Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Nabootsen van de Functie van de signaaleiwitten: Toward Kunstmatige Signaaltransductie Therapy

Published: September 29, 2016 doi: 10.3791/54396
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Organic Chemistry, Weizmann Institute of Science

Introduction

Signaaltransductiewegen spelen een belangrijke rol in vrijwel elk celprocessen en de cel reageert snel te reageren op signalen uit de omgeving. 1 Deze trajecten worden vaak veroorzaakt door de binding van een signalerende molecule aan een extracellulaire receptor, hetgeen resulteert in activatie van intracellulaire enzymen. Amplificatie en vermeerdering van dit signaal in de cel wordt gemedieerd door de werking van signaaleiwitten die een netwerk van eiwit-eiwit interacties waarbij enzymen reversibel zijn geactiveerd met hoge specificiteit te vormen. Vanwege ontregeling van deze netwerken vaak leidt tot de ontwikkeling van kanker, is er veel belangstelling voor oprichting van 'signaaltransductie behandeling van kanker', 2 waarbij drugs zijn ontworpen om kwaadaardige signaalwegen verstoren geweest. We hebben onlangs voorgesteld een alternatieve benadering van transductie therapie die berust op het vermogen van geneesmiddelen om onnatuurlijke signaaltransductiewegen genereren signaal.

Om de uitvoerbaarheid van deze benadering tonen, hebben wij onlangs een synthetisch "chemisch transducer 4 dat bloedplaatjes afkomstige groeifactor (PDGF) maakt de splitsing van een kanker prodrug activeren door het activeren van glutathion-s-transferase (GST), wat niet zijn natuurlijke bindende partner. De structuur van deze 'transducer bestaat uit een anti-PDGF DNA aptameer dat is gemodificeerd met een tweewaardige remmer voor GST. Vandaar dit synthetische stof behoort tot een familie van moleculen met bindingsplaatsenverschillende eiwitten, 5-7 zoals chemische inductoren van dimerisatie (CID) 8-10 alsmede de zogenaamde eiwit-bindmiddel op basis van synthetische oligonucleotide-molecuul conjugaten. 11-21

De algemene beginselen van het ontwerpen van dergelijke systemen wordt hierin beschreven en gedetailleerde protocollen voor het synthetiseren en testen van de functie van dit 'transducer met gebruikelijke enzymatische assays worden voorzien. Dit werk ter vergemakkelijking ontwikkelen van aanvullende 'transducers' van deze klasse, die kunnen worden gebruikt om intracellulair eiwit-eiwit mediëren communicatie en dus aan kunstmatige cel signaalwegen induceren.

Figuur 1 beschrijft schematisch de werkingsprincipes van synthetische "chemische transducers 'dat onnatuurlijke eiwit-eiwit communicatie kan mediëren. In deze illustratie, een "chemische transducer, die synthetische bindmiddelen voor prot integreerteins I en II (bindmiddelen I en II), zodat het eiwit II katalytische activiteit van proteïne I, die niet de natuurlijke bindingspartner veroorzaken. Aangezien eiwit II, de omzetter verbindt de katalytische plaats van het enzym (eiwit I) en remt zijn activiteit (figuur 1, staat ii). De binding van de "transducer eiwit II echter bevorderen van de wisselwerkingen tussen bindmiddel I en het oppervlak van eiwitten II (figuur 1, staat iii) die zijn affiniteit richting eiwit I. de effectieve concentratie van minder Hierdoor de ' vrije 'transducer in de oplossing wordt gereduceerd, hetgeen leidt tot dissociatie van het transducer-eiwit I complex en reactivering van eiwit I (figuur 1, staat iv). Tezamen bieden deze stappen te markeren drie fundamentele uitgangspunten van het ontwerp van een efficiënte 'transducers': (1) een 'transducer' moet een specifieke binder hebben voor elk van de eiwit targets, (2) de interactie between bindmiddel II en eiwit II moet sterker dan de wisselwerking tussen bindmiddel I en I eiwit, en (3) binder I moet kunnen aangaan met het oppervlak van eiwitten II zijn. Dit laatste beginsel niet noodzakelijkerwijs dat bindmiddel ik alleen zou een hoge affiniteit en selectiviteit in de richting van eiwitten II hebben. In plaats daarvan is het gebaseerd op onze recente studies waaruit bleek dat het brengen van een synthetisch molecuul in de nabijheid van een eiwit waarschijnlijk interactie tussen deze moleculen en het oppervlak van het proteïne bevorderen. 19,22,23

