En forbedret polymerasekædereaktion-restriktionsfragmentlængde-polymorfisme metode til genotypebestemmelse pufferfish arter ved væskekromatografi / massespektrometri beskrives. En omvendt fase silica monolit kolonne anvendes til separation fordøjede ampliconer. Denne metode kan belyse de monoisotopisk masser af oligonukleotider, som er nyttige til identifikation af basesammensætning.
En forbedret version af en polymerasekædereaktion (PCR) -Indskrænkning polymorfisme (RFLP) metode til genotypebestemmelse toksiske pufferfish arter ved væskekromatografi / elektrospray ionisering massespektrometri (LC / ESI-MS) er beskrevet. DNA-ekstraktion udføres under anvendelse af en silica-membran-baserede DNA-ekstraktion kit. Efter PCR-amplifikation under anvendelse af et detergent-fri PCR-buffer, der restriktionsenzymer tilsættes til opløsningen uden oprensning af reaktionsopløsningen. En omvendt fase silica monolit-søjle og en Fouriertransformation høj opløsning massespektrometer med en modificeret Kingdon fælde analysator anvendes til separation og detektion hhv. Den mobile fase, bestående af 400 mM 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol, 15 mM triethylamin (pH 7,9) og methanol, afgives ved en strømningshastighed på 0,4 ml / min. Cyklustiden for LC / ESI-MS-analyse er 8 min herunder ækvilibrering af søjlen. Udfoldning software med en isotop distributionsmodel of oligonukleotidet anvendes til at beregne en tilsvarende monoisotopisk masse fra massespektret. Til analyse af oligonukleotider (interval 26-79 nukleotider), masse nøjagtighed var 0,62 ± 0,74 ppm (n = 280) og fremragende nøjagtighed og præcision blev opretholdt i 180 timer uden brug af en lås masse standard.
Massespektrometri (MS) er en accepteret teknologi til hurtig og pålidelig identifikation af nukleinsyrer, matrix-assisteret laser desorption / ionisering (MALDI) og elektrospray ionisering (ESI) anvendes til ionisering 1,2. MALDI teknik er typisk kombineret med et time-of-flight (TOF) analysator; imidlertid er anvendelsen af MALDI-TOF MS begrænset til korte oligonukleotider (~ 25 nukleotider (nt)) på grund af efterfølgende opsplitning, adduktdannelse og lav ionisering effektivitet 1,2. I modsætning hertil ESI er anvendelig til længere oligonukleotider (> 100 nt), men mange opladningstilstand af multiple ladede ioner ([M-nH] n-) fremstilles samtidigt fra biomakromolekyler og dermed massen af analysanden kan overstige den øvre grænse for m / z spektrometrets. Dette kræver en fortolkning af den komplicerede spektre, dvs. omdannelse af en afgift tilstand serie i den tilsvarende massevia udfoldning.
I tilfælde af massen måling af et lille molekyle, toppen af monoisotopisk masse, dvs. massen af molekylet, som kun indeholder de mest almindelige isotop af hvert element er den mest rigelige og observerede naturligt 3. Da de molekylære vægt stiger, bliver de isotopiske distributions- skifter til højere m / z og monoisotopisk peak skjult af baseline støj 3-5. Når monoisotopisk top er ikke længere påviselig for masserne på mere end 10 kDa 3, er den gennemsnitlige molekylmasse anvendes til måling i stedet for den monoisotopiske masse 5. I sådanne tilfælde kan kun observeres den isotopiske distribution i hvilken hver af de enkelte toppe adskilt af 1 Da når en høj opløsning masseanalysator, såsom en TOF, en Fourier transformation, modificeret Kingdon fælde analysatoren 6, eller en Fourier-transformation-cyklotron-resonans analysator anvendes til analyse. Men den mest udbredte top er sometimes ikke i overensstemmelse med den gennemsnitlige molekylmasse 5. Disse problemer kan føre til problemer for nøjagtig bestemmelse analytter.
I betragtning af den variation i den naturlige overflod af stabile isotoper og vanskelighederne i de bestemmende den gennemsnitlige molekylmasse, måling af monoisotopisk masse er ideel til masse karakterisering af biomolekyler 3,4. I praksis om en monoisotopiske top kan observeres eller ej, monoisotopisk masse kan estimeres ved sammenligning af mønsteret af den observerede isotopiske distribution til den teoretisk beregnet ud fra en model analyt 4,7-10. Beslaget algoritme 8 er nu indarbejdet i proprietær software.
I forbindelse med ESI-MS, der dissociation af et DNA-duplex, oprensning og afsaltning kræves til direkte måling for at undgå svigt af ionisering grund ion suppression og adduktdannelse 2,10-14. Disse procedurer er troublesome imidlertid fuldautomatiske analytiske systemer er blevet udviklet kommercielt involverer polymerasekædereaktion (PCR), prøveforberedelse og ESI-MS til påvisning af patogener 15-20. En anden fremgangsmåde er at indføre væskekromatografi (LC) til adskillelse. LC giver en on-line adskillelse af analytter fra sameksisterende stoffer og kræver ikke en møjsommelig prøvefremstilling forud for ionisering 21,22. Imidlertid adskillelse af nucleinsyrer ved anvendelse af en MS-kompatibel mobile fase er sværere end for de fleste andre forbindelser såsom lægemidler, peptider og proteiner på grund af den polyanioniske karakter af nukleotiderne. De mest succesfulde eksempler på LC / ESI-MS involverer anvendelse af ion-pair omvendt fase LC. En mobil fase af 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol (HFIP) -triethylamine (TEA) -methanol blev oprindeligt foreslået af Apffel et al. Til separering og detektering korte oligonukleotider 23. Anvendelse af LC / ESI-MS genotypebestemmelse for differentiation af patogene arter, single-nukleotid polymorfier og korte tandemgentagelser er blevet rapporteret ved hjælp af en kapillær polymer-monolit kolonne, der kan adskille længere oligonukleotider 1,21,24-33.
I Japan og USA, har alvorlig madforgiftning opstået på grund af fejlagtig identifikation og uhensigtsmæssig forberedelse af kuglefisk, og det er på trods af, at fordelingen og forberedelse af pufferfish strengt kontrolleret af fødevaresikkerhed 34,35. I øvrigt har en forsætlig drab hjælp pufferfish ekstrakt forekomme i Japan 36. Derfor er differentiering af pufferfish arter kræves af både folkesundheden og retsmedicinske efterforskningsmæssige standpunkter. Desuden, fordi japansk kuglefisk rubripes er langt dyrere end andre former for pufferfish, er der også behov en differentiering kapacitet i forbindelse med undersøgelser af svig mad.
Her en detaljeret metode til bestemmelse af monoisotopic massen af et PCR-produkt ved LC / ESI-MS ved anvendelse af en omvendt fase silica monolit-søjle og en høj opløsning massespektrometer er beskrevet. Specifikt har den fremgangsmåde blevet udviklet til at tillade differentiering af toksiske pufferfish arter baseret på anvendelsen af PCR restriktionsfragmentlængde-polymorfisme den (RFLP) -metoden 37, som er det første eksempel på arter differentiering af dyr under anvendelse af MS.
For at udvinde DNA, er et kommercielt kit til ekstraktion af DNA fra blod og væv anvendes i overensstemmelse med protokollen af fabrikanten mindre modifikation (mængde proteinase K og centrifugering af lysis opløsning). Imidlertid kan enhver ekstraktion kit anvendes, så længe som cellulært DNA kan ekstraheres med passende genvinding og renhed til PCR. Denne metode er blevet testet under anvendelse af muskler, fin, lever, ovarie, og huden 37. Fin er specielt velegnet på grund af det store areal, der muliggør hurtig lysis med proteinase K. Frisk, frosne, tørrede, kogt og bagt pufferfish prøver blev testet med succes 37.
PCR-primersættet (tabel 1) er designet til pufferfish og forstærker det mitokondrielle 16S ribosomale RNA gen af pufferfish. Mål-DNA til amplifikation er 114-115 bp (slægt japansk kuglefisk) og 86 bp (slægt Lagocephalus) (tabel 5). For at lette metode development, blev syntetiseret oligonukleotider med målsekvenserne anvendes til henvisningen i stedet for at indsamle autentiske pufferfish prøver. Primersættet kan erstattes af en anden primersæt som reaktion på formålet bør imidlertid endelige DNA længde efter enzymatisk fordøjelse være mindre end 100 nt med hensyn til at opretholde kvaliteten af massespektret kræves for en vellykket udfoldning. Derudover bør nitrogentryk i C-fælden blive reduceret, når mål-oligonukleotidet er længere end omkring 75 nt og kvaliteten af massespektret er utilstrækkelig til vellykket udfoldning. Sådanne begrænsninger kan styres gennem den seneste udvikling i instrument software, ellers skal være indstillet ventilen for C-fælden inde chassiset som beskrevet i protokollen sektion. Som for prøveforberedelse, brug af detergent-fri reagenser er kritisk for den efterfølgende LC i form af passende topform, tilstrækkelig topintensitet og stabil retentionstid 31.
<p class = "jove_content"> en PS-DVB kapillær monolit kolonne 21,24-33, en C18 omvendt fase partikelformet silicakolonne 23,40,41 og en hydrofob interaktions-kromatografi (HILIC) søjle 42 er blevet anvendt til LC / ESI-MS-analyse af oligonukleotider. Blandt dem, den kapillære monolit kolonne er overlegen i forhold til de andre i form af adskillelse kapacitet imidlertid den kapillære monolit anvendte søjle i tidligere undersøgelser blev foretaget internt og drives ved en lav strømningshastighed (2 pl / min), hvilket kræver instrumentering dedikeret til mikro LC. For at lette nem betjening, blev kommercielt tilgængelige søjler evalueret for separation af lange oligonukleotider ved højere strømningshastigheder (100-400 pi / min). Tre par DNA-duplekser (26, 37 og 53 bp) blev adskilt under anvendelse af de ovenfor nævnte søjler imidlertid cyklustiderne af C 18 -bundne partikelformet silicasøjle og PS-DVB monolit kolonnen var 65 og 70 min, henholdsvis , mens den for C <sub> 18 -bundne silica monolit kolonne var 8 min (figur 1). Idet hurtig analyse i betragtning, blev silica monolit kolonnen C18 -bundne valgt til vores formål Trods den begrænsede adskillelse kapacitet; imidlertid de resterende to kolonner kan anvendes, når forbedret adskillelse er påkrævet. Teoretisk er tale om en monolit kolonne, er der ingen mellemliggende volumen og den mobile fase ville blive tvunget til at strømme gennem porerne den faste fase og samtidig opretholde en konsistent vejlængde, hvilket muliggør en effektiv adskillelse 27. Sådanne fremgangsmåder ville være manifesteret, især i analysen af biomakromolekyler såsom et oligonukleotid, som den langsomme diffusion af store molekyler. En af de praktiske fordele ved en monolit kolonne er at modtrykket er lavere end for et partikelformet silicasøjle 27. Trods den høje strømningshastighed (400 pl / min) og lav søjletemperatur (20 ° C), maksimalt modtryksystemet var 12,5 MPa 37. Dette er den første demonstration af fordelen ved en C18 -bundne silica monolit kolonnen for hurtig analyse af en lang oligonucleotid. På grund af den høje strømningshastighed, er en særligt instrument til micro LC og præcis justering ved grænsefladen ikke påkrævet. I stedet er en opvarmet ESI sonde der kræves for at adskille DNA duplex og hjælpe ionisering af DNA som beskrevet senere.Ionpar chromatografi anvendes almindeligvis til MS-kompatibel adskillelse af oligonukleotider. Men en ion-pair reagens generelt interfererer med ESI-processen og reducerer følsomheden af ESI-MS. Derfor HFIP ofte anvendes til den mobile fase for at forbedre følsomheden af oligonukleotidet. Imidlertid HFIP (kogepunkt 59 ° C) fordamper hurtigt ved grænsefladen før methanol (kogepunkt 65 ° C), og derfor dette tab af opløsningsmiddel forøger pH og fremmer dissociation af ion-pair-reagens (dvs. TEA)fra oligonukleotidet. Fordi den foreliggende fremgangsmåde anvender en opvarmet ESI sonde, som nebulizes eluatet med varm nitrogengas ved 350 ° C, kan denne effekt overvurderes. I stedet for HFIP-TEA buffer, Erb og Oberacher anbefalede cyclohexyldimethylammonium acetat (CycHDMAA; pH 8,4) til genotypning analyse på grund af en reduktion i adduktdannelse med spormetalioner 33. Forfatterne udledes, at CycHDMAA selv undertrykte dannelsen af metallet adduktet. Trods litteraturen, har signifikant adduktdannelse ikke observeret i den foreliggende fremgangsmåde. Derudover bemærkelsesværdigt fordel for HFIP-TEA-methanol-system er, at toparealet opnås med HFIP-TEA-methanol-system var 17 gange større end det, der opnås fra CycHDMAA-acetonitril-system, når man analyserer en 86 bp amplikon af T. poecilonotus (data ikke vist). En ulempe ved den HFIP-TEA-methanol-system, er imidlertid de øgede omkostninger i forhold til CycHDMAA-acetonitril-system.
Beregning af monoisotopisk masse kræver adskillelse af isotopiske toppe af multipelt ladede ioner. Derfor opløsning er kritisk for den foreliggende analyse. Selvom fornødne opløsningsevne er afhængig af basepar længde af analysanden, konventionelle TOF-analysatorer, som har en opløsningsevne på flere titusinder, kan begrænses til analyse af korte oligonukleotider.
De teoretiske monoisotopisk masserne vist i tabel 4 blev beregnet ud fra den tilsvarende base sammensætninger af analytter. Alternativt Muddiman et al. Udviklet et program til at beregne basen sammensætning fra præcise masse 43. Et lignende program blev integreret i den automatiske ESI-MS systemet 16-18. Brugen af disse algoritmer kan forbedre robustheden af den nuværende metode, fordi en målt monoisotopisk masse ikke altid svarer til en unik bund sammensætning ofløj til massen tolerance på 3 ppm som følge af den uundgåelige målefejl. Desværre kunne vi ikke få disse software produkter til denne undersøgelse.
Den foreliggende monoisotopisk massebaserede artsbestemmelse kan være egnet ikke kun for differentieringen af pufferfish men også til påvisning af andre DNA-polymorfismer, fordi den foreliggende fremgangsmåde er baseret på analyse af basesammensætning og ikke indebærer en procedure særligt udformet til pufferfish. Som til påvisningen af DNA-polymorfisme, den dedikerede ESI-MS systemet er fuldt automatiseret og let at betjene, hvilket kan være egnet til diagnostisk anvendelse, såsom detektion af patogener 15,17,18,20,30. Omvendt er den nuværende metode er muligt med fælles forsknings- instrumenter og apparater og derfor, velegnet til forskning anvendelser. ESI-MS er allerede blevet anvendt til humant DNA polymorfi såsom enkelt nukleotid polymorfisme 13,28,32, kort tandem gentagelse 26Og mitokondrie-DNA analsis 16,19. Micro RNA blev også analyseret via kapillær LC / ESI-MS 44. Disse offentliggjorte ansøgninger kan også realiseres ved den foreliggende fremgangsmåde. Desuden kan denne fremgangsmåde være egnet til overvågning af samspillet mellem oligonucleotid og lav molekylvægt forbindelser, såsom interaktionen af antibiotika og ribosomalt RNA 45 på grund af lav temperatur separation. I sådanne tilfælde, oligonukleotider og lav molekylvægt forbindelser bør detekteres samtidigt, hvilket er en fordel ved anvendelse af LC / ESI-MS.
Der er en begrænsning, at instrumentering er ikke egnet til at udføre parallel analyse som i traditionelle teknikker, såsom Sanger sekventering og real-time PCR. Desuden er den nuværende metode kun identificerer basesammensætning og enhver base, ombytning efter samme molekyle kan ikke skelnes. Dog kan MS-baserede DNA-analyse beskrevet her stadig har værdi i sigts af nøjagtighed i forhold til det DNA-bindende farvestof-baserede teknikker, såsom gelelektroforese og real-time PCR.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research by the Japanese Society for the Promotion of Science (15K08060).
DNeasy Blood & Tissue Kit (50) | Qiagen | 69504 | DNA extraction kit |
Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
Ethanol (99.5+ vol%) | Wako | 054-07225 | For dilution of wash buffers |
TE buffer (pH 8.0) | Wako | 310-90023 | For dilution of DNA sample |
PCR primer | Fasmac | NA | Purified with reverse-phase cartridge column by the supplier |
Template DNA | Eurofins Genomics | NA | Purified by HPLC by the supplier |
Ultrapurified water | NA | NA | Generated with a Milli-Q Direct water purification system (Merck Millipore), used for sample preparation |
Detergent Free 5X Phusion HF Buffer | Thermo Fisher | F-520L | Use instead of the provided buffer of DNA polymerase |
Pfu-X DNA polymerase | Jena Bioscience | PCR-207S | |
dNTP mix (20 mM each) | Jena Bioscience | NA | Supplied with the DNA polymerase |
10× Universal buffer M | Takara Bio | NA | Containing 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol and 500 mM NaCl |
Dra I | Thermo Fisher | FD0224 | Restriction enzyme |
Msp I | Thermo Fisher | FD0544 | Restriction enzyme |
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Fluka | 42060-50ML | Eluent additive for LC-MS grade. |
Triethylamine (TEA) | Fluka | 65897-50ML | Eluent additive for LC-MS grade. |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | For preparation of calibrant. |
Sodium hydroxide (1.0 M) | Fluka | 72082 | Dilute to 10 mM with ultrapurified water and use for titration of trifluoroacetic acid. |
Acetonitrile | Fluka | 34967 | For preparation of calibrant, LC/MS grade. |
Methanol | Kanto | 25185-76 | For mobile phase, LC/MS grade. |
Water | Thermo Fisher | W6-1 | For mobile phase, LC/MS grade. |
Microcentrifuge tube (0.5 ml) | Eppendorf | 0030123301 | PCR clean grade |
Microcentrifuge tube (1.5 ml) | Eppendorf | 0030123328 | PCR clean grade |
UVette | Eppendorf | 0030106300 | Disposable UV cuvette. |
Gel Green | Biotium | 41004 | Fluorescent DNA stain |
Cosmospin filter G (0.2 μm) | Nakalai Tesque | 06549-44 | Made of hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane. Any centrifugal filter unit (pore size, 0.2–0.5 μm) made of hydrophilic PTFE or another low-binding membrane is applicable. |
300-μl PP screw vial | American Chromatography Supplies | V0309P-1232 | |
Preassembled screw cap and septa | Finneran | 5395-09R | |
Monobis C18 analytical column (2.0×50 mm, mesopore size = 30 nm) | Kyoto Monotech | 2050H30ODS | Outside Japan, available for purchase from GL Sciences via its distributors. (http://www.glsciences.com/distributors/) |
Monobis C18 guard column | Kyoto Monotech | GCSET-ODS3210 | Holder included. |
Cadenza CW-C18 (3.0×250 mm) | Imtakt | CW036 | C18-bonded particulate silica column |
ProSwift RP-4H (1.0×250 mm) | Thermo Fisher | 066640 | Poly(styrene-divinylbenzene) monolith column |
Themo Mixer C | Eppendorf | 5382 000.023 | For digestion of fish tissues. |
Spectrophotometer | Shimadzu | UV-3150 | Quantification of DNA concentration. |
Thermal cycler | Bio-Rad | T100 | |
Portable refrigerator | Twinbird | D-CUBE | For aqueous mobile phase to avoid evaporation of HFIP. This can be replaced by an ice box. |
Ultimate 3000 liquid chromatograph | Thermo Fisher | NA | |
Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher | NA | Fourier transform mass spectrometer equipped with the modified Kingdon trap analyzer. |
Protein deconvolution 3.0 | Thermo Fisher | NA | Use version 3.0 or higher having an isotopic patter model of nucleotide. |