotopisk cisplatin strekkoding ikke inkubere prøvene med iridium i mer enn 15 min etter sterke Ir193 signaler kan bidra til den Pt194 massekanalen og negativt påvirke strekkoding kvalitet.
    3. Sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanter eller forsiktig oppsuging av supernatanten uten å forstyrre pelleten.
    4. Vask prøvene to ganger med 500 ul 0,1% BSA i filtrert deionisert vann.
      MERK: Når forberedt anbefaler vi å kjøre prøver innen 24 timer hvis det er mulig. Fremstilte prøver kan lagres kort sikt ved 4 ° C,men forsiktighet bør tas for å unngå degradering. Hvis det er mulig den endelige vaskinger bør utføres i filtrert deionisert vann uten BSA, da dette vil redusere avsetning på i spraykammeret og sampler kjegler av den maskin som vil redusere instrument rengjøring. For hESCs er det nødvendig å utføre disse vaskinger samtidig som det inneholder BSA for å unngå tap prøve fester seg til røroverflaten.

6. preparere prøver for arbeid Acquisition

  1. telle celler
    1. Resuspender celler i 500 ul 0,1% BSA i filtrert deionisert vann og filtreres inn i en ny slange gjennom et 35 mikrometer celle sil cap.
      MERK: Senking av BSA nivået for den endelige vaskinger reduserer rester igjen på Mass cytometri forstøveren. Ikke-adherente celler kan vaskes og resuspenderes i filtrert deionisert vann.
    2. Cellene telles ved å overføre 10 ul av cellesuspensjonen til et mikrosentrifugerør. Fortynn alikvot til et kjent forhold itrypanblått (for å hjelpe til med celle-visualisering) og overfør til et hemocytometer eller automatisert celletelling system.
    3. Sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanter eller forsiktig oppsuging av supernatanten uten å forstyrre pelleten.
  2. Forbered og belastningsprøver
    1. For å fremstille kalibrerings kuler fjernes fra kjøleskapet og rist kraftig å resuspendere.
    2. Ved å kjøre prøver ved å bruke en masse cytometri automatisk prøvetaker, tilsett 50 ul av kalibrerings kuler til hver brønn av prøveplate deretter tilsette den ønskede antallet celler som skal analyseres. Hvis kjører prøver ved manuell injeksjon tilsett 50 pl av kalibrerings perler til prøve, fortynne prøven i filtrert deionisert vann, bland godt og belastningsprøve i Mass cytometri prøveinjeksjonsport. Den passende fortynning av prøvene kan variere avhengig av celletypen som skal analyseres, men en fortynning på 10 6 er som regel hensiktsmessig en.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen presentert her kan grovt anvendes på et bredt utvalg av dyrkede og primære celleprøver med bare mindre modifikasjoner. Avhengig av kravene til forsøket, kan den utføres på en modulær måte ved visse elementer, som for eksempel strekkoding eller celleoverflatefarging, er ikke nødvendig. Benyttes i sin helhet denne protokollen muliggjør fremstilling av tidsmultipleksede masse cytometri prøver merket for død celle utelukkelse, S-fase befolkning identifikasjon og farget for kvantifisering av opp til 38 antistoff-mål.

Forventede resultater fremstilt ved de fremgangsmåter som er skissert i denne protokoll (figur 2) er vist i figur 3. Ved innsamling av data, kan normalisere signalintensiteten basert på kalibrerings vulsten intensitet utføres inne i massen cytometri programvare. Etter normalisering, innledende data processing for å fjerne kalibrerings perler, gate på enkeltceller og fjerne døde celler kan utføres manuelt ved hjelp av en programvare i stand til å analysere flowcytometri data. Fjerning av kalibrerings perler kan utføres manuelt ved å tenne den Ir191 + Ce140- populasjonen (figur 3A), eller med et MATLAB basert algoritme 20. Encellede hendelser (svart omriss, figur 3B) kan bli styrt under fjerning av debris og cellemultipletter, ved å tenne den biaksiale tomt på Ir193 og aktivitetslengde (figur 3B). Cisplatin merking av døde celler kan benyttes til å kvantifisere mengden av celledød; vist er eksempler på prøver med lav (figur 3D) og høyere (figur 3E) mengder av døde celler. Døde celler kan fjernes fra dataene ved portstyring av Pt198 + populasjonen (figur 3E). Strekkoding av prøver, enten med monoisotopisk cisplatin eller palladium reagenser, medfører tydelig separering av samples innenfor strekkodeparametere (figur 3C), som tillater cellene å bli tildelt til sin opprinnelige prøve identitet. Ytterligere valgfrie metoder, for eksempel IDU merking, tillater påvisning av spesifikke populasjoner, for eksempel, S-fase celler (figur 3F). Etter innledende normalisering, debarcoding og gating, kan de høye dimensjonale data analyseres ved anvendelse av en rekke forskjellige algoritmer, inkludert SPADE 17 og flere andre konstruert for masse cytometri dataanalyse og visualisering 18. Algoritmer som SPADE ta de høye dimensjonale data, som kan være vanskelige å tolke, fordi den ikke direkte kan visualiseres i sin høy dimensjons tilstand, og generere en nedre dimensjonal representasjon av data, noe som er mer mottagelig for visuell tolkning (figur 3G).

Figur 1 Figur 1: Grunnleggende prinsipper for masse cytometri måling. Fremstilling av celleprøver for masse cytometri analyse involverer å merke celler med antistoffer merket med metallisotoper hovedsakelig fra lantanidserien elementer. I dette skjema hvert antistoff fremskaffet mot en spesifikk epitop er merket med en isotop som innehar en unik atommasse, slik som Samarium 154. Antistoffer mot epitoper som er flate, cytoplasmisk, nukleær eller kromatin lokaliserte kan potensielt benyttes. Merkede celler blir injisert og sprøytes gjennom massen cytometri nebulisatoren som enkeltcelle dråper hvor de blir ionisert ved en argon-plasmabrenner. Den resulterende partikkel sky strippes for lav masse atomene ved hjelp av en kvadrupolmasse filter, mens den overflod av større atommasseenioner måles ved hjelp av detektoren. Den målte mengde av hver unike masseion tilsvarer den cellulære overflod av dets tilhørende antistoffets epitop mål. Selv om en teoretisk lImIt av over 100 parametere, kan kvantifiseres ved hjelp av denne metoden, er dagens kommersielt tilgjengelige reagenser tillates deteksjon av over 40 parametere pr celle. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Arbeidsflyt diagram av eksperimentelle prosedyre og valgfrie trinn. Avbildning av de viktigste trinnene som er involvert i fremgangsmåten fra fremstilling av celler for masse-cytometri. Valgfrie trinn er angitt med oransje bokser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Eksempel på data generert fra m ass cytometri analyse. (A) Biaksial plott som viser separasjon av celler (høy Ir191, lav Ce140), kuler (lav Ir191, høy Ce140) og vulst-celle dubletter (høy Ir191, høy Ce140). (B) Biaxial plott som viser forventet utseendet Ir193 vs hendelse lengde. Gating av enkeltceller som fjerner cellerester og celle multiplets er vist. (C) Biaksial plott som viser eksempel riss av to masse kanaler fra cisplatin strekkoding. (D - E) Eksempel data fra cisplatin Levende / døde flekker for prøver med en lav prosentandel (D) og en høy prosentandel (E) av døde celler. (F) plott av biaksial H9 hESC celler merket med IDU å skille celler i S-fase, og et antistoff mot cyklin B1 til ytterligere å skille cellesyklusen. (G Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen som presenteres her er blitt anvendt for behandling av forskjellige dyrkede cellelinjer (H1 og H9 hESCs, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10a) og prøvene primærvev (benmarg fra mus, mus embryonisk lever, mus voksen lever, musetumor). Uavhengig av kilden, en hvilken som helst vev som kan bli dissosiert til enkeltceller og samtidig bevare cellet tilstand skal være egnet for analyse ved hjelp av masse cytometri, men kan kreve noen optimalisering protokoll. Det er viktig å merke seg at noen epitoper som kan bli påvirket av de spesifikke dissosiasjons, fiksering og permeabilisering behandlinger som anvendes, og disse fremgangsmåtene kan være nødvendig å gjennomgå sample-spesifikke optimalisering. Ved lavt signal ble observert i et antistoff, kan det være mulig å forbedre ved å utføre celleoverflate-merkingen på levende celler, endre permeabilisering metoder, eller minkende fiksering tid.

Når det er mulig innenfor eksperimentell design, inkludert barcoding i the Prøven behandling arbeidsflyt sikrer konsistens mellom prøver på nivået av celle og antistoffkonsentrasjon. Uten strekkoding, selv om den største forsiktighet utvises for å regulere type behandling, er det sannsynlig at små variasjoner i antistoffkonsentrasjonen, og cellekonsentrasjonen vil bli innført mellom prøvene. Videre, ettersom prosentandelen av celler som er positive for spesifikke epitoper vil sannsynligvis variere mellom prøvene, den effektive antistoff-til-epitop-forholdet kan være forskjellig mellom prøver, selv om den totale antistoffkonsentrasjonen holdes konsekvent, kan føre til uregelmessigheter i antistoff-farging. Disse variasjoner, selv om de generelt mindre når observerer en enkelt kanal, kan bli betraktelig forsterket ved utføring av en høy-parameter eksperiment og kan mistolkes som biologisk meningsfylt hvis behandling er ikke tatt i løpet av dataanalyse.

Analyse av de resulterende data fra en masse-cytometri eksperiment kan ta mange former, og en rekke computaelle tilnærminger har blitt tilpasset spesielt for dette programmet. Samtidig som det gir en fullstendig oversikt over anvendelige algoritmer for masse cytometri dataanalyse er utenfor rammen av dette manuskriptet, er fremgangsmåter som har blitt benyttet markert og interesserte lesere er rettet mot flere ressurser som dekker dette emnet 21, 22, 23. To av de mest anvendte, tilgjengelige metoder for analyse av masse cytometri data er Spanning Tree Progresjon av tetthet normal Events (Spade) og viSNE. SPADE danner klynger fra grupper av celler med lignende markør uttrykk og representerer hver klynge som en node. Disse nodene er ordnet i en spade tre hvor tilsvarende noder er forbundet med en linje (figur 3G). viSNE anvender t-Distributed Stochastic Nabo Inkludering algoritme 24 for å frembringe en to-dimensjonal representasjon avde høye dimensjonsdata og samtidig bevare den totale datastrukturen. Både SPADE og viSNE er skrevet i Matlab, er kildekoden fritt tilgjengelig og kan kjøres av brukere med MATLAB. I tillegg er en frittstående versjon av SPADE er tilgjengelig.

Mens massen cytometri for tiden tillater samling av det høyeste antall parametere, kan fluorescerende tag basert cytometri være en bedre tilnærming for noen anvendelser. Fluorescens flowcytometri kan analysere flere celler per sekund, opp til 5 x 10 4 i forhold til 500-1000 for masse-cytometri, og har mer tilgjengelig validert antistoffer 25. Ytterligere fremskritt i fluorescens strømningscytometri, som hyperspektralt cytometri 26 og nye fluoroforer 27 make fluorescens flowcytometri et levedyktig alternativ for alle, men meget høye parameter eksperimenter. Ytterligere teknikker som for eksempel måling av RNA 28 som tidligere bare var muligved fluorescens basert strømningscytometri har nylig blitt tilpasset til massen cytometri tillater samtidig påvisning av protein og RNA-29. Fremtidig utvidelse av tilgjengelige isotoper og reagenser for mer fullstendig å utnytte massen vinduet i målbare isotoper og utvide repertoaret av målbare cellulære egenskaper vil utvide dybden av profilerings mulig ved masse-cytometri.