Figuur 1

Figuur 1:. Werkingsprincipes van "chemische transducers 'Wanneer de" chemische transductor "toegevoegd actief eiwit I (toestand i), het bindt aan de actieve site via bindmiddel I en remt zijn activiteit (state ii). In de aanwezigheid van eiwit II echter de ongebonden 'chemische transducer "interageert met eiwit II tot bindmiddel II, die interacties tussen bindmiddel I en het oppervlak van eiwitten II bevordert. Dit veroorzaakte bindmiddel I-eiwit II interactie vermindert de effectieve concentratie van bindmiddel I, wat leidt tot dissociatie van het 'transducer'-eiwit I complex en eiwit I reactivering (state iv). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Synthese van de 'Chemical Transducer'

  1. voorlopige Voorbereidingen
    1. Bereid 2 M triethylammoniumacetaat (TEAA) buffer door het mengen van 278 ml triethylamine met 114 ml azijnzuur en 400 ml ultrazuiver water. Breng de pH op 7 en voeg water tot een eindvolume van 1 L. Hou het in een donkere fles.
      Opmerking: Deze oplossing is jarenlang.
    2. Bereid een 5 mM ascorbinezuur oplossing door het oplossen van 18 mg ascorbinezuur in 20 ml ultrazuiver water. Gebruik een verse oplossing; de oplossing is een dag.
    3. Bereid een (II) tris (benzyltriazolylmethyl) amineoplossing 10 mM Cu / (TBTA) door het oplossen van 25 mg koper (II) sulfaat pentahydraat in 10 ml ultrazuiver water en 58 mg TBTA in 11 ml dimethylsulfoxide (DMSO). Meng de twee oplossingen. Hou het bij kamertemperatuur en het te beschermen tegen licht.
  2. vervoeging Procedure
    1. Oplossen 100 nmol van het gemodificeerde oligonucleotide (ODN-1) in 80 glvers ultrapuur water. Voeg 20 ul van 2 M TEAA, pH = 7. Voeg 80 ul van een vers bereide oplossing van ascorbinezuur (5 mM in water).
    2. Dissolve 1,5 umol (574,5 g) van-azido gemodificeerd ethacrynzuur in 180 ul DMSO toevoegen aan de oplossing. Ontgas de oplossing met argon gedurende 60 seconden en snel toevoegen 40 ui van het Cu (II) / TBTA oplossing (10 mM in 55% (v / v) DMSO / water).
    3. Spoel opnieuw met Argon, dicht strak, en roer 's nachts.
    4. De voortgang van de reactie en zuiver het conjugaat door RP-HPLC (mobiele fase: A) 5% acetonitril, 5% TEAA, 90% ultrazuiver water; B) 65% Acetonitril, 5% TEAA, 30% ultrapuur water). 24

2. Controlling GST activiteit van PDGF

  1. voorlopige Voorbereidingen
    1. Bereid 50 ml van de Assay buffer door het mengen van 33,9 ml van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBSx1) met 16,1 ml ultrapuur water om een ​​8 mm uiteindelijke fosfaat concentratie en ad bereikend 23,8 mg MgCl 2 een 5 mM eindconcentratie te bereiken.
    2. Bereid een voorraadoplossing van GST M1-1 door oplossen van het eiwit in een buffer die 50 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol (DTT) en 5 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) tot een eindconcentratie van 30 uM. Verdeel deze oplossing in kleine porties en bewaar bij -80 ° C. Verdunnen vers, overeenkomstig punt 2.1.5.1, in de Assay buffer en blijf op ijs.
      Opmerking: De oplossing is voor ongeveer 5 uur, of totdat er een vermindering van de enzymactiviteit.
    3. Bereid de substraat volgens de volgende instructies:
      1. Los 10 mg van gereduceerd glutathion (GSH) in 325 gl ultrazuiver water tot een eindconcentratie van 100 mM voorraadoplossing. Verdun 21 pi van deze voorraadoplossing in 979 gl Assay buffer voor een eindconcentratie van 2,1 mM werkoplossing.
      2. Los 10 mg van 2,4-dinitrochloorbenzeen (CDNB) in 492 pl ethanol tot een eindconcentratie van 100 mM voorraadoplossing. Verdun 43,2 pl van voorraadoplossing in 956,8 gl Assay buffer tot een eindconcentratie van 4,32 mM werkoplossing.
    4. In een 96-well plaat, zet elke substraat in een aparte lijn (12 wells). Plaats ten minste 60 ul in elk putje om snel en gemakkelijk de intrekking van de oplossing mogelijk te maken. Bedek de plaat met een aluminium plaat voor lichte bescherming.
    5. Bereid de volgende voorraad oplossingen in de Assay buffer:
      1. Verdun GST M1-1 per 50 tot een eindconcentratie van 0,6 uM van het dimeer.
      2. Verdun de 'chemische transducer' om een ​​30 uM voorraad oplossing.
      3. Verdun PDGF tot een uiteindelijke concentratie van 40 uM.
      4. Verdun PDGF aptameer tot een uiteindelijke concentratie van 250 uM.
  2. Meet de GST activiteit in de aanwezigheid van de 'chemische transducer' en PDGF.
    1. Het opzetten van een experimentele procedure in de plaat lezer voor kinetische meting.
      1. Maak een nieuw experiment als een 'standaard protocol'.
      2. Druk op 'procedure' om de openstelling van het raam procedure instellingen.
      3. In de pop-up lijst aan de bovenkant van het venster, kies het type '384 plaat' volgens de fabrikant plaat.
      4. Druk op 'lezen' op het linker menu.
      5. Ten aanzien van de detectiemethode kies 'Absorptie'.
      6. Ten aanzien van de lees soort kiezen voor 'eindpunt'.
      7. Voeg 340 nm van de golflengte venster.
      8. Druk op de 'volledige plaat' bottom op de rechterbovenhoek en kies het goed te meten.
      9. Druk op 'ok' het venster te sluiten 'lezen'.
      10. Kies 'start kinetische' op het linker menu.
      11. Maak de looptijd 10 min.
      12. Selecteer de optie minimum intervallen.
      13. Druk op 'OK' om de kinetische venster te sluiten.
      14. Sleep de 'Read' lijn into de kinetische meting.
      15. Druk op de 'valideren' knop en vervolgens op de knop 'OK'.
      16. Sla het experiment.
      17. Druk op de knop 'play'. Een dialoogvenster verschijnt - drukt alleen de 'ok' knop wanneer de meting moet worden gestart.
    2. Om het experiment triplo uitgevoerd Bereid vier monsters elk 3,25 pi van het "chemische transducer en 3,25 pi GST M1-1. Naar elk monster 0, 1,2, 2,4 of 4,9 pl PDGF en 123,5, 122,3, 121,1 of 118,6 pl van de test buffer, respectievelijk.
    3. Incubeer de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
    4. In een 384-putjes doorzichtige Plaats 40 gl monster toe aan elk putje. Plaats de monsters alleen in de oneven putten of alleen de even putten in dezelfde lijn voor het gebruik van een multi-pipet voor substraattoevoeging mogelijk.
    5. Met behulp van een 12-kanaals multi-pipet snel voeg 10 ul van elk van tHij substraten die werden vooraf bereid in de 96-well plaat (sectie 2.1.4). Meng voorzichtig en snel naar luchtbellen te vermijden. Plaats de plaat in de lezer en start de kinetische meting. Aangezien GST kinetiek is vrij snel, proberen om de tijd tussen substraat toevoeging en het begin van de kinetische metingen te minimaliseren.
  3. GST Activering / Remming Cycles gemedieerd door de 'chemische transducer'.
    1. Om het experiment triplo uitgevoerd, bereid 5 monsters met elk 84,5 gl Assay buffer, 3,25 pl "chemische transducer en 3,25 pi GST M1-1. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 min.
    2. Voeg 3,65 gl testbuffer monsters 1 en 3,65 pl PDGF monsters 2-5. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 min.
    3. Voeg 3,12 gl testbuffer monsters 1-2 en 3,12 pl PDGF aptameer monsters 3-5. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 min.
    4. Voeg 24,4 ul assaybuffer monsters1-3 en 24,4 pl PDGF monsters 4-5. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 min.
    5. Voeg 7,8 gl testbuffer monsters 1-4 en 7,8 pl PDGF aptameer monsters 5. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
    6. In een 384-transparante well plaat, steekt 40 ul van het monster in elk putje. Insert monsters alleen in de oneven of slechts in de putjes zelfs in dezelfde lijn.
    7. Met behulp van een 12-kanaals multi-pipet snel toevoegen 10 ui van elk substraat (vooraf bereid in de 96-well plaat). Meng voorzichtig en snel naar luchtbellen te vermijden. Plaats de plaat in de lezer en start de kinetische meting.
    8. Bereken de V 0 [mOD / min] onder elke conditie door aftrekking van de OD gemeten bij 340 nm bij t = 0,5 min van de OD gemeten bij 340 nm bij t = 1,5 min de activatie / inhibitie recyclebaarheid beoordelen. 25
  4. Evalueer de Real-time Reactie van de 'chemische transducer om veranderingen in de omgeving.
      <li> Real-time effect van PDGF aanvulling
      1. Opzetten van een experimentele procedure in de plaat lezer voor kinetische meting.
      2. Herhaal stap 2.2.1.1-2.2.1.10.
      3. Maak de looptijd 3,5 min.
      4. Selecteer de optie minimum intervallen.
      5. Druk op 'OK' om de kinetische venster te sluiten.
      6. Sleep de 'Read' lijn in de kinetische meting.
      7. Kies Plate Out / In in het linker menu.
      8. Kies de optie 'plaat uit (geen venster)'.
      9. Kies de optie 'Delay' op het linker menu en voer 30 sec.
      10. Kies Plate Out / In in het linker menu.
      11. Kies de optie 'plaat (geen dialoogvenster)'.
      12. Maak een tweede kinetische meting door herhalen van de stappen 2.2.1.4 - 2.2.1.14 maar in paragraaf 2.2.1.11 zet de bewegingsenergie om 25 min in plaats van 10 min.
      13. Druk op de 'valideren' knop en vervolgens op de knop 'OK'.
      14. Sla het experiment.
      15. Druk op de 'play 'knop. Een dialoogvenster verschijnt - drukt alleen de 'ok' knop wanneer de meting moet worden gestart.
      16. Bereid twee monsters door het mengen van 1 pi GST M1-1 en 1 pl van het "chemische transducer in 38 pl testbuffer. Plaats de monsters in twee putjes van een 384-transparante well plaat, waardoor er een lege goed tussen deze twee putten.
      17. Met behulp van een 12-kanaals multi-pipet snel 10 ui toe van elk substraat, meng voorzichtig en snel naar luchtbellen te vermijden, plaatst u de plaat in de lezer en start de kinetische meting.
      18. Wanneer de plaat opent (na 3,5 min) snel 1,125 pl PDGF aan één van de putjes, meng voorzichtig en laat de plaat te sluiten voor de resterende kinetische metingen.
    1. Real-time effect van het toevoegen van de PDGF aptameer
      1. Herhaal stap 2.4.1.1-2.4.1.15.
      2. Bereid twee monsters door het mengen van 1 pl GST M1-1, 1 ui van het "chemische transducer en 1,125 pl PDGF in 36,9 gl assaybuffer. Plaats de monsters in twee putjes van een 384-transparante well plaat, waardoor er een lege goed tussen deze twee putten.
      3. Met behulp van een 12-kanaals multi-pipet snel 10 ui toe van elk substraat, meng voorzichtig en snel naar luchtbellen te vermijden, plaatst u de plaat in de lezer, en start de kinetische meting.
      4. Wanneer de plaat opent (na 1,5 min) snel 1,2 pl PDGF aptameer aan één van de putjes, meng voorzichtig en laat de plaat te sluiten voor de resterende kinetische metingen.
  5. Meet JS-K Prodrug Activering door GST in de tegenwoordigheid van de 'chemische transducer' en PDGF.
    1. Opzetten van een experimentele procedure in de plaat lezer voor kinetische meting.
      1. Maak een nieuw experiment als een 'standaard protocol'.
      2. Druk op 'procedure' om de openstelling van het raam procedure instellingen.
      3. In de pop-up lijst aan de bovenkant van het venster kies type '384 plaat' volgens de fabrikant plaat.
      4. Druk op 'lezen' op het linker menu.
      5. Wat de detectiewerkwijze gekozen "Absorptie".
      6. Ten aanzien van de lees soort kiezen voor 'eindpunt'.
      7. Voeg 305 nm van de golflengte venster.
      8. Druk op de 'volledige plaat' knop op de rechterbovenhoek en kies het goed te meten.
      9. Druk op 'ok' het venster te sluiten 'lezen'.
      10. Kies 'start kinetische' op het linker menu.
      11. Maak de looptijd 10 min.
      12. Selecteer de optie minimum intervallen.
      13. Druk op 'OK' om de kinetische venster te sluiten.
      14. Sleep de 'Read' lijn in de kinetische meting.
      15. Druk op de 'valideren' knop en vervolgens op de knop 'OK'.
      16. Sla het experiment.
      17. Druk op de knop 'play'. Een dialoog box verschijnt - drukt alleen de 'ok' knop wanneer de meting moet worden gestart.
    2. Voor NO productie metingen gebruiken een nitriet / nitraat calorimetrische kit. In een 96-well plaat voegen 50 pl assaybuffer in een rij, 70 ui Griess reagens I in een tweede rij en 70 gl II Griess reagens in een derde rij.
    3. Om het experiment triplo uitgevoerd Bereid vier monsters die elk 4,8 ui van de "chemische transducer. Om te proeven 1, voeg 155,2 ul van Assay buffer; te proeven 2, voeg 3,2 ul van GST-M1-1 en 152 ul van Assay buffer; monsters 3, voeg 9,6 pl PDGF en 145,6 ul assaybuffer; en monster 4, voeg 3,2 gl GST-M1-1, 9,6 pl PDGF en 142,4 pl testbuffer.
    4. Incubeer de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
    5. In een 384-transparante well plaat, steekt 50 ui van het monster in elk putje. Insert monsters alleen in de oneven of slechts inzelfs putten in dezelfde lijn voor het gebruik van een multi-pipet voor substraattoevoeging mogelijk.
    6. Voeg 0,54 pl JS-K (5 mM in DMSO) aan elke well.
    7. Met behulp van een 12-kanaals multi-pipet snel voeg 10 ul van het GSH oplossing (vooraf bereid in de 96-well plaat), meng voorzichtig en snel om luchtbellen te vermijden. Plaats de plaat in de lezer en start de kinetische meting.
    8. Onmiddellijk na de kinetische meting met behulp van een 12-kanaals multi-pipet, neem 50 gl van elk monster in de testbuffer rij in de voorbereide 96-well plaat en snel toe te voegen 50 pi Griess I reagens en 50 pi Griess reagens II. Incubeer en beschermt tegen licht gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en meet de absorptie bij 550 nm.
      Opmerking: De assay buffer en reagentia volumes afhankelijk protocol van de kit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het ontwerp, de synthese en het werkingsmechanisme van een "chemische transducer dat kunstmatige communicatie tussen PDGF en GST kunnen induceren zijn weergegeven in figuur 2. De structuur van de" transducer integreert een PDGF DNA aptameer en een bis-ethacrynic amide (BEA ), die reeds bekend GST remmer (figuur 2a). 19 Deze bindmiddelen programmaonderdeel "transducer zowel PDGF en GST met verschillende affiniteiten, namelijk binden met dissociatieconstanten (kd 's) van 26 nM en 144 nM . 4 Daarnaast is volgens dit ontwerp, de binding aan PDGF dienen niet-specifieke interacties tussen het BAO apparaat en het oppervlak van PDGF, die duidelijk de potentie van het BAO remmer zou verminderen induceren. 19,22,23 Figuur 2b illustreert de bedieningsmechanisme onderliggende dit systeem. Na toevoeging van de 'transducer een actieve GST, detwee EA units tegelijkertijd te binden zowel de actieve plaatsen van dit dimeer enzym en remt de activiteit. In aanwezigheid van PDGF echter een PDGF-'transducer-complex wordt gevormd, waarbij het BAO apparaat voorkomt remming van GST. Dit leidt derhalve tot de dissociatie van het GST-'transducer 'complex en GST reactivering. GST kan dan opnieuw worden geremd door toevoeging van een niet-gemodificeerde aptameer PDGF dat de "chemische transducer verplaatst en maakt het GST weer remmen.

Het vermogen van PDGF om GST activiteit te controleren werd eerst aangetoond door meting GST (10 nM) activiteit en zonder de "chemische transducer (500 nM) en meten van de activiteit van de GST-'chemical transducer complex in de aanwezigheid van verschillende concentraties PDGF (250, 500 en 1000 nM) (Figuur 3a). Na te hebben vastgesteld dat de 'chemische transducer' induceert kunstmatige PDGF-GST communicatie, wevervolgens vastgesteld dat deze kunstmatige mededeling, vergelijkbaar met de signaaltransductie stappen, is omkeerbaar en snel aanpast aan veranderingen in de omgeving. Reversibele activatie / inhibitie van GST werd uitgevoerd door achtereenvolgende toevoegingen van PDGF en PDGF-gemodificeerde aptameer aan het GST-'chemical transducer complex (figuur 3b). De reactie van het systeem real-time veranderingen in zijn omgeving werd geëvalueerd door het meten GST activiteit tijdens het toevoegen van de verschillende ingangen. Een snelle toename van de GST activiteit werd waargenomen na de toevoeging van PDGF (750 nM) aan de GST-'transducer-complex (10 nM en 500 nM) 3,5 minuten na toevoegen van substraat (figuur 4a). Ook een afname GST activiteit werd waargenomen na de toevoeging van PDGF aptameer (5 uM) aan een mengsel van GST (10 nM), PDGF (750 nM), en de "chemische transducer (500 nM) (Figuur 4b).

Fot slot, we werd aangetoond dat een dergelijk systeem prodrug activatie controleren in reactie op veranderingen in de omgeving. JS-K een kanker prodrug geactiveerd door GST toxische NO (Figuur 5a) vrijkomen. De hoeveelheid NO vrijgegeven na toevoeging van JS-K (45 uM) aan de "chemische transducer (750 nM) en verschillende combinaties van GST (10 nM) en PDGF (2 uM) werden gemeten (figuur 5b), hetgeen bevestigt dat alleen de aanwezigheid van zowel GST en PDGF leidt tot prodrug activering.

Figuur 2
Figuur 2. "Chemical transducer -. Synthese en bedieningsmechanisme (a) Onder" chemische transducer bestaat uit een PDGF aptameer, een bivalent ethacrynic amide (EA) GST inhibitor, een fluorofoor (FAM) en een quencher (Dabcyl) . Het aptameer-inhibitor conjugaatwordt gesynthetiseerd door het bevestigen van een azide gemodificeerde ethacrynic amide (EA) derivaat een dialkyne gemodificeerd en fluorescent gelabelde DNA aptameer (ODN-1). Herdrukt met toestemming van referentie 4. (B) De enzymatische activiteit van GST wordt geremd door de "chemische transducer, werd door de binding van de EV groepen actieve plaatsen van het enzym. Toevoeging van PDGF leidt tot de vorming van de PDGF-'chemical transducer complex, dat het verstoort "transducer' GST-interactie, derhalve het herstellen van de enzymatische activiteit. De volgende toevoeging van een niet-gemodificeerde PDGF aptameer geeft de 'chemische transducer' en maakt het mogelijk om opnieuw te remmen het enzym. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Fi. guur 3: PDGF-gecontroleerde GST activiteit (a) GST (10 nM) enzymatische activiteit met (-) en afwezigheid (-) van de "chemische transducer (500 nM), en in aanwezigheid van de" chemische transductor (500 nM) met toenemende concentraties (250, 500 of 1000 nM) van PDGF (---). (B) remming-activeringscycli GST enzymatische activiteit gemanifesteerd door veranderingen van de beginsnelheid (V 0) in reactie op achtereenvolgende toevoegingen (IIV) van PDGF en PDGF-gemodificeerde aptameer aan het GST-'chemical transducer complex: (i) geen, (II) PDGF (750 nM), (III) PDGF aptameer (4 uM), (IV ) PDGF (5 uM) en (V) PDGF aptameer (10 uM). De grafiek geeft de gemiddelde ± stdev van drievoud. Re-bedrukt met toestemming van referentie-4. Klik hier voor een grotere weergave versie van deze figuur.

figuur 4
. Figuur 4: Real-time controle van GST activiteit (a) verhoging van de GST enzymatische activiteit waargenomen onmiddellijk na de toevoeging van 750 nM PDGF (-) aan een oplossing die GST (10 nM) en "chemische transducer (500 nM) ( -) bij t = 3,5 min. (B) toevoeging van een ongemodificeerde PDGF aptameer (5 uM) (-) aan een oplossing die GST (10 nM), PDGF (750 nM), en de "chemische transducer (500 nM) (-) bij t = 1,5 min leidt tot een onmiddellijke afname van de enzymatische reactiesnelheid. Re-bedrukt met toestemming van referentie-4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5 "src =" / files / ftp_upload / 54396 / 54396fig5.jpg "/>
Figuur 5:. Controlled prodrug activering (a) activering van GST JS K-giftige prodrug NO vrijkomen. (B) de NO in aanwezigheid van de "chemische transductor en verschillende combinaties van GST (10 nM) en PDGF (2 uM). De grafiek geeft de gemiddelde ± stdev van drievoud. Gewijzigd met toestemming van referentie-4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd gesteund door de Minerva Foundation, de HFSP Organisatie, en een European Research Council Grant (Starting Grant 338.265).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-chloro-2,4-dinitrobenzene Sigma-Aldrich 237329
Acetic acid Bio Lab 01070521
Acetnitrile J.T.Baker 9017-03
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544
Copper(II) Sulfate pentahydrate Merck-Millipore 102790
Dimethyl sulfoxide Merck-Millipore 802912
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Biological Industries 02-023-5A
Ethacrynic acid Tokyo Chemical Industry Co. Ltd E0526
Glutathione-s-transferase M1-1 Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)
JS-K Sigma-Aldrich J4137
L-glutathione reduced Sigma-Aldrich G4251
Magnesium Chloride J.T.Baker 0162
nitrate/nitrite colorimetric assay kit Cayman Chemical 780001
Oligonucleotides W. M. Keck Foundation Biotechnology at Yale University custom order
PDGF-BB Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)
TBTA Sigma-Aldrich 678937
Triethylamine Sigma-Aldrich T0886
Desalting column GE Healthcare illustra MicroSpin G-25 Columns
HPLC Waters  2695 separation module
HPLC column Waters XBridgeTM OST C18 column (2.5 μM, 4.6 mm × 50 mm)
HPLC column Waters XBridgeTM OST C18 column (2.5 μM, 10 mm × 50 mm)
Plate reader BioTek synergy H4 hybrid

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hunter, T. Signaling—2000 and Beyond. Cell. 100, 113-127 (2000).
  2. Levitzki, A., Klein, S. Signal transduction therapy of cancer. Mol Aspects Med. 31, 287-329 (2010).
  3. Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. Artificial signal transduction therapy: a futuristic approach to disease treatment. Future Med. Chem. 7, 2091-2093 (2015).
  4. Peri-Naor, R., Ilani, T., Motiei, L., Margulies, D. Protein-Protein Communication and Enzyme Activation Mediated by a Synthetic Chemical Transducer. J. Am. Chem. Soc. 137, 9507-9510 (2015).
  5. Corson, T. W., Aberle, N., Crews, C. M. Design and Applications of Bifunctional Small Molecules: Why Two Heads Are Better Than One. ACS Chem. Biol. 3, 677-692 (2008).
  6. Rutkowska, A., Schultz, C. Protein Tango: The Toolbox to Capture Interacting Partners. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8166-8176 (2012).
  7. Meyer, C., Köhn, M. A Molecular Tête-à-Tête Arranged by a Designed Adaptor Protein. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8160-8162 (2012).
  8. Klemm, J. D., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Dimerization as a Regulatory Mechanism in Signal Transduction. Annu. Rev. Immunol. 16, 569-592 (1998).
  9. DeRose, R., Miyamoto, T., Inoue, T. Manipulating signaling at will: chemically-inducible dimerization (CID) techniques resolve problems in cell biology. Pflugers Arch. 465, 409-417 (2013).
  10. Gestwicki, J. E., Marinec, P. S. Chemical control over protein-protein interactions: beyond inhibitors. Comb. Chem. High Throughput. Screen. 10, 667-675 (2007).
  11. Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding. Supramol. Chem. 25, 848-862 (2013).
  12. Diezmann, F., Seitz, O. DNA-guided display of proteins and protein ligands for the interrogation of biology. Chem. Soc. Rev. 40, 5789-5801 (2011).
  13. Röglin, L., Ahmadian, M. R., Seitz, O. DNA-Controlled Reversible Switching of Peptide Conformation and Bioactivity. Angew. Chem. Int. Ed. 46, 2704-2707 (2007).
  14. Röglin, L., Altenbrunn, F., Seitz, O. DNA and RNA-Controlled Switching of Protein Kinase Activity. ChemBioChem. 10, 758-765 (2009).
  15. Harris, D. C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. DNA-Small Molecule Chimera with Responsive Protein-Binding Ability. J. Am. Chem. Soc. 130, 14950-14951 (2008).
  16. Harris, D. C., Saks, B. R., Jayawickramarajah, J. Protein-Binding Molecular Switches via Host-Guest Stabilized DNA Hairpins. J. Am. Chem. Soc. 133, 7676-7679 (2011).
  17. Kim, Y., Cao, Z., Tan, W. Molecular assembly for high-performance bivalent nucleic acid inhibitor. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5664-5669 (2008).
  18. Han, D., et al. A Logical Molecular Circuit for Programmable and Autonomous Regulation of Protein Activity Using DNA Aptamer-Protein Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 20797-20804 (2012).
  19. Motiei, L., Pode, Z., Koganitsky, A., Margulies, D. Targeted Protein Surface Sensors as a Tool for Analyzing Small Populations of Proteins in Biological Mixtures. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 9289-9293 (2014).
  20. Ranallo, S., Rossetti, M., Plaxco, K. W., Vallée-Bélisle, A., Ricci, F. A Modular, DNA-Based Beacon for Single-Step Fluorescence Detection of Antibodies and Other Proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 54, 13214-13218 (2015).
  21. Franzini, R. M., et al. Identification of Structure-Activity Relationships from Screening a Structurally Compact DNA-Encoded Chemical Library. Angew. Chem. Int. Ed. 54, 3927-3931 (2015).
  22. Unger-Angel, L., et al. Protein recognition by bivalent, 'turn-on' fluorescent molecular probes. Chem. Sci. 6, 5419-5425 (2015).
  23. Nissinkorn, Y., et al. Sensing Protein Surfaces with Targeted Fluorescent Receptors. Chem. Eur. J. 21, 15981-15987 (2015).
  24. Huber, C. G., Oefner, P. J., Bonn, G. K. High-Resolution Liquid Chromatography of Oligonucleotides on Nonporous Alkylated Styrene-Divinylbenzene Copolymers. Anal. Biochem. 212, 351-358 (1993).
  25. Lyon, R. P., Hill, J. J., Atkins, W. M. Novel class of bivalent glutathione S-transferase inhibitors. Biochemistry. 42, 10418-10428 (2003).
  26. Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding. Supramol. Chem. , 1-16 (2013).

Tags

Biochemie Kunstmatige signaaltransductie doelgerichte medicijnafgifte biomimetische chemie synthetisch eiwit receptoren chemische biologie DNA-gebaseerde proteïne receptoren schakelbare eiwit bindmiddelen
Nabootsen van de Functie van de signaaleiwitten: Toward Kunstmatige Signaaltransductie Therapy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peri-Naor, R., Motiei, L.,… More

Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy. J. Vis. Exp. (115), e54396, doi:10.3791/54396 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter