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Biochemistry

Imitando a Função de Proteínas de Sinalização: Toward Artificial Signal Therapy Transdução

Published: September 29, 2016 doi: 10.3791/54396
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Organic Chemistry, Weizmann Institute of Science

Introduction

Vias de transdução de sinal de desempenhar um papel significativo em virtualmente todos os processos celulares e permitir que a célula para responder rapidamente aos sinais ambientais. 1 Estas vias são frequentemente desencadeada pela ligação de uma molécula de sinalização a um receptor extracelular, o que resulta na activação de enzimas intracelulares. A amplificação e a propagação deste sinal dentro da célula é mediada pela função de sinalização de proteínas que formam uma rede de interacções proteína-proteína, em que as enzimas são activadas de forma reversível com alta especificidade. Porque desregulação destas redes freqüentemente leva ao desenvolvimento do câncer, tem havido muito interesse no estabelecimento de "terapia de transdução de sinal do câncer ', 2 em que as drogas são projetados para interromper vias de sinalização malignas. Propusemos recentemente uma abordagem alternativa terapia para assinalar a transdução que se baseia na capacidade das drogas para gerar vias de transdução de sinal não naturais.

Para demonstrar a viabilidade desta abordagem, criámos recentemente um transdutor química "sintético 4, que permite que o factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), para desencadear a clivagem de um pró-fármaco anticanceroso, activando a glutationa-S-transferase (GST), que é não o seu parceiro de ligação natural. A estrutura deste "transdutor" consiste em um aptâmero ADN anti-PDGF que é modificado com um inibidor bivalente para GST. Por isso, este agente sintético pertence a uma família de moléculas com locais de ligação paraproteínas diferentes, 5-7, tais como indutores químicos de dimerização (CIDs) 8-10 e também para o grupo de proteína de ligantes com base em conjugados de molécula oligonucleotídica-sintético. 21/11

Os princípios gerais da concepção de tais sistemas é aqui descrito e protocolos detalhados para sintetizar e testar a função deste "transdutor" com ensaios enzimáticos convencionais são fornecidos. Este trabalho destina-se a facilitar o desenvolvimento de transdutores '' adicionais desta classe, que pode ser usado para mediar a comunicação proteína-proteína intracelular e, consequentemente, para induzir vias de sinalização celular artificiais.

A Figura 1 descreve esquematicamente os princípios de funcionamento dos transdutores '' químicos sintéticos que podem mediar a comunicação proteína-proteína não naturais. Nesta ilustração, um transdutor química ", que integra ligantes sintéticos para protEins I e II (ligantes I e II), permite que a proteína II para desencadear a actividade catalítica da proteína I, que não é o seu parceiro de ligação natural. Na ausência de proteína II, o transdutor se liga ao sítio catalítico da enzima (proteína I) e inibe a sua actividade (Figura 1, no estado II). A ligação do "transdutor" de proteína II, no entanto, promove as interacções entre ligante I e a superfície da proteína II (Figura 1, no estado III), o que reduz a sua afinidade para a proteína I. Como resultado, a concentração eficaz do ' livre transdutor 'na solução é reduzida, o que conduz à dissociação do transdutor em proteínas do complexo I e a reactivação da proteína I (Figura 1, estado IV). Tomados em conjunto, estes passos destacar três princípios fundamentais subjacentes à concepção de transdutores '' eficazes: (1) um transdutor 'deve ter um ligante específico para cada um dos alvos de proteína, (2) a interacção between ligante II e proteína II deve ser mais forte do que a interacção entre o ligante I e proteína I, e (3) agente ligante que deve ser capaz de interagir com a superfície da proteína II. Este último princípio não exige necessariamente que aglutinante só eu teria uma alta afinidade e selectividade para a proteína II. Em vez disso, baseia-se nos nossos estudos recentes que mostraram que a interposição de uma molécula sintética na proximidade de uma proteína é susceptível de promover interacções entre esta molécula e a superfície da proteína 19,22,23.

figura 1

Figura 1:. Operando princípios da 'transdutores químicas "Quando o' transdutor química 'é adicionada a uma proteína ativa I (estado i), que se liga ao seu sítio ativo através ligante I e inibe a sua actividade (estado ii). Na presença da proteína II, no entanto, não ligado a 't químicaransducer 'interage com a proteína II por meio de ligante II, que promove as interacções entre ligante I e a superfície da proteína II. Esta pasta induzida I-proteína interação II reduz a concentração eficaz de ligante I, o que leva à dissociação do 'transducer'-proteína I complexa e à proteína I reactivação (estado iv). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura .

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Protocol

1. Síntese do "Chemical Transdutor '

  1. Os preparativos preliminares
    1. Preparar 2 M de acetato de trietilamónio tampão (TEAA) por mistura de 278 ml de trietilamina, com 114 ml de ácido acético e 400 ml de água ultrapura. Ajustar o pH a 7 e adicione água até um volume final de 1 L. mantê-lo em um frasco escuro.
      Nota: Esta solução é estável durante anos.
    2. Prepara-se uma solução de ácido ascórbico 5 mM por dissolução de 18 mg de ácido ascórbico em 20 ml de água ultrapura. Use uma solução fresca; a solução é estável durante um dia.
    3. Prepara-se uma solução de Cu 10 mM (II) / Tris (benzyltriazolylmethyl) amina (TBTA) por dissolução de 25 mg de cobre (II) penta-hidrato de sulfato em 10 ml de água ultrapura e 58 mg de TBTA em 11 ml de dimetil sulfóxido (DMSO). Misturar as duas soluções. Mantenha-o em temperatura ambiente e proteger da luz.
  2. conjugação Procedimento
    1. Dissolve-se 100 nmoles do oligonucleótido modificado (ODN-1) em 80 ulde água ultrapura fresca. Adicionar 20 ul de TEAA 2 M, pH = 7. Adicionar 80 ul de uma solução feita recentemente de ácido ascórbico (5 mM em água).
    2. Dissolve-se 1,5 mol (574,5 g) de ácido etacrínico modificada-azido em 180 ul de DMSO e adicioná-lo para a solução. Desgaseificar a solução com árgon durante 60 segundos e rapidamente adicionar 40 ul a partir da (ii) Solução de Cu / TBTA (10 mM em 55% (v / v) de DMSO / água).
    3. Purgar novamente com Argon, fechar bem e agitar durante a noite.
    4. Monitorizar o progresso da reacção e purificar o conjugado por RP-HPLC (fase móvel: A) 5% acetonitrilo, 5% de TEAA, 90% de água ultrapura; B) 65% de acetonitrilo, 5% de TEAA, 30% de água ultrapura). 24

2. Controlar GST Atividade por PDGF

  1. Os preparativos preliminares
    1. Preparar 50 ml de tampão de ensaio por mistura de 33,9 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBSx1) com 16,1 ml de água ultrapura para atingir uma concentração final de fosfato de 8 mm e add 23,8 mg de MgCl2 para obter uma concentração final de 5 mM.
    2. Prepara-se uma solução estoque de GST M1-1 por dissolução da proteína em tampão contendo Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM, ditiotreitol 1 mM (DTT), 5 mM e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para uma concentração final de 30 uM. Divida esta solução em pequenas alíquotas e armazenar a -80 C. Diluir recentemente, de acordo com a secção 2.1.5.1, no tampão de ensaio e manter em gelo.
      Nota: a solução será estável durante cerca de 5 horas, ou até que haja uma redução na actividade da enzima.
    3. Prepara-se o substrato de acordo com as seguintes instruções:
      1. Dissolve-se 10 mg de glutationa reduzida (GSH) em 325 ul de água ultrapura até uma concentração final de solução de estoque de 100 mM. Dilui-se 21 ul desta solução de stock em 979 ul de tampão de ensaio para uma concentração final de solução de trabalho de 2,1 mM.
      2. Dissolve-se 10 mg de 2,4-dinitroclorobenzeno (CDNB) em 492 ul de eThanol para uma concentração final da solução de estoque 100 mM. Dilui-se 43,2 ul de solução de reserva em 956,8 ul de um tampão de ensaio para uma concentração final de 4,32 mM de solução de trabalho.
    4. Em uma placa de 96 poços, coloque cada substrato em uma linha separada (12 poços). Inserir, pelo menos, 60 uL em cada poço para permitir a retirada fácil e rápida da solução. Cubra o prato com uma folha de alumínio para proteção contra a luz.
    5. Prepare as seguintes soluções de no tampão de ensaio:
      1. Diluir GST M1-1 por 50 a uma concentração final de 0,6 uM do dímero.
      2. Dilui-se a 'transdutor químico »a uma solução de estoque de 30? M.
      3. Dilui-se PDGF para uma concentração final de 40 uM.
      4. Diluir PDGF aptâmero a uma concentração final de 250 uM.
  2. Medir a atividade da GST na Presença do 'transdutor química "e PDGF.
    1. Estabelecer um procedimento experimental iN o leitor de placas para a medição cinética.
      1. Criar uma nova experiência como um "protocolo padrão '.
      2. Pressione no "processo" para abrir a janela de configurações do procedimento.
      3. Na lista pop-up na parte superior da janela, escolher o tipo de '384 placa' de acordo com o fabricante da placa.
      4. Pressione 'Ler' no menu à esquerda.
      5. Em relação ao método de detecção escolha 'Absorvância'.
      6. Em relação ao tipo de leitura escolha 'ponto final'.
      7. Adicione 340 nm na janela de comprimento de onda.
      8. Pressione na parte inferior 'placa completa "no lado superior direito e escolha o bem a ser medido.
      9. Pressione "OK" para fechar o "Read" janela.
      10. Escolha 'start cinético "no menu à esquerda.
      11. Faça o tempo de execução 10 min.
      12. Selecione a opção intervalos mínimos.
      13. Pressione "OK" para fechar a janela cinética.
      14. Arraste o "Read" linha into a medida cinética.
      15. Pressione o botão 'validar' e depois no botão 'ok'.
      16. Salve o experimento.
      17. Pressione o botão 'play'. Uma caixa de diálogo aparecerá - pressione o botão 'ok' apenas quando a medição deve ser iniciado.
    2. A fim de realizar o experimento triplicado, preparar quatro amostras de cada uma contendo 3,25 mL da 'transdutor química "e 3,25 ul de GST M1-1. Adicionar a cada amostra de 0, 1,2, 2,4, ou 4,9 ul de PDGF e 123,5, 122,3, 121,1, 118,6 ou ul de tampão de ensaio, respectivamente.
    3. Incubar a solução à temperatura ambiente durante 10 min.
    4. Em uma placa de 384 poços-transparente, inserir 40 ul de amostra a cada poço. Inserir as amostras apenas nos poços ímpares ou apenas do mesmo poços na mesma linha para permitir a utilização de um multi-pipeta para adição de substrato.
    5. Usando uma pipeta de multi-canal 12, adicionar rapidamente 10 ul de cada uma das tele substratos que foram previamente preparados, na placa de 96 poços (secção 2.1.4). Misture delicadamente e rapidamente para evitar bolhas. Insira a placa no leitor e iniciar a medição cinética. Como a cinética de GST é bastante rápido, tentar minimizar o tempo entre a adição de substrato e o início da medição cinética.
  3. GST Activation Ciclos / inibição mediada pelo "transdutor química".
    1. A fim de realizar o experimento triplicado, preparar 5 amostras, cada uma contendo 84,5 uL de tampão de ensaio, 3,25 ul de 'transdutor química ", e 3,25 ul de GST M1-1. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min.
    2. Adicionar 3,65 mL de tampão de ensaio para a amostra 1 e 3,65 mL de PDGF para amostras 2-5. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min.
    3. Adicionar 3,12 mL de tampão de ensaio para as amostras 1-2 e 3,12 ul de PDGF aptâmero para amostras 3-5. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min.
    4. Adicionar 24.4 ul de tampão de ensaio para amostras1-3 e 24,4 ul de PDGF para amostras 4-5. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min.
    5. Adicionar 7,8 uL de tampão de ensaio para as amostras 1-4 e 7,8 ul de PDGF aptâmero a amostra 5. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
    6. Em uma placa de 384 poços-transparente, inserir 40 ul de amostra em cada poço. amostras inserir somente para o ângulo diferente, ou apenas para os poços até mesmo na mesma linha.
    7. Usando uma pipeta de multi-canal 12, adicionar rapidamente 10 ul a partir de cada substrato (pré-preparado na placa de 96 poços). Misture delicadamente e rapidamente para evitar bolhas. Insira a placa no leitor e iniciar a medição cinética.
    8. Calcula-se a 0 V [mOD / min] sob cada condição subtraindo a densidade óptica medida a 340 nm a t = 0,5 min medido a partir da OD a 340 nm a t = 1,5 min para avaliar a activação / inibição de reciclagem. 25
  4. Avaliar a resposta em tempo real do 'transdutor química' para mudanças no ambiente.
      <li> efeito em tempo real de PDGF disso
      1. Estabelecer um procedimento experimental no leitor de placas para a medição cinética.
      2. Repita os passos 2.2.1.1-2.2.1.10.
      3. Faça o tempo de execução de 3,5 min.
      4. Selecione a opção intervalos mínimos.
      5. Pressione "OK" para fechar a janela cinética.
      6. Arraste a linha de "Read" para a medição cinética.
      7. Escolha Placa Out / In no menu à esquerda.
      8. Escolha a opção "placa out (sem diálogo) '.
      9. Escolha a opção "Delay" no menu à esquerda e entrar 30 seg.
      10. Escolha Placa Out / In no menu à esquerda.
      11. Escolha o "prato em (sem diálogo)" opção.
      12. Criar uma segunda medição de cinética, repetindo os passos 2.2.1.4 - 2.2.1.14 mas na secção 2.2.1.11 definir a cinética de ser de 25 minutos em vez de 10 minutos.
      13. Pressione o botão 'validar' e depois no botão 'ok'.
      14. Salve o experimento.
      15. Pressione o 'plabotão y '. Uma caixa de diálogo aparecerá - pressione o botão 'ok' apenas quando a medição deve ser iniciado.
      16. Prepare duas amostras por mistura de 1 ul de GST M1-1 e 1 ul da 'transdutor químico »em 38 ul de tampão de ensaio. Coloque as amostras em duas cavidades de uma placa de 384 poços-transparente, deixando um poço vazio entre estes dois poços.
      17. Usando uma pipeta de multi-canal 12, adicionar rapidamente 10 ul a partir de cada substrato, misturar suavemente e rapidamente para evitar bolhas, inserir a placa no leitor e iniciar a medição cinética.
      18. Quando a chapa se abre para cima (após 3,5 min), adicionar rapidamente 1.125 ul de PDGF a um dos poços, misturar suavemente, e permitir que a placa para a fechar-se para as restantes medições cinéticas.
    1. efeito em tempo real da adição do PDGF aptâmero
      1. Repita os passos 2.4.1.1-2.4.1.15.
      2. Prepare duas amostras por mistura de 1 ul de GST M1-1, 1 ul da 'transdutor química ", e 1,125 mL de PDGF em 36,9 ul de tampão de ensaio. Coloque as amostras em duas cavidades de uma placa de 384 poços-transparente, deixando um poço vazio entre estes dois poços.
      3. Usando uma pipeta de multi-canal 12, adicionar rapidamente 10 ul a partir de cada substrato, misturar suavemente e rapidamente para evitar bolhas, inserir a placa no leitor, e iniciar a medição cinética.
      4. Quando a chapa se abre para cima (após 1,5 min), adicionar rapidamente 1,2 mL de PDGF aptâmero a um dos poços, misturam suavemente e permitir que a placa para a fechar-se para as restantes medições cinéticas.
  5. Meça JS-K Pr�f�maco Ativação por GST na Presença do 'transdutor química "e PDGF.
    1. Estabelecer um procedimento experimental no leitor de placas para a medição cinética.
      1. Criar uma nova experiência como um "protocolo padrão '.
      2. Pressione no "processo" para abrir a janela de configurações do procedimento.
      3. Na lista pop-up na parte superior da janela, escolha o tipo '384 placa' de acordo com o fabricante da placa.
      4. Pressione 'Ler' no menu à esquerda.
      5. Em relação ao método de detecção escolhi 'absorvância'.
      6. Em relação ao tipo de leitura escolha 'ponto final'.
      7. Adicione 305 nm na janela de comprimento de onda.
      8. Pressione o botão de 'placa completa "no lado superior direito e escolha o bem a ser medido.
      9. Pressione "OK" para fechar o "Read" janela.
      10. Escolha 'start cinético "no menu à esquerda.
      11. Faça o tempo de execução 10 min.
      12. Selecione a opção intervalos mínimos.
      13. Pressione "OK" para fechar a janela cinética.
      14. Arraste a linha de "Read" para a medição cinética.
      15. Pressione o botão 'validar' e depois no botão 'ok'.
      16. Salve o experimento.
      17. Pressione o botão 'play'. A bo de diálogox aparecerá - pressione o botão 'ok' apenas quando a medição deve ser iniciado.
    2. Para a produção de medições usar um kit de calorimetria nitrito / nitrato. Numa placa de 96 poços inserir 50 ul de tampão de ensaio em uma fileira, 70 ul de Griess eu reagente numa segunda fila, e 70 ul de reagente de Griess II em uma terceira fila.
    3. A fim de realizar o experimento triplicado, preparar quatro amostras de cada uma contendo 4,8 mL da 'transdutor química ". Para a amostra 1, adicionar 155,2 ul de tampão de ensaio; a Amostra 2, adicionar 3,2 mL de GST-M1-1 e 152 ul de tampão de ensaio; a Amostra 3, adicionar 9,6 mL de PDGF e 145,6 uL de tampão de ensaio; e a amostra 4, adicionar 3,2 mL de GST-M1-1, 9,6 ul de PDGF, e 142,4 uL de tampão de ensaio.
    4. Incubar a solução à temperatura ambiente durante 10 min.
    5. Em uma placa de 384 poços-transparente, inserir 50 ul de amostra em cada poço. amostras de inserção apenas no estranho ou apenas namesmo poços na mesma linha para permitir a utilização de um multi-pipeta para adição de substrato.
    6. Adicionar 0,54 mL de JS-K (5 mM em DMSO) a cada poço.
    7. Usando uma pipeta de multi-canal 12, adicionar rapidamente 10 ul da solução de GSH (pré-preparado na placa de 96 poços), misturar suavemente e rapidamente, para evitar as bolhas. Insira a placa no leitor e iniciar a medição cinética.
    8. Imediatamente após a medição da cinética, utilizando um multi-pipeta de 12 canais, tomar 50 ul de cada amostra para a linha de tampão de ensaio na placa de 96 poços pré-preparado e rapidamente adicionar-lhe 50 ul de Griess eu reagente e 50 ul de reagente de Griess II. Incubar enquanto protege da luz durante 10 min à temperatura ambiente e meça a absorvência a 550 nm.
      Nota: O tampão de ensaio e os volumes de reagentes são dependentes de protocolo dos kits.

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Representative Results

A concepção, síntese e mecanismo de acção de um transdutor químico "que pode induzir a comunicação artificial entre PDGF e GST são apresentados na Figura 2. A estrutura do" transdutor "integra um aptâmero ADN de PDGF e uma amida de bis-etacrínico (bEA ), que é um conhecido inibidor de GST (figura 2a). 19 Estes ligantes permitir o 'transdutor' para se ligar tanto PDGF e GST com afinidades diferentes, a saber, com constantes de dissociação (K d 's) de 26 nM e 144 nM, respectivamente 4. Além disso, de acordo com esta concepção, a ligação de PDGF deve induzir as interacções não específicas entre a unidade bea e a superfície de PDGF, o qual iria reduzir marcadamente a potência do inibidor bEA. 19,22,23 a Figura 2b ilustra o mecanismo de funcionamento subjacente a este sistema. Após a adição do "transdutor" a uma GST activo, oduas unidades EA ligar simultaneamente os dois locais activos da presente enzima dimérica e inibir a sua actividade. Na presença de PDGF, no entanto, um complexo de PDGF-'transducer 'é formada, a qual evita que a unidade bEA de inibir a GST. Isso consequentemente leva à dissociação do GST-'transducer 'complexo e à reativação GST. GST pode então ser re-inibida pela adição de um aptâmero de PDGF não modificado que desloca o 'transdutor química ", que permite a inibir a GST novamente.

A capacidade de PDGF para controlar a actividade de GST foi primeiro demonstrado por medição (10 nM) com actividade de GST e sem a 'transdutor química "(500 nM) e medindo a actividade do complexo GST-'chemical transdutor' na presença de diferentes concentrações de PDGF (250, 500 e 1000 nM) (Figura 3a). Depois de estabelecer que o 'transdutor química' induz a comunicação PDGF-GST artificial, nósseguida, que a presente comunicação artificial, semelhante aos passos de transdução de sinal, também é reversível e adapta-se rapidamente às alterações no ambiente. Reversível de activação / inibição de GST foi realizada através de adições sequenciais de PDGF e PDGF não modificado aptâmero para a GST-'chemical transdutor "complexo (Figura 3b). A resposta do sistema a alterações em tempo real no seu ambiente foi avaliada por medição da actividade da GST ao adicionar as diferentes entradas. Observou-se um rápido aumento da actividade de GST após a adição de PDGF (750 nm) para o GST-'transducer 'complexo (10 nM e 500 nM, respectivamente) de 3,5 minutos após a adição de substratos (Figura 4a). Do mesmo modo, foi observada uma diminuição da actividade de GST após a adição de PDGF aptâmero (5 uM) a uma mistura de GST (10 nM), PDGF (750 nM), e o 'transdutor química "(500 nM) (Figura 4b).

Finalmente, que demonstrou a capacidade de um tal sistema para controlar a activação pró-fármaco em resposta a alterações no ambiente. JS-K é um pró-fármaco anticanceroso activado por GST libertar a NÃO tóxica (Figura 5a). A quantidade de NO libertado mediante a adição de JS-K (45 uM) à 'transdutor química "(750 nM) e diferentes combinações de GST (10 nM) e o PDGF (2 uM) foram medidos (Figura 5b), confirmando assim que apenas a presença de GST ambos PDGF e irá resultar na activação de pró-fármaco.

Figura 2
Figura 2. 'Chemical transdutor' -. Síntese e mecanismo de operação (a), A 'transdutor química "é constituída por um aptâmero de PDGF, um inibidor de GST bivalente amida etacrínico (EA), um fluoróforo (FAM), e um inibidor (Dabcil) . Este conjugado aptâmero inibidoré sintetizada pelo acoplamento de um amida etacrínico (EA) derivado modificado-azida a uma modificada-dialkyne aptâmero e ADN marcado por fluorescência (ODN-1). Re-impressa com a permissão de referência 4. (B) A actividade enzimática de GST é inibida pelo "transdutor química", devido à ligação dos grupos de EA em sítios activos da enzima. A adição de PDGF, conduz à formação do "complexo, o que perturba o 'transdutor PDGF-'chemical interacção transducer'-GST, por conseguinte, restaurando a actividade enzimática. A seguir à adição de um aptâmero de PDGF não modificada libera o 'transdutor química "e permite que ele volte a inibir a enzima. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Fi. gura 3: actividade de GST controlado por PDGF (a), GST (10 nM) a actividade enzimática na presença (-) e na ausência (-) do 'transdutor química "(500 nM), e na presença de a' transdutor química '(500 nM) com concentrações crescentes (250, 500, ou 1000 nM) de PDGF (---). (B) os ciclos Inibição-activação da actividade enzimática de GST que se manifesta por alterações na velocidade inicial (V 0) em resposta a adições sequenciais (IIV) de PDGF e PDGF não modificado aptâmero para a GST-'chemical transdutor "complexo: (i) nenhum, (II), o PDGF (750 nm), (III) aptâmero de PDGF (4 uM), (IV ) PDGF (5 uM), e (V aptâmero) PDGF (10 | iM). O gráfico apresenta a média ± DP de triplicados. Re-impresso com a permissão de referência 4. Por favor clique aqui para ver uma maior versão desta figura.

Figura 4
. Figura 4: controlo em tempo real da actividade de GST (a) aumento da actividade enzimática de GST detectadas imediatamente após a adição de 750 nM de PDGF (-) a uma solução contendo GST (10 nM) e "transdutor química" (500 nM) ( -) em t = 3,5 min. (B) adição de um não modificado aptâmero de PDGF (5 fiM) (-) a uma solução contendo GST (10 nM), PDGF (750 nM), e o 'transdutor química "(500 nM) (-) em t = 1,5 min leva a uma diminuição imediata na velocidade da reacção enzimática. Re-impresso com a permissão de referência 4. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5:. Controlled activação pró-f ármaco (a) activação de GST de pró-fármaco JS-K para libertar NO tóxico. (B) libertação de NO na presença do 'transdutor química »e combinações diferentes de GST (10 nM) e o PDGF (2 uM). O gráfico apresenta a média ± DP de triplicados. Mudou com a permissão de referência 4. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Minerva, a Organização HFSP e um Grant Conselho Europeu de Investigação (Começando Grant 338265).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-chloro-2,4-dinitrobenzene Sigma-Aldrich 237329
Acetic acid Bio Lab 01070521
Acetnitrile J.T.Baker 9017-03
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544
Copper(II) Sulfate pentahydrate Merck-Millipore 102790
Dimethyl sulfoxide Merck-Millipore 802912
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Biological Industries 02-023-5A
Ethacrynic acid Tokyo Chemical Industry Co. Ltd E0526
Glutathione-s-transferase M1-1 Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)
JS-K Sigma-Aldrich J4137
L-glutathione reduced Sigma-Aldrich G4251
Magnesium Chloride J.T.Baker 0162
nitrate/nitrite colorimetric assay kit Cayman Chemical 780001
Oligonucleotides W. M. Keck Foundation Biotechnology at Yale University custom order
PDGF-BB Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)
TBTA Sigma-Aldrich 678937
Triethylamine Sigma-Aldrich T0886
Desalting column GE Healthcare illustra MicroSpin G-25 Columns
HPLC Waters  2695 separation module
HPLC column Waters XBridgeTM OST C18 column (2.5 μM, 4.6 mm × 50 mm)
HPLC column Waters XBridgeTM OST C18 column (2.5 μM, 10 mm × 50 mm)
Plate reader BioTek synergy H4 hybrid

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References

  1. Hunter, T. Signaling—2000 and Beyond. Cell. 100, 113-127 (2000).
  2. Levitzki, A., Klein, S. Signal transduction therapy of cancer. Mol Aspects Med. 31, 287-329 (2010).
  3. Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. Artificial signal transduction therapy: a futuristic approach to disease treatment. Future Med. Chem. 7, 2091-2093 (2015).
  4. Peri-Naor, R., Ilani, T., Motiei, L., Margulies, D. Protein-Protein Communication and Enzyme Activation Mediated by a Synthetic Chemical Transducer. J. Am. Chem. Soc. 137, 9507-9510 (2015).
  5. Corson, T. W., Aberle, N., Crews, C. M. Design and Applications of Bifunctional Small Molecules: Why Two Heads Are Better Than One. ACS Chem. Biol. 3, 677-692 (2008).
  6. Rutkowska, A., Schultz, C. Protein Tango: The Toolbox to Capture Interacting Partners. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8166-8176 (2012).
  7. Meyer, C., Köhn, M. A Molecular Tête-à-Tête Arranged by a Designed Adaptor Protein. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8160-8162 (2012).
  8. Klemm, J. D., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Dimerization as a Regulatory Mechanism in Signal Transduction. Annu. Rev. Immunol. 16, 569-592 (1998).
  9. DeRose, R., Miyamoto, T., Inoue, T. Manipulating signaling at will: chemically-inducible dimerization (CID) techniques resolve problems in cell biology. Pflugers Arch. 465, 409-417 (2013).
  10. Gestwicki, J. E., Marinec, P. S. Chemical control over protein-protein interactions: beyond inhibitors. Comb. Chem. High Throughput. Screen. 10, 667-675 (2007).
  11. Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding. Supramol. Chem. 25, 848-862 (2013).
  12. Diezmann, F., Seitz, O. DNA-guided display of proteins and protein ligands for the interrogation of biology. Chem. Soc. Rev. 40, 5789-5801 (2011).
  13. Röglin, L., Ahmadian, M. R., Seitz, O. DNA-Controlled Reversible Switching of Peptide Conformation and Bioactivity. Angew. Chem. Int. Ed. 46, 2704-2707 (2007).
  14. Röglin, L., Altenbrunn, F., Seitz, O. DNA and RNA-Controlled Switching of Protein Kinase Activity. ChemBioChem. 10, 758-765 (2009).
  15. Harris, D. C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. DNA-Small Molecule Chimera with Responsive Protein-Binding Ability. J. Am. Chem. Soc. 130, 14950-14951 (2008).
  16. Harris, D. C., Saks, B. R., Jayawickramarajah, J. Protein-Binding Molecular Switches via Host-Guest Stabilized DNA Hairpins. J. Am. Chem. Soc. 133, 7676-7679 (2011).
  17. Kim, Y., Cao, Z., Tan, W. Molecular assembly for high-performance bivalent nucleic acid inhibitor. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5664-5669 (2008).
  18. Han, D., et al. A Logical Molecular Circuit for Programmable and Autonomous Regulation of Protein Activity Using DNA Aptamer-Protein Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 20797-20804 (2012).
  19. Motiei, L., Pode, Z., Koganitsky, A., Margulies, D. Targeted Protein Surface Sensors as a Tool for Analyzing Small Populations of Proteins in Biological Mixtures. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 9289-9293 (2014).
  20. Ranallo, S., Rossetti, M., Plaxco, K. W., Vallée-Bélisle, A., Ricci, F. A Modular, DNA-Based Beacon for Single-Step Fluorescence Detection of Antibodies and Other Proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 54, 13214-13218 (2015).
  21. Franzini, R. M., et al. Identification of Structure-Activity Relationships from Screening a Structurally Compact DNA-Encoded Chemical Library. Angew. Chem. Int. Ed. 54, 3927-3931 (2015).
  22. Unger-Angel, L., et al. Protein recognition by bivalent, 'turn-on' fluorescent molecular probes. Chem. Sci. 6, 5419-5425 (2015).
  23. Nissinkorn, Y., et al. Sensing Protein Surfaces with Targeted Fluorescent Receptors. Chem. Eur. J. 21, 15981-15987 (2015).
  24. Huber, C. G., Oefner, P. J., Bonn, G. K. High-Resolution Liquid Chromatography of Oligonucleotides on Nonporous Alkylated Styrene-Divinylbenzene Copolymers. Anal. Biochem. 212, 351-358 (1993).
  25. Lyon, R. P., Hill, J. J., Atkins, W. M. Novel class of bivalent glutathione S-transferase inhibitors. Biochemistry. 42, 10418-10428 (2003).
  26. Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding. Supramol. Chem. , 1-16 (2013).

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Bioquímica Edição 115 transdução de sinal Artificial liberação de drogas específicas química biomimético receptores de proteínas sintéticas biologia química receptores de proteína à base de DNA ligantes de proteína comutáveis
Imitando a Função de Proteínas de Sinalização: Toward Artificial Signal Therapy Transdução
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Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy. J. Vis. Exp. (115), e54396, doi:10.3791/54396 (2016).

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