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Biochemistry

Imitant la fonction des protéines de signalisation: Vers Artificial Signal Therapy transduction

Published: September 29, 2016 doi: 10.3791/54396
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Organic Chemistry, Weizmann Institute of Science

Introduction

Les voies de transduction du signal jouent un rôle important dans pratiquement tous les processus cellulaire et permettent à la cellule de répondre rapidement à des signaux environnementaux. 1 Ces voies sont souvent déclenchées par la liaison d'une molécule de signalisation à un récepteur extracellulaire, ce qui se traduit par l' activation des enzymes intracellulaires. L'amplification et la propagation de ce signal dans la cellule est médié par la fonction des protéines qui forment un réseau d'interactions protéine-protéine dans lequel les enzymes sont activées de manière réversible avec une spécificité élevée de signalisation. Parce que la dysrégulation de ces réseaux conduit souvent au développement du cancer, il y a eu beaucoup d' intérêt pour l' établissement d'une «thérapie de signal de transduction du cancer ', 2 dans lequel les médicaments sont conçus pour perturber les voies de signalisation malignes. Nous avons récemment proposé une approche alternative pour signaler la thérapie de transduction qui repose sur la capacité des médicaments pour générer anormales des voies de transduction du signal.

Pour démontrer la faisabilité de cette approche, nous avons récemment créé un «capteur chimique» synthétique 4 qui permet le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) pour déclencher le clivage d'un promédicament anticancéreux en activant le glutathion-S-transférase (GST), qui est pas son partenaire de liaison naturel. La structure de ce «transducteur» se compose d'un anti-PDGF ADN aptamère qui a été modifié avec un inhibiteur de la TPS bivalent. Par conséquent, cet agent synthétique appartient à une famille de molécules ayant des sites de liaison àprotéines différentes, telles que 5-7 inducteurs chimiques de dimérisation (CID) , 8-10 et aussi pour le groupe de protéines de liants à base de conjugués de molécules d' oligonucléotides synthétiques. 21/11

Les principes généraux sous-jacents à la conception de tels systèmes sont décrits ici et des protocoles détaillés pour la synthèse et le test du fonctionnement de ce «transducteur» avec des dosages enzymatiques classiques sont fournis. Ce travail est destiné à faciliter le développement de «transducteurs» supplémentaires de cette classe, qui peut être utilisé pour la médiation intracellulaire communication protéine-protéine et, par conséquent, pour induire artificiels voies de signalisation cellulaire.

La figure 1 décrit schématiquement les principes de fonctionnement des transducteurs «chimiques» synthétiques non naturels qui peuvent médier des communications protéine-protéine. Dans cette illustration, un «transducteur chimique», qui intègre des liants synthétiques pour la proteins I et II (liants I et II), permet la protéine II pour déclencher l'activité catalytique de la protéine I, qui ne fait pas son partenaire de liaison naturel. En l'absence de la protéine II, le transducteur se lie au site catalytique de l'enzyme (protéine I) et inhibe son activité (figure 1, l' état ii). La liaison du «transducteur» à la protéine II, cependant, favorise les interactions entre le liant I et la surface de la protéine II (figure 1, l' état iii), ce qui réduit son affinité envers la protéine I. En conséquence, la concentration efficace du ' transducteur libre »dans la solution est réduite, ce qui conduit à la dissociation de la protéine de transduction complexe I et à la réactivation de la protéine I (figure 1, l' état iv). Pris ensemble, ces étapes souligner trois principes fondamentaux qui sous-tendent la conception des «transducteurs» efficaces: (1) un «transducteur» devrait avoir un liant spécifique pour chacune des cibles protéiques, (2) l'betwe d'interactionen liant II et la protéine II devrait être plus forte que l'interaction entre le liant I et la protéine I, et (3) liant je dois être capable d'interagir avec la surface de la protéine II. Ce dernier principe ne requiert pas nécessairement que liant moi seul aurait une grande affinité et sélectivité pour la protéine II. Au lieu de cela, elle est basée sur nos études récentes qui montrent que l' introduction d' une molécule synthétique à proximité d'une protéine est de nature à favoriser les interactions entre cette molécule et la surface de la protéine 19,22,23.

Figure 1

Figure 1:. Utilisation des principes de «transducteurs chimiques» Lorsque le «capteur chimique» est ajouté à une protéine active I (état i), il se lie à son site actif par le biais de liant I et inhibe son activité (état ii). En présence de la protéine II, cependant, la non liés "chimique transducer 'interagit avec la protéine II liant à travers II, qui favorise les interactions entre le liant I et la surface de la protéine II. Ce liant induit I-protéine interaction II réduit la concentration efficace de liant I, ce qui conduit à la dissociation de la «protéine de transducer' complexe I et de la protéine I réactivation (état iv). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .

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Protocol

1. Synthèse de la «Chemical Transducer»

  1. Préparatifs préliminaires
    1. Préparer 2 M d'acétate de triéthylammonium (TEAA) un tampon en mélangeant 278 ml de triéthylamine avec 114 ml d'acide acétique et 400 ml d'eau ultrapure. Ajuster le pH à 7 et ajouter de l'eau à un volume final de 1 L. Gardez-le dans une bouteille sombre.
      Remarque: Cette solution est stable pendant des années.
    2. Préparer une solution d'acide ascorbique à 5 mM en dissolvant 18 mg d'acide ascorbique dans 20 ml d'eau ultrapure. Utiliser une solution fraîche; la solution est stable pendant une journée.
    3. Préparer un (II) / tris (benzyltriazolylmethyl) amine (TBTA) Solution mM de Cu 10 en dissolvant 25 mg de cuivre (II) pentahydrate de sulfate dans 10 ml d'eau ultra-pure et 58 mg de TBTA dans 11 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO). Mélanger les deux solutions. Gardez-le à la température ambiante et de le protéger de la lumière.
  2. procédure Conjugaison
    1. Dissoudre 100 nmoles de l'oligonucléotide modifié (ODN-1) dans 80 uld'eau ultrapure frais. Ajouter 20 ul de 2 M TEAA, pH = 7. Ajouter 80 ul d'une solution fraîchement préparée d'acide ascorbique (5 mM dans de l'eau).
    2. Dissoudre 1,5 umol (574,5 ug) d'acide éthacrynique azido modifié dans 180 pi de DMSO et on ajoute à la solution. Dégazer la solution à l'aide d'argon pendant 60 sec, puis ajouter 40 ul de l '(II) une solution de Cu / TBTA (10 mM dans 55% (v / v) de DMSO / eau) rapidement.
    3. Purger à nouveau avec de l'argon, fermer hermétiquement et agiter pendant une nuit.
    4. Surveiller la progression de la réaction et on purifie le conjugué par RP-HPLC preparative (phase mobile: A) 5% d'acétonitrile, 5% de TEAA, 90% d'eau ultrapure; B) 65% Acétonitrile, 5% TEAA, 30% d' eau ultrapure). 24

2. Contrôle de la TPS Activité par PDGF

  1. Préparatifs préliminaires
    1. Préparer 50 ml du tampon de dosage en mélangeant 33,9 ml de tampon phosphate salin (PBSx1) avec 16,1 ml d'eau ultra-pure pour obtenir une concentration finale de phosphate et ad 8 mMd 23,8 mg de MgCl2 pour parvenir à une concentration finale de 5 mM.
    2. Préparer une solution de réserve de GST M1-1 par dissolution de la protéine dans un tampon contenant 50 mM de Tris pH 7,5, NaCl 50 mM, dithiothréitol 1 mM (DTT) et 5 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à une concentration finale de 30 uM. Divisez cette solution dans de petites aliquotes et stocker à -80 ° C. Diluer fraîchement, conformément à la section 2.1.5.1, dans le tampon de dosage et de garder sur la glace.
      Remarque: La solution est stable pendant environ 5 heures, ou jusqu'à ce qu'il y a une réduction de l'activité enzymatique.
    3. La préparation du substrat selon les instructions suivantes:
      1. Dissolvez 10 mg de glutathion réduit (GSH) dans 325 pi d'eau ultrapure à une concentration finale de mM solution 100. Diluer 21 pi de cette solution mère dans 979 pi de tampon de dosage pour une concentration finale de la solution de travail 2.1 mM.
      2. Dissolvez 10 mg de 2,4-dinitrochlorobenzène (CDNB) dans 492 pi d'ethanol à une concentration finale de mM solution 100. Diluer 43,2 ul de la solution mère dans 956,8 pi d'un tampon de dosage pour une concentration finale de solution de travail 4,32 mM.
    4. Dans une plaque de 96 puits, mettre chaque substrat dans une ligne distincte (12 puits). Insérez au moins 60 pi dans chaque puits pour permettre le retrait rapide et facile de la solution. Couvrir la plaque avec une feuille d'aluminium pour la protection de la lumière.
    5. Préparer les solutions mères suivantes dans le tampon de dosage:
      1. GST M1-1 diluer 50 à une concentration finale de 0,6 uM du dimère.
      2. Diluer le «capteur chimique» à une solution stock de 30 uM.
      3. Diluer le PDGF à une concentration finale de 40 uM.
      4. Diluer le PDGF aptamère à une concentration finale de 250 uM.
  2. Mesurer l'activité de la TPS en présence du «capteur chimique» et PDGF.
    1. Mettre en place une procédure expérimentale in le lecteur de plaques pour la mesure cinétique.
      1. Créer une nouvelle expérience comme un «protocole standard».
      2. Appuyez sur «procédure» pour ouvrir la fenêtre des paramètres de procédure.
      3. Dans la liste déroulante sur la face supérieure de la fenêtre, choisissez le type «384 de la plaque», selon le fabricant de la plaque.
      4. Appuyez sur Lire 'sur le menu de gauche.
      5. En ce qui concerne la méthode de détection choisissez 'Absorbance'.
      6. En ce qui concerne le type de lecture choisissez «Point final».
      7. Écrire 340 nm dans la fenêtre de longueurs d'onde.
      8. Appuyez sur la «plaque pleine» en bas sur le côté supérieur droit et choisir le bien à mesurer.
      9. de ok 'pour fermer la «Lecture» fenêtre Press.
      10. Choisissez «start cinétique» sur le menu de gauche.
      11. Faire le temps d'exécution 10 min.
      12. Sélectionnez l'option d'intervalle minimum.
      13. Appuyez sur "OK" pour fermer la fenêtre cinétique.
      14. Faites glisser le 'Lire' ligne into la mesure cinétique.
      15. Appuyez sur le bouton «valider», puis sur le bouton «OK».
      16. Enregistrer l'expérience.
      17. Appuyez sur le bouton 'play'. Une boîte de dialogue apparaîtra - appuyez sur le bouton «ok» que lorsque la mesure doit être démarré.
    2. Afin d'effectuer l'essai de triplicats préparer quatre échantillons contenant chacun 3,25 ul du «transducteur chimique» et 3,25 pi de GST M1-1. Ajouter à chaque échantillon à 0, 1,2, 2,4 ou 4,9 ul de PDGF et 123,5, 122,3, 121,1, 118,6 ou pi du tampon de dosage, respectivement.
    3. Incuber la solution à température ambiante pendant 10 min.
    4. Dans une plaque de 384 puits-transparent, insérer 40 pi d'échantillon dans chaque puits. Insérer les seuls échantillons dans les puits impairs ou uniquement dans le même puits de la même ligne pour permettre l'utilisation d'un multi-pipetteur pour l'addition du substrat.
    5. En utilisant un pipetteur multi-canaux 12, ajouter rapidement 10 ul de chacun des til substrats qui ont été pré-préparés dans la plaque de 96 puits (section 2.1.4). Mélanger doucement et rapidement pour éviter les bulles. Insérez la plaque dans le lecteur et lancer la mesure cinétique. La cinétique de la TPS est assez rapide, essayez de réduire le temps entre l'addition de substrat et le début de la mesure cinétique.
  3. TPS Activation Cycles / d'inhibition médiée par le «capteur chimique».
    1. Afin de réaliser l'expérience de triplicats, préparer 5 échantillons contenant chacun 84,5 pi de tampon de dosage, 3,25 ul de «capteur chimique», et 3,25 ul de TPS M1-1. Incuber à température ambiante pendant 3 min.
    2. Ajouter 3,65 pi de tampon de dosage à l'échantillon 1 et 3,65 ul de PDGF à des échantillons 2-5. Incuber à température ambiante pendant 3 min.
    3. Ajouter 3.12 pi de tampon de dosage à des échantillons 1-2 et 3,12 ul de PDGF aptamère aux échantillons 3-5. Incuber à température ambiante pendant 3 min.
    4. Ajouter 24,4 pi de tampon de dosage à des échantillons1-3 et 24,4 ul de PDGF à des échantillons 4-5. Incuber à température ambiante pendant 3 min.
    5. Ajouter 7,8 pi de tampon de dosage à des échantillons 1-4 et 7,8 ul de PDGF aptamère à l'échantillon 5. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
    6. Dans une plaque de 384 puits-transparent, insérer 40 pi d'échantillon dans chaque puits. Insérez les échantillons uniquement dans le bizarre ou seulement dans les même puits dans la même ligne.
    7. L'utilisation d'un multi-pipetteur 12 canaux, ajouter rapidement 10 ul de chaque substrat (pré-établi dans la plaque de 96 puits). Mélanger doucement et rapidement pour éviter les bulles. Insérez la plaque dans le lecteur et lancer la mesure cinétique.
    8. Calculer le V 0 [MOD / min] dans chaque condition en soustrayant la DO mesurée à 340 nm à t = 0,5 min à partir de la DO mesurée à 340 nm à t = 1,5 min pour évaluer l'activation / inhibition recyclabilité. 25
  4. Évaluer la réponse en temps réel de la «sonde chimique» aux changements dans l'environnement.
      <li> effet en temps réel de plus PDGF
      1. Mettre en place une procédure expérimentale dans le lecteur de plaques pour la mesure cinétique.
      2. Répétez les étapes 2.2.1.1-2.2.1.10.
      3. Prenez le temps d'exécution 3,5 min.
      4. Sélectionnez l'option d'intervalle minimum.
      5. Appuyez sur "OK" pour fermer la fenêtre cinétique.
      6. Faites glisser la ligne «Lire» dans la mesure cinétique.
      7. Choisissez Plate Out / In sur le menu de gauche.
      8. Choisissez l'option 'étaler (pas de dialogue).
      9. Choisissez l'option «Retard» sur le menu de gauche et entrez 30 sec.
      10. Choisissez Plate Out / In sur le menu de gauche.
      11. Choisissez l'option 'plaque (pas de dialogue).
      12. Créer une deuxième mesure cinétique en répétant les étapes 2.2.1.4 - 2.2.1.14, mais dans la section 2.2.1.11 régler la cinétique de 25 min au lieu de 10 min.
      13. Appuyez sur le bouton «valider», puis sur le bouton «OK».
      14. Enregistrer l'expérience.
      15. Appuyez sur le «plabouton y '. Une boîte de dialogue apparaîtra - appuyez sur le bouton «ok» que lorsque la mesure doit être démarré.
      16. Préparer deux échantillons en mélangeant 1 pi de TPS M1-1 et 1 pl de la «capteur chimique» dans 38 pi de tampon de dosage. Insérez les échantillons dans deux puits d'une plaque de 384 puits-transparent, laissant un puits vide entre ces deux puits.
      17. L'utilisation d'un multi-pipetteur 12 canaux, ajouter rapidement 10 pi de chaque substrat, mélanger délicatement et rapidement pour éviter les bulles, insérer la plaque dans le lecteur et lancer la mesure cinétique.
      18. Lorsque la plaque ouvre (après 3,5 min), ajouter rapidement 1,125 ul de PDGF à l' un des puits, mélanger doucement, et laisser la plaque fermer pour les mesures cinétiques restantes.
    1. effet en temps réel de l'ajout de l'aptamère PDGF
      1. Répétez les étapes 2.4.1.1-2.4.1.15.
      2. Préparer deux échantillons en mélangeant 1 pi de TPS M1-1, 1 pl de la 'transducteur chimique », et 1,125 ul de PDGF dans 36,9 pi de tampon de dosage. Insérez les échantillons dans deux puits d'une plaque de 384 puits-transparent, laissant un puits vide entre ces deux puits.
      3. L'utilisation d'un multi-pipetteur 12 canaux, ajouter rapidement 10 pi de chaque substrat, mélanger délicatement et rapidement pour éviter les bulles, insérer la plaque dans le lecteur, et commencer la mesure cinétique.
      4. Lorsque la plaque ouvre (après 1,5 min), ajouter rapidement 1,2 ul de PDGF aptamère à l' un des puits, mélanger doucement et laisser la plaque fermer pour les mesures cinétiques restantes.
  5. Mesurer JS-K Promédicament d'activation par GST en présence du «transducteur chimique» et PDGF.
    1. Mettre en place une procédure expérimentale dans le lecteur de plaques pour la mesure cinétique.
      1. Créer une nouvelle expérience comme un «protocole standard».
      2. Appuyez sur «procédure» pour ouvrir la fenêtre des paramètres de procédure.
      3. Dans la liste déroulante sur la face supérieure de la fenêtre, sélectionnez le type '384 de la plaque », selon le fabricant de la plaque.
      4. Appuyez sur Lire 'sur le menu de gauche.
      5. En ce qui concerne la méthode de détection a choisi 'Absorbance'.
      6. En ce qui concerne le type de lecture choisissez «Point final».
      7. Écrire 305 nm dans la fenêtre de longueurs d'onde.
      8. Appuyez sur le bouton «plaque pleine» sur le côté supérieur droit et choisir le bien à mesurer.
      9. de ok 'pour fermer la «Lecture» fenêtre Press.
      10. Choisissez «start cinétique» sur le menu de gauche.
      11. Faire le temps d'exécution 10 min.
      12. Sélectionnez l'option d'intervalle minimum.
      13. Appuyez sur "OK" pour fermer la fenêtre cinétique.
      14. Faites glisser la ligne «Lire» dans la mesure cinétique.
      15. Appuyez sur le bouton «valider», puis sur le bouton «OK».
      16. Enregistrer l'expérience.
      17. Appuyez sur le bouton 'play'. Une bo dialoguex apparaîtra - appuyez sur le bouton «ok» que lorsque la mesure doit être démarré.
    2. Pour la production de NO mesures utilisent un kit calorimétrique nitrite / nitrate. Dans une plaque de 96 puits d'insérer 50 ul de tampon d'essai dans une rangée, 70 pl de Griess I réactif dans une deuxième rangée, et 70 pi de réactif de Griess II dans une troisième rangée.
    3. Afin d'effectuer l'essai de triplicats préparer quatre échantillons contenant chacun 4,8 pi de «capteur chimique. Pour échantillonner 1, ajouter 155,2 pi de tampon de dosage; échantillonner 2, ajouter 3,2 pi de GST-M1-1 et 152 pi de tampon de dosage; à l'échantillon 3, ajouter 9,6 pi de PDGF et 145,6 pi de tampon de dosage; et à l'échantillon 4, ajouter 3,2 pi de GST-M1-1, 9,6 pi de PDGF, et 142,4 pi de tampon de dosage.
    4. Incuber la solution à température ambiante pendant 10 min.
    5. Dans une plaque de 384 puits-transparent, insérez 50 ul d'échantillon dans chaque puits. Insérez les échantillons uniquement dans le bizarre ou seulement dans lemême les puits de la même ligne pour permettre l'utilisation d'un multi-pipetteur pour l'addition du substrat.
    6. Ajouter 0,54 pi de JS-K (5 mM dans du DMSO) à chaque puits.
    7. L'utilisation d'un multi-pipetteur 12 canaux, ajouter rapidement 10 ul de la solution GSH (pré-préparée dans la plaque de 96 puits), mélanger doucement et rapidement pour éviter les bulles. Insérez la plaque dans le lecteur et lancer la mesure cinétique.
    8. Immédiatement après la mesure cinétique, à l'aide d'un multi-pipetteur 12 canaux, prendre 50 ul de chaque échantillon dans la rangée de tampon de dosage dans la plaque de 96 puits pré-préparés et ajouter rapidement à ce 50 pi de réactif de Griess I et 50 pi de réactif Griess II. Incuber tout en protégeant de la lumière pendant 10 min à température ambiante et mesurer l'absorbance à 550 nm.
      Note: Le tampon de dosage et les réactifs volumes sont dépendants du protocole de la trousse.