Det store antall parametere som kan bli analysert samtidig ved masse cytometri i stor grad utvider de eksperimentelle spørsmål som kan undersøkes. Vi håper at denne artikkelen og tilhørende video-protokollen vil gjøre det mulig interesserte forskere til mer effektivt utnytte masse cytometri å fremme sin forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mTeSR1 medium kit Stem Cell technologies 05850 Warm at room temperature before use
DMEM F-12 ThermoFisher 11330-032 Warm at 37 °C before use
Accutase Stem Cell technologies 07920 Warm at 37 °C before use
Bovine serum albumin Equitech BAH62
phosphate buffered saline Hyclone SH30256.01
Saponin Sigma-Aldrich 47036
Cell ID Pt194 Fluidigm Provided at 1 mM
Cell ID Pt195 Fluidigm Provided at 1 mM
Cell ID Pt196 Fluidigm Provided at 1 mM
Cisplatin Enzo Life Sciences ALX-400-040-M250 Soluble to 25 mg/mL in DMSO
Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit Fluidigm 201060
5-Iodo-2'-deoxyuridine Sigma-Aldrich I7125 Soluble to 74 mg/mL in 0.2 N NaOH
Rhodium 103 intercelating agent Fluidigm 201103A
Methanol Fisher BP1105-4 Chill at -20 °C before use
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002
5 mL round bottom tubes Falcon 352058
5 mL 35 μm filter cap tubes Falcon 352235
EQ four element calibration beads Fluidigm 201078
Hyaluronidase Type I-S Sigma-Aldrich H3506
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C9891
Disposable Scalpel #10 Sigma-Aldrich Z69239

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. J Vis Exp. , e4398 (2012).
  2. Leipold, M. D. Another step on the path to mass cytometry standardization. Cytometry A. 87, 380-382 (2015).
  3. Newell, E. W., et al. Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization. Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).
  4. Leong, M. L., Newell, E. W. Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).
  5. Zunder, E. R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).
  6. Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry A. 87, 369-374 (2015).
  7. Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).
  8. Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry A. 81, 467-475 (2012).
  9. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3, 361-368 (2006).
  10. Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81, 552-566 (2012).
  11. Edgar, L. J., et al. Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry. Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).
  12. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
  13. Horowitz, A., et al. Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry. Sci Transl Med. 5, 208ra145 (2013).
  14. Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry. Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).
  15. Han, L., et al. Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells. Cytometry A. 87, 346-356 (2015).
  16. Bendall, S. C., et al. Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development. Cell. 157, 714-725 (2014).
  17. Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).
  18. Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).
  19. Behbehani, G. K., et al. Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining. Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).
  20. Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83, 483-494 (2013).
  21. Chester, C., Maecker, H. T. Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data. J Immunol. 195, 773-779 (2015).
  22. Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data. Methods. 82, 55-63 (2015).
  23. Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).
  24. van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizaing Data using t-SNE. J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).
  25. Kling, J. Cytometry: Measure for measure. Nature. 518, 439-443 (2015).
  26. Gregori, G., et al. Hyperspectral cytometry. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).
  27. Chattopadhyay, P. K., et al. Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments. Cytometry A. 81, 456-466 (2012).
  28. Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).
  29. Frei, A. P., et al. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nat Methods. 13, 269-275 (2016).

Tags

Cellular Biology Mass cytometri enkelt celle barcoding multipleksing multiparametrisk
Prøvepreparering for Mass Cytometry Analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCarthy, R. L., Duncan, A. D.,… More

McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. J. Vis. Exp. (122), e54394, doi:10.3791/54394 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter