Introduction
Трансдукции сигнала пути играют важную роль практически во всех клеточных процессов и позволяют клетке быстро реагировать на внешние сигналы. 1 Эти пути часто вызываются связывание сигнальной молекулы с внеклеточным рецептором, что приводит к активации внутриклеточных ферментов. Усиление и распространение этого сигнала внутри клетки опосредовано функцией сигнальных белков, которые образуют сеть белок-белковых взаимодействий, в котором ферменты обратимо активированную с высокой специфичностью. Поскольку дисрегуляция этих сетей часто приводит к развитию рака, наблюдается большой интерес к созданию "сигнальной трансдукции терапии рака ', 2 ' в результате чего препараты предназначены для разрушения злокачественных сигнальных путей. Недавно мы предложили альтернативный подход к сигнальной трансдукции терапии, который зависит от способности препаратов генерировать неестественные пути передачи сигнала. Для того, чтобы продемонстрировать возможность такого подхода, мы недавно создали синтетический 'химический датчик' 4 , который позволяет тромбоцитарный фактор роста (PDGF) , чтобы вызвать расщепление противоопухолевого пролекарства путем активации глутатион-S-трансферазы (GST), который не его естественный партнер по связыванию. Структура этого «датчика» состоит из анти-PDGF ДНК аптамеров, который модифицирован с ингибитором двухвалентной для GST. Следовательно, этот синтетический агент принадлежит к семейству молекул с сайтами связывания дляразличные белки, 5-7 , таких как химические индукторы димеризации (ИДС) 8-10 , а также к группе белков-связующие на основе олигонуклеотидных конъюгатов-синтетической молекулы. 11-21 Общие принципы, лежащие в основе конструкции таких систем описаны здесь и подробные протоколы для синтеза и тестирования функции этого «датчика» с обычными ферментативных анализов предоставляются. Эта работа предназначена для облегчения разработки дополнительных «преобразователей» этого класса, который может быть использован в качестве посредника внутриклеточный связи белок-белок, и, следовательно, для индукции искусственных сигнальных путей клеток. На рисунке 1 схематически описывает принципы работы синтетических «химических преобразователей» , которые могут опосредовать неестественные белок-белковые связи. На этой иллюстрации, а 'химический преобразователь », который объединяет синтетические связующие вещества для PROTEins I и II (связующие вещества I и II), позволяет белок II, чтобы вызвать каталитическую активность белка I, который не является ее естественным партнером связывания. При отсутствии белка II, преобразователь связывает каталитический участок фермента (белка I) и ингибирует его активность (Рисунок 1, стенд II). Связывание "преобразователя" к белку II, тем не менее, обеспечивает взаимодействие между связующей I и поверхностью белка II (рис 1, стенд III), что снижает его сродство к белковой I. В результате эффективная концентрация ' свободный 'датчик в растворе уменьшается, что приводит к диссоциации преобразователя-белка I комплекса и реактивации белка I (рис 1, состояние IV). Взятые вместе, эти шаги выделить три основные принципы, лежащие в основе создания эффективных 'преобразователей': (1) 'датчик' должен иметь конкретное связующее для каждого из белковых мишеней, (2) взаимодействие betweен вяжущего II и белка II должен быть сильнее, чем взаимодействие между связующей I и белка I, и (3) вяжущего я должен иметь возможность взаимодействовать с поверхностью белка II. Этот последний принцип не обязательно требует, чтобы связующее только я бы высокое сродство и избирательность по отношению к белку II. Вместо этого, оно основано на наших недавних исследований , которые показали , что в результате чего синтетическую молекулу , в непосредственной близости к белку может способствовать взаимодействие между этой молекулой и поверхностью белка. 19,22,23 Рисунок 1:. Принцип работы технологии 'химических преобразователей "Когда" химический преобразователь' добавляется в активный белок I (состояние I), он связывается с его активным сайтом через связующее I и ингибирует его активность (состояние II). В присутствии белка II, однако, несвязанный "химический тransducer 'взаимодействует с белком II через вяжущего II, который обеспечивает взаимодействие между связующей I и поверхностью белка II. Это побудило связующее I-II белок взаимодействие снижает эффективную концентрацию связующего вещества I, что приводит к диссоциации "transducer'-белка I комплекса и белка I реактивации (состояние IV). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры ,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Синтез '' Chemical Transducer
- Предварительные препараты
- Приготовьте 2 М триэтиламмоний ацетат (TEAA) буфер путем смешивания 278 мл триэтиламина в 114 мл уксусной кислоты и 400 мл сверхчистой воды. Доводят рН до 7 и добавляют воду до конечного объема 1 л Хранить ее в темной бутылке.
Примечание: Этот раствор стабилен в течение многих лет. - Готовят раствор 5 мМ аскорбиновой кислоты путем растворения 18 мг аскорбиновой кислоты в 20 мл сверхчистой воды. Используйте свежий раствор; раствор стабилен в течение одного дня.
- Приготовьте Трис (Бензилтриазолилметил) Амин раствор 10 мМ Cu (II) / (ТБТА) путем растворения 25 мг бромида меди (II) пентагидрата сульфата в 10 мл сверхчистой воды и 58 мг ТБТА в 11 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Смешайте два решения. Хранить при комнатной температуре и защитить его от света.
- Приготовьте 2 М триэтиламмоний ацетат (TEAA) буфер путем смешивания 278 мл триэтиламина в 114 мл уксусной кислоты и 400 мл сверхчистой воды. Доводят рН до 7 и добавляют воду до конечного объема 1 л Хранить ее в темной бутылке.
- Сопряжение Процедура
- Растворить 100 нмоль модифицированного олигонуклеотида (ОДН-1) в 80 мклсвежего сверхчистой воды. Добавьте 20 мкл 2 М ТЕАА, рН = 7. Добавляют 80 мкл свежеприготовленного раствора аскорбиновой кислоты (5 мМ в воде).
- Растворить 1,5 мкмоль (574,5 мкг) азидо-модифицированного этакриновая кислоты в 180 мкл ДМСО и добавить его к решению. Дегазирования раствора с использованием аргона в течение 60 секунд и быстро добавляют 40 мкл из (II) / раствор ТБТА Cu (10 мМ в 55% (об / об) ДМСО / вода).
- снова продувают аргоном, плотно закрыть, и перемешивают в течение ночи.
- Контроль за ходом реакции и очистки конъюгата с помощью ОФ-ВЭЖХ (подвижная фаза: А) 5% ацетонитрилом, 5% ТЕАА, 90% сверхчистой водой; Б) 65% ацетонитрила, 5% ТЕАА, 30% сверхчистой воды). 24
2. Управление GST активность по PDGF
- Предварительные препараты
- Приготовьте 50 мл буфера для анализа путем смешивания 33,9 мл фосфатно-солевом буферном (PBSx1) с 16,1 мл сверхчистой воды для достижения 8 мМ конечной концентрации фосфата и объявлениег 23,8 мг MgCl 2 , чтобы достигнуть конечной концентрации 5 мМ.
- Готовят раствор GST M1-1 путем растворения белка в буфере, содержащем 50 мМ Трис, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 1 мМ дитиотреитола (ДТТ) и 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) до конечной концентрации 30 мкМ. Разделите это решение в виде небольших аликвот и хранят при -80 ° С. Развести свеже, в соответствии с разделом 2.1.5.1, в буфере для анализа и держать на льду.
Примечание: Решение будет стабильным в течение приблизительно 5 часов, или до тех пор, пока не будет снижение активности фермента. - Подготовьте субстрат в соответствии со следующими инструкциями:
- Растворите 10 мг восстановленного глутатиона (GSH) в 325 мкл сверхчистой воды до конечной концентрации 100 мМ исходного раствора. Развести 21 мкл из этого раствора в 979 мкл буфера для анализа до конечной концентрации 2,1 мМ рабочего раствора.
- Растворите 10 мг 2,4-динитрохлорбензола (CDNB) в 492 мкл еthanol до конечной концентрации 100 мМ исходного раствора. Развести 43,2 мкл из исходного раствора в 956,8 мкл буфера дл анализа до конечной концентрации 4,32 мМ рабочего раствора.
- В 96-луночный планшет, поместить каждую подложку в отдельной линии (12 лунок). Вставьте по меньшей мере, 60 мкл в каждую лунку, чтобы обеспечить быстрый и легкий отвод раствора. Закройте планшет с алюминиевым листом для легкой защиты.
- Готовят следующие растворы в буфере для анализа:
- Развести GST M1-1 от 50 до конечной концентрации 0,6 мкМ димера.
- Развести 'химический датчик' до 30 мкМ маточного раствора.
- Развести PDGF до конечной концентрации 40 мкМ.
- Развести PDGF аптамер до конечной концентрации 250 мкМ.
- Измерьте GST активность в присутствии этого "химического датчика" и PDGF.
- Настройка процедуры эксперимента Iп-ридере для кинетического измерения.
- Создайте новый эксперимент в качестве "стандартного протокола".
- Нажмите на "процедуры", чтобы открыть окно настройки процедуры.
- В появившемся списке вверх на верхней части окна, выберите тип '384' пластины в зависимости от производителя плиты.
- Нажмите 'Read' в меню слева.
- Что касается метода обнаружения выберите 'Absorbance'.
- Что касается типа чтения выберите 'Конечная точка'.
- Написать длине волны 340 нм в окне длин волн.
- Нажмите на 'Full Plate' снизу на верхнем правом углу и выберите хорошо, чтобы быть измерена.
- 'OK', чтобы закрыть 'Read' окно Press.
- Выберите 'начать кинетический' в меню слева.
- Сделайте во время выполнения 10 мин.
- Выберите опцию минимальные интервалы.
- Нажмите «ОК», чтобы закрыть окно кинетическую.
- Перетащите "читать" линия, которую яNto кинетического измерения.
- Нажмите кнопку "Подтвердить", а затем кнопку «ОК».
- Сохранить эксперимент.
- Нажмите на кнопку "играть". Появится диалоговое окно появится - нажмите кнопку «ОК» только тогда, когда измерение должно быть начато.
- Для проведения эксперимента трехкратном повторе, подготавливают четыре пробы каждая из которых содержит 3,25 мкл 'химического датчика' и 3,25 мкл GST M1-1. Добавить к каждому образцу 0, 1.2, 2.4 или 4.9 мкл PDGF и 123,5, 122,3, 121,1 или 118,6 мкл буфера для анализа, соответственно.
- Выдержите раствор при комнатной температуре в течение 10 мин.
- В 384-прозрачной луночного планшета, вставки 40 мкл образца в каждую лунку. Вставьте образцы только в нечетных скважинах или только в четных скважин в той же строке, чтобы разрешить использование мульти-дозаторов для добавления субстрата.
- Использование 12-канальный мульти-дозаторов, быстро добавить 10 мкл от каждого из тон субстраты, которые были предварительно подготовлены в 96-луночного планшета (раздел 2.1.4). Осторожно перемешать и быстро, чтобы избежать пузырей. Вставьте пластину в считывающее устройство и начать кинетического измерения. Поскольку кинетика GST довольно быстро, стараются свести к минимуму время между добавлением субстрата и началом кинетического измерения.
- Настройка процедуры эксперимента Iп-ридере для кинетического измерения.
- GST активации / ингибирования Циклы опосредуется 'химического датчика'.
- Для проведения эксперимента трехкратном повторе, подготовить 5 образцов каждый из которых содержит 84,5 мкл буфера для анализа, 3,25 мкл 'химического датчика' и 3,25 мкл GST M1-1. Инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин.
- Добавить 3,65 мкл буфера для анализа, чтобы образец 1 и 3,65 мкл PDGF для образцов 2-5. Инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин.
- Добавить 3,12 мкл буфера для анализа до образцов 1-2 и 3,12 мкл PDGF аптамеров к образцам 3-5. Инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин.
- Добавить 24,4 мкл буфера для анализа в образцах1-3 и 24,4 мкл PDGF к образцам 4-5. Инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин.
- Добавить 7,8 мкл буфера для анализа в образцах 1-4 и 7,8 мкл PDGF аптамеров для образца 5. инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
- В 384-прозрачной луночного планшета, вставки 40 мкл образца в каждую лунку. Вставьте образцы только в нечетные или только в четных скважин в той же строке.
- С помощью 12-канального мульти-дозаторов, быстро добавляют по 10 мкл из каждой подложки (предварительно приготовленный в 96-луночный планшет). Осторожно перемешать и быстро, чтобы избежать пузырей. Вставьте пластину в считывающее устройство и начать кинетического измерения.
- Вычислить V 0 [MOD / мин] при каждом условии вычитанием OD измеренной при длине волны 340 нм при Т = 0,5 мин от OD , измеренной при длине волны 340 нм при Т = 1,5 мин для оценки активации / ингибирования рециркулируемости. 25
- Оценка в режиме реального времени отклика "химического преобразователя" к изменениям в окружающей среде.
- <li> В режиме реального времени эффект PDGF дополнение
- Установите экспериментальную процедуру в ридере для кинетического измерения.
- Повторите шаги 2.2.1.1-2.2.1.10.
- Сделайте время автономной работы 3,5 мин.
- Выберите опцию минимальные интервалы.
- Нажмите «ОК», чтобы закрыть окно кинетическую.
- Перетащите "читать" линию в кинетическую измерения.
- Выберите Plate Out / In в меню слева.
- Выберите опцию 'осаждаются (без диалога) ".
- Выберите опцию 'Delay' в меню слева и введите 30 сек.
- Выберите Plate Out / In в меню слева.
- Выберите опцию 'пластину в (без диалога) ".
- Создание второго кинетического измерения, повторяя шаги 2.2.1.4 - 2.2.1.14, но в разделе 2.2.1.11 установить кинетическую быть 25 мин вместо 10 мин.
- Нажмите кнопку "Подтвердить", а затем кнопку «ОК».
- Сохранить эксперимент.
- Нажмите 'PLAКнопка Y '. Появится диалоговое окно появится - нажмите кнопку «ОК» только тогда, когда измерение должно быть начато.
- Готовят два образца путем смешивания 1 мкл GST M1-1 и 1 мкл 'химического датчика' в 38 мкл буфера для анализа. Вставить образцы в две лунки 384-луночного планшета для прозрачной, оставив пустой колодец между этими двумя скважинами.
- Использование 12-канальный мульти-дозаторов, быстро добавить 10 мкл из каждой подложки, аккуратно перемешать и быстро, чтобы избежать пузырей, вставить пластину в считывающее устройство и начать кинетического измерения.
- Когда пластина открывает (через 3,5 мин), быстро добавить 1,125 мкл PDGF в одну из лунок, осторожно перемешивают и оставляют пластину , чтобы закрыть для остальных кинетических измерений.
- В режиме реального времени эффект от добавления аптамер PDGF
- Повторите шаги 2.4.1.1-2.4.1.15.
- Подготовить два образца путем смешивания 1 мкл GST M1-1, 1 мкл 'химический датчик ', и 1,125 мкл ФРПТ в 36,9 мкл буфера для анализа. Вставить образцы в две лунки 384-луночного планшета для прозрачной, оставив пустой колодец между этими двумя скважинами.
- Использование 12-канальный мульти-дозаторов, быстро добавить 10 мкл из каждой подложки, аккуратно перемешать и быстро, чтобы избежать пузырей, вставить пластину в считывающее устройство, и начать кинетического измерения.
- Когда пластина открывает (через 1,5 мин), быстро добавляют 1,2 мкл PDGF аптамеров в одну из лунок, осторожно перемешать и дать пластины , чтобы закрыть для остальных кинетических измерений.
- Установите экспериментальную процедуру в ридере для кинетического измерения.
- Создайте новый эксперимент в качестве "стандартного протокола".
- Нажмите на "процедуры", чтобы открыть окно настройки процедуры.
- В появившемся списке вверх на верхней части окна выберите тип '384' пластины в зависимости от производителя плиты.
- Нажмите 'Read' в меню слева.
- Что касается метода обнаружения выбрал 'Absorbance'.
- Что касается типа чтения выберите 'Конечная точка'.
- Написать 305 нм на окне длин волн.
- Нажмите на кнопку "Full Plate" на верхнем правом углу и выберите хорошо, чтобы быть измерена.
- 'OK', чтобы закрыть 'Read' окно Press.
- Выберите 'начать кинетический' в меню слева.
- Сделайте во время выполнения 10 мин.
- Выберите опцию минимальные интервалы.
- Нажмите «ОК», чтобы закрыть окно кинетическую.
- Перетащите "читать" линию в кинетическую измерения.
- Нажмите кнопку "Подтвердить", а затем кнопку «ОК».
- Сохранить эксперимент.
- Нажмите на кнопку "играть". Диалог бох появится - нажмите кнопку «ОК» только тогда, когда измерение должно быть начато.
- Для NO производства измерений используют комплект калориметрическое нитрита / нитрата. В 96-луночный планшет вставки 50 мкл буфера для анализа в один ряд, 70 мкл фенилантраниловая я реагента во второй ряд, и 70 мкл реагента Грисса II в третьем ряду.
- Для проведения эксперимента трехкратном повторе, подготовить четыре образца каждая из которых содержит 4,8 мкл 'химического датчика'. Для образца 1, добавляют 155,2 мкл буфера для анализа; к образцу 2, добавить 3,2 мкл GST-M1-1 и 152 мкл буфера для анализа; к образцу 3, добавьте 9,6 мкл PDGF и 145,6 мкл буфера для анализа; и к образцу 4, добавьте 3,2 мкл GST-M1-1, 9,6 мкл PDGF и 142,4 мкл буфера для анализа.
- Выдержите раствор при комнатной температуре в течение 10 мин.
- В 384-прозрачной луночного планшета, вставки 50 мкл образца в каждую лунку. Вставьте образцы только в нечетные или только вдаже скважины в той же строке, чтобы разрешить использование мульти-дозаторов для добавления субстрата.
- Добавить 0,54 мкл JS-K (5 мМ в ДМСО) в каждую лунку.
- С помощью 12-канального мульти-дозаторов, быстро добавляют по 10 мкл из раствора GSH (предварительно приготовленный в 96-луночный планшет), аккуратно перемешать и быстро, чтобы избежать пузырьков. Вставьте пластину в считывающее устройство и начать кинетического измерения.
- Сразу же после того, как кинетического измерения, с использованием 12-канального мульти-дозаторов, принимать по 50 мкл каждого образца в буфера для строки в заранее подготовленные 96-луночный планшет и быстро добавить к нему 50 мкл фенилантраниловая I реагента и 50 мкл Грисс II реагент. Выдержите, защищая от света в течение 10 мин при комнатной температуре и измеряют поглощение при 550 нм.
Примечание: Буфер для анализа и объемы реагентов зависят от протокола Аптечки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Дизайн, синтез и механизм действия в «химического преобразователя» , который может вызвать искусственную связь между PDGF и GST представлены на рисунке 2. Структура «преобразователя» интегрирует аптамер PDGF ДНК и бис-этакриновая амид (БЭА ), который является известным ингибитором GST (рис 2а). 19 Эти связующие позволяют 'датчик' , чтобы связывать как PDGF и GST с различным сродством, а именно, с константами диссоциации (K D 'ы) от 26 нМ и 144 нМ соответственно . 4 Кроме того, в соответствии с этой конструкции, связывание с PDGF должно вызывать неспецифических взаимодействий между блоком от BEA и поверхностью PDGF, которая бы заметно снизить эффективность ингибитора от BEA. 19,22,23 Рисунок 2b иллюстрирует рабочий механизм, лежащий в основе этой системы. После добавления '' датчика к активному GST, тодве единицы EA одновременно связывают оба активных участков этого димерного фермента и ингибировать его активность. В присутствии ФРПТ, однако,-'transducer ФРПТ комплекс "формируется, который предотвращает устройство от BEA от ингибирования GST. Это в свою очередь приводит к диссоциации GST-'transducer "сложной и GST реактивации. GST, может быть повторно ингибируется добавлением неизмененный PDGF аптамер, который смещает 'химический преобразователь' и позволяет ему снова подавлять GST.
Способность PDGF контролировать активность GST была впервые продемонстрирована путем измерения GST (10 нМ) активность с и без 'химического преобразователя' (500 нм), и измерения активности преобразователя комплекса GST-'chemical 'в присутствии различных концентраций ФРПТ (250, 500 и 1000 нм) (рис 3а). После установления, что "химический преобразователь 'индуцирует искусственную PDGF-GST связь, мыСледующим было установлено, что этот искусственный связи, аналогичны этапам сигнальной трансдукции, также является обратимым и быстро адаптируется к изменениям в окружающей среде. Реверсивный активация / торможение GST проводили последовательными добавлениями PDGF и PDGF неизмененном аптамеров к GST-'chemical преобразователя 'комплекс (рис 3b). Реакция системы на изменения в режиме реального времени в его среде оценивали путем измерения активности GST при добавлении различных входов. Быстрое увеличение GST активности наблюдалось при добавлении PDGF (750 нм) к GST-'transducer 'комплекса (10 500 нм, соответственно) 3,5 минут после добавления основания (рисунок 4а). Аналогичным образом , наблюдалось снижение GST активности при добавлении PDGF аптамеров (5 мкМ) в смеси GST (10 нМ), PDGF (750 нМ), и 'химический преобразователь' (500 нМ) (4б).
Fаконец, мы продемонстрировали способность такой системы, чтобы контролировать активацию пролекарственного в ответ на изменения в окружающей среде. JS-K является противораковым пролекарством активируется GST выделять токсичных NO (Рисунок 5а). Количество NO высвобождается при добавлении JS-K (45 мкМ) в 'химического датчика' (750 нм) и различных комбинаций GST (10 нМ) и PDGF (2 мкМ) были измерены (5б), таким образом подтверждая что только присутствие обоих GST и PDGF приведет к активации предшественника лекарственного средства.
Рисунок 2. 'Химический преобразователь -. Синтез и рабочий механизм (а)' химический преобразователь 'состоит из PDGF аптамеров, ингибитор GST двухвалентный этакриновая амид (EA), флуорофор (FAM) и гасителем (Dabcyl) , Этот конъюгат аптамеров-ингибиторсинтезируют путем присоединения азид-модифицированный этакриновая амид (ЕА) производного к dialkyne-модифицированного и флуоресцентно меченных ДНК аптамеров (ОДН-1). Перепечатана с разрешения автора из ссылки 4. (Б) Ферментативная активность GST ингибируется 'химического датчика', из - за связывания групп EA в активных участках фермента. Добавление ФРПТ приводит к формированию "комплекса, который разрушает 'PDGF-'chemical преобразователь взаимодействия transducer'-GST, поэтому восстановление ферментативной активности. Следующее добавление неизмененном PDGF аптамеров выпускает "химический датчик" и позволяет ему повторно ингибировать фермент. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Fi. фигура 3: PDGF-контролируемых GST активность (а) GST (10 нМ) , ферментативная активность в присутствии (-) и отсутствие (-) от «химического датчика» (500 нМ), и в присутствии 'химического датчика '(500 нМ) с возрастающими концентрациями (250, 500, или 1000 нм) ФРПТ (---). (Б) циклы ингибирования-активации ферментативной активности GST проявляющиеся изменением начальной скорости (V 0) в ответ на последовательные добавлений (ИГВ) ФРПТ и немодифицированной PDGF аптамеров к GST-'chemical преобразователя 'комплекс: (I) не существует, (II), PDGF (750 нМ), (III), PDGF аптамеров (4 мкМ), (IV ) ФРПТ (5 мкМ), и (V), PDGF аптамеров (10 мкМ). На графике представлены среднее значение ± СТАНДОТКЛОН из трех повторах. Перепечатана с разрешения ссылки 4. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версия этой фигуры.
. Рисунок 4: Управление в реальном времени от GST активности (а) Повышение GST ферментативной активности , обнаруживаемой сразу после добавления 750 нМ PDGF (-) к раствору , содержащему GST (10 нМ) и 'химического датчика' (500 нМ) ( -) при Т = 3,5 мин. (Б) Добавление немодифицированных ФРПТ аптамеров (5 мкМ) (-) к раствору , содержащему GST (10 нМ), PDGF (750 нм), а также "химический датчик" (500 нМ) (-) при Т = 1,5 мин приводит к немедленному уменьшению скорости ферментативной реакции. Перепечатана с разрешения ссылки 4. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
5 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54396 / 54396fig5.jpg "/>
Рис . 5: Controlled пролекарство активации (а) активации GST из JS-K пролекарством выделять токсичных NO. (Б) не высвобождают в присутствии 'химического датчика' и различными комбинациями GST (10 нМ) и PDGF (2 мкМ). На графике представлены среднее значение ± СТАНДОТКЛОН из трех повторах. Изменено с разрешения ссылки 4. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Минерва, Фондом HFSP организации, и научно-исследовательского гранта Европейского Совета (Начиная Грант 338265).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1-chloro-2,4-dinitrobenzene | Sigma-Aldrich | 237329 | |
Acetic acid | Bio Lab | 01070521 | |
Acetnitrile | J.T.Baker | 9017-03 | |
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
Copper(II) Sulfate pentahydrate | Merck-Millipore | 102790 | |
Dimethyl sulfoxide | Merck-Millipore | 802912 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological Industries | 02-023-5A | |
Ethacrynic acid | Tokyo Chemical Industry Co. Ltd | E0526 | |
Glutathione-s-transferase M1-1 | Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel) | ||
JS-K | Sigma-Aldrich | J4137 | |
L-glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251 | |
Magnesium Chloride | J.T.Baker | 0162 | |
nitrate/nitrite colorimetric assay kit | Cayman Chemical | 780001 | |
Oligonucleotides | W. M. Keck Foundation Biotechnology at Yale University | custom order | |
PDGF-BB | Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel) | ||
TBTA | Sigma-Aldrich | 678937 | |
Triethylamine | Sigma-Aldrich | T0886 | |
Desalting column | GE Healthcare | illustra MicroSpin G-25 Columns | |
HPLC | Waters | 2695 separation module | |
HPLC column | Waters | XBridgeTM OST C18 column (2.5 μM, 4.6 mm × 50 mm) | |
HPLC column | Waters | XBridgeTM OST C18 column (2.5 μM, 10 mm × 50 mm) | |
Plate reader | BioTek | synergy H4 hybrid |
References
- Hunter, T.
Signaling—2000 and Beyond. Cell. 100, 113-127 (2000). - Levitzki, A., Klein, S.
Signal transduction therapy of cancer. Mol Aspects Med. 31, 287-329 (2010). - Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. Artificial signal transduction therapy: a futuristic approach to disease treatment. Future Med. Chem. 7, 2091-2093 (2015).
- Peri-Naor, R., Ilani, T., Motiei, L., Margulies, D. Protein-Protein Communication and Enzyme Activation Mediated by a Synthetic Chemical Transducer. J. Am. Chem. Soc. 137, 9507-9510 (2015).
- Corson, T. W., Aberle, N., Crews, C. M. Design and Applications of Bifunctional Small Molecules: Why Two Heads Are Better Than One. ACS Chem. Biol. 3, 677-692 (2008).
- Rutkowska, A., Schultz, C. Protein Tango: The Toolbox to Capture Interacting Partners. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8166-8176 (2012).
- Meyer, C., Köhn, M. A Molecular Tête-à-Tête Arranged by a Designed Adaptor Protein. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8160-8162 (2012).
- Klemm, J. D., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Dimerization as a Regulatory Mechanism in Signal Transduction. Annu. Rev. Immunol. 16, 569-592 (1998).
- DeRose, R., Miyamoto, T., Inoue, T. Manipulating signaling at will: chemically-inducible dimerization (CID) techniques resolve problems in cell biology. Pflugers Arch. 465, 409-417 (2013).
- Gestwicki, J. E., Marinec, P. S. Chemical control over protein-protein interactions: beyond inhibitors. Comb. Chem. High Throughput. Screen. 10, 667-675 (2007).
- Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding. Supramol. Chem. 25, 848-862 (2013).
- Diezmann, F., Seitz, O. DNA-guided display of proteins and protein ligands for the interrogation of biology. Chem. Soc. Rev. 40, 5789-5801 (2011).
- Röglin, L., Ahmadian, M. R., Seitz, O. DNA-Controlled Reversible Switching of Peptide Conformation and Bioactivity. Angew. Chem. Int. Ed. 46, 2704-2707 (2007).
- Röglin, L., Altenbrunn, F., Seitz, O. DNA and RNA-Controlled Switching of Protein Kinase Activity. ChemBioChem. 10, 758-765 (2009).
- Harris, D. C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. DNA-Small Molecule Chimera with Responsive Protein-Binding Ability. J. Am. Chem. Soc. 130, 14950-14951 (2008).
- Harris, D. C., Saks, B. R., Jayawickramarajah, J. Protein-Binding Molecular Switches via Host-Guest Stabilized DNA Hairpins. J. Am. Chem. Soc. 133, 7676-7679 (2011).
- Kim, Y., Cao, Z., Tan, W. Molecular assembly for high-performance bivalent nucleic acid inhibitor. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5664-5669 (2008).
- Han, D., et al. A Logical Molecular Circuit for Programmable and Autonomous Regulation of Protein Activity Using DNA Aptamer-Protein Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 20797-20804 (2012).
- Motiei, L., Pode, Z., Koganitsky, A., Margulies, D. Targeted Protein Surface Sensors as a Tool for Analyzing Small Populations of Proteins in Biological Mixtures. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 9289-9293 (2014).
- Ranallo, S., Rossetti, M., Plaxco, K. W., Vallée-Bélisle, A., Ricci, F. A Modular, DNA-Based Beacon for Single-Step Fluorescence Detection of Antibodies and Other Proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 54, 13214-13218 (2015).
- Franzini, R. M., et al. Identification of Structure-Activity Relationships from Screening a Structurally Compact DNA-Encoded Chemical Library. Angew. Chem. Int. Ed. 54, 3927-3931 (2015).
- Unger-Angel, L., et al. Protein recognition by bivalent, 'turn-on' fluorescent molecular probes. Chem. Sci. 6, 5419-5425 (2015).
- Nissinkorn, Y., et al. Sensing Protein Surfaces with Targeted Fluorescent Receptors. Chem. Eur. J. 21, 15981-15987 (2015).
- Huber, C. G., Oefner, P. J., Bonn, G. K. High-Resolution Liquid Chromatography of Oligonucleotides on Nonporous Alkylated Styrene-Divinylbenzene Copolymers. Anal. Biochem. 212, 351-358 (1993).
- Lyon, R. P., Hill, J. J., Atkins, W. M. Novel class of bivalent glutathione S-transferase inhibitors. Biochemistry. 42, 10418-10428 (2003).
- Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding. Supramol. Chem. , 1-16 (2013).