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Representative Results

La conception, la synthèse et le mécanisme d'action d'un «capteur chimique» qui peut induire la communication artificielle entre PDGF et la TPS sont présentés dans la figure 2. La structure du «transducteur» intègre un aptamère PDGF ADN et un amide bis-éthacrynique (Bea ), qui est un inhibiteur connu de la GST (figure 2a). 19 Ces liants permettent le «transducteur» pour se lier à la fois le PDGF et GST avec des affinités différentes, à savoir, avec des constantes de dissociation (kd 's) de 26 nM et 144 nM, respectivement , . 4 En outre, selon cette conception, la liaison à PDGF devrait induire des interactions non spécifiques entre l'unité Bea et la surface du PDGF, qui nettement réduire la puissance de l'inhibiteur Bea. 19,22,23 Figure 2b illustre la mécanisme de fonctionnement sous-tend ce système. Lors de l'addition du «transducteur» à une TPS active, ladeux unités EA se lient simultanément les deux sites actifs de cette enzyme dimère et inhibent son activité. En présence de PDGF, cependant, un complexe de PDGF-'transducer 'est formée, qui empêche l'unité d'inhiber Bea TPS. Cela conduit par conséquent à la dissociation de la GST-'transducer «complexe et à la réactivation de la TPS. TPS peut ensuite être re-inhibée par l'ajout d'un aptamère PDGF non modifiée qui déplace le «capteur chimique» et il permet d'inhiber à nouveau la TPS.

La capacité de PDGF pour contrôler l'activité de TPS a d'abord été démontrée par la mesure de la TPS (10 nM), l'activité avec et sans le «capteur chimique» (500 nM) et la mesure de l'activité du complexe GST'chemical transducteur 'en présence de différentes concentrations du PDGF (250, 500 et 1000 nM) (Figure 3a). Après avoir établi que le «capteur chimique» induit artificielle communication PDGF-GST, nousensuite établi que cette communication artificielle, similaires aux étapes de transduction de signal, est également réversible et adapte rapidement aux changements de l'environnement. Réversible d' activation / inhibition de GST a été réalisée par des additions successives de PDGF et PDGF non modifié aptamère au transducteur "GST-'chemical complexe (figure 3b). La réponse du système aux changements en temps réel dans son environnement a été évaluée en mesurant l'activité de TPS, tout en ajoutant les différentes entrées. Une augmentation rapide de l'activité de la TPS a été observée lors de l'addition de PDGF (750 nM) à la TPS-'transducer «complexe (10 nM et 500 nM, respectivement) 3,5 minutes après l' ajout de substrats (figure 4a). De même, une diminution de l'activité de la GST a été observée lors de l'addition de PDGF aptamère (5 uM) à un mélange de TPS (10 nM), le PDGF (750 nm) et le "capteur chimique" (500 nm) (figure 4b).

Fnfin, nous avons démontré la capacité d'un tel système pour commander l'activation de la prodrogue en réponse aux changements dans l'environnement. JS-K est un promédicament anticancéreux activé par GST pour libérer NO toxiques (figure 5a). La quantité de NO libéré lors de l'addition de JS-K (45 uM) à la «sonde chimique» (750 nM) et diverses combinaisons de GST (10 nM) et le PDGF (2 uM) a été mesurée (figure 5b), ce qui confirme que seule la présence de la TPS et PDGF entraînera l'activation du promédicament.

Figure 2
Figure 2. «Chemical transducteur». - Synthèse et mécanisme de commande (a) Le «capteur chimique» est composé d'un aptamère PDGF, un inhibiteur de GST amide éthacrynique bivalent (EA), un fluorophore (FAM), et un désactivateur (Dabcyl) . Ce conjugué inhibiteur aptamèreest synthétisé par la fixation d'un amide éthacrynique (EA) dérivé d'azoture modifié par un dialkyne modifié et aptamère d'ADN marqué par fluorescence (ODN-1). Re-imprimée avec la permission de la référence 4. (B) L'activité enzymatique de la GST est inhibée par le «capteur chimique», en raison de la liaison des groupes EA au niveau des sites actifs de l'enzyme. L'addition de PDGF conduit à la formation du «complexe, ce qui perturbe le« transducteur PDGF-'chemical interaction transducer'-GST, rétablissant ainsi l'activité enzymatique. L'addition suivante d'un aptamère PDGF non modifié libère le «capteur chimique» et lui permet de re-inhiber l'enzyme. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Fi. figure 3: activité de la GST PDGF contrôlée (a) GST (10 nM) a une activité enzymatique en présence (-) et en absence (-) de l ' «transducteur chimique» (500 nm) et en présence du «transducteur chimique '(500 nM) avec des concentrations croissantes (250, 500 ou 1000 nM) de PDGF (---). (B) des cycles d' activation-inhibition de GST activité enzymatique qui se manifestent par des changements de la vitesse initiale (V 0) en réponse à des additions séquentielles (IIV) de PDGF et PDGF non modifié aptamère au transducteur «complexe GST-'chemical: (i) aucune, (II), le PDGF (750 nM), (III) aptamère de PDGF (4 pM), (IV ) PDGF (5 uM) et (V), le PDGF aptamère (10 pM). Le graphique présente la moyenne ± stdev de triplicats. Re-imprimée avec la permission de la référence 4. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.

Figure 4
. Figure 4: le contrôle en temps réel de l' activité de la TPS (a) Amélioration de la TPS activité enzymatique détectée immédiatement après l'addition de 750 nM PDGF (-) à une solution contenant la TPS (10 nM) et «capteur chimique» (500 nM) ( -) à t = 3,5 min. (B) addition d'un non modifié aptamères du PDGF (5 uM) (-) à une solution contenant GST (10 nM), le PDGF (750 nm) et le «capteur chimique» (500 nM) (-) à t = 1,5 min conduit à une diminution immédiate de la vitesse de réaction enzymatique. Re-imprimée avec la permission de la référence 4. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 5:. Contrôlée activation de promédicament (a) d'activation de la TPS de JS-K promédicament pour libérer NO toxique. (B) la libération de NO en présence du «capteur chimique» et différentes combinaisons de TPS (10 nM) et PDGF (2 uM). Le graphique présente la moyenne ± stdev de triplicats. Modifié avec la permission de la référence 4. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Acknowledgments

Cette recherche a été soutenue par la Fondation Minerva, l'Organisation HFSP, et un Conseil de recherche Grant européenne (Starting Grant 338265).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-chloro-2,4-dinitrobenzene Sigma-Aldrich 237329
Acetic acid Bio Lab 01070521
Acetnitrile J.T.Baker 9017-03
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544
Copper(II) Sulfate pentahydrate Merck-Millipore 102790
Dimethyl sulfoxide Merck-Millipore 802912
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Biological Industries 02-023-5A
Ethacrynic acid Tokyo Chemical Industry Co. Ltd E0526
Glutathione-s-transferase M1-1 Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)
JS-K Sigma-Aldrich J4137
L-glutathione reduced Sigma-Aldrich G4251
Magnesium Chloride J.T.Baker 0162
nitrate/nitrite colorimetric assay kit Cayman Chemical 780001
Oligonucleotides W. M. Keck Foundation Biotechnology at Yale University custom order
PDGF-BB Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)
TBTA Sigma-Aldrich 678937
Triethylamine Sigma-Aldrich T0886
Desalting column GE Healthcare illustra MicroSpin G-25 Columns
HPLC Waters  2695 separation module
HPLC column Waters XBridgeTM OST C18 column (2.5 μM, 4.6 mm × 50 mm)
HPLC column Waters XBridgeTM OST C18 column (2.5 μM, 10 mm × 50 mm)
Plate reader BioTek synergy H4 hybrid

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References

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Imitant la fonction des protéines de signalisation: Vers Artificial Signal Therapy transduction
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Peri-Naor, R., Motiei, L.,… More

Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy. J. Vis. Exp. (115), e54396, doi:10.3791/54396 (2016).

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