En forbedret polymerasekjedereaksjon-rflp Fremgangsmåte for genotyping Pufferfish art ved væskekromatografi / massespektrometri er beskrevet. En omvendt-fase silika-kolonne monolitten anvendes for separering av fordøyd amplikoner. Denne metoden kan belyse monoisotopic massene av oligonukleotider, noe som er nyttig for å identifisere basesammensetning.
En forbedret versjon av en polymerase kjedereaksjon (PCR) -restriction fragmentlengde-polymorfisme (RFLP) Fremgangsmåte for genotyping giftige Pufferfish art ved væskekromatografi / elektrospray ionisering-massespektrometri (LC / ESI-MS) er beskrevet. DNA-ekstraksjon blir utført ved anvendelse av en silika-membran-baserte DNA ekstraksjon kit. Etter at PCR-amplifikasjon ved bruk av en detergent-fri PCR-buffer, blir restriksjonsenzymer tilsatt til den løsning uten rensing av reaksjonsløsningen. En omvendt-fase silika-kolonne og monolitt en Fourier-transform med høy oppløsning massespektrometer med en modifisert Kingdon felle analysator anvendes for separasjon og deteksjon, respektivt. Den mobile fasen, bestående av 400 mM 1,1,1,3,3,3-heksafluor-2-propanol, 15 mM trietylamin (pH 7,9) og metanol blir levert ved en strømningshastighet på 0,4 ml / min. Syklustiden for LC / ESI-MS-analyse er 8 min inklusive ekvilibrering av kolonnen. Deconvolution programvare har en isotop distribusjonsmodell of oligonukleotidet blir brukt til å beregne den tilsvarende monoisotopic masse fra massespektrum. For analyse av oligonukleotider (spredning 26-79 nukleotider), masse nøyaktighet var 0,62 ± 0,74 ppm (n = 280) og utmerket nøyaktighet og presisjon ble opprettholdt i 180 timer uten bruk av en lås masse standard.
Massespektrometri (MS) er en akseptert teknologi for rask og pålitelig identifikasjon av nukleinsyrer, matriks-assistert laserdesorpsjon / ionisering (MALDI) og elektrospray ionisering (ESI) som brukes for ionisering 1,2. Den MALDI teknikken er vanligvis kombinert med en time-of-flight (TOF) analysator; imidlertid er anvendelsen av MALDI-TOF-MS begrenset til korte oligonukleotider (~ 25 nukleotider (nt)) på grunn av det påfølgende fragmentering, adduktdannelse og lav ionisering effektivitet 1,2. I motsetning til dette er ESI gjelder for lengre oligonukleotider (> 100 nt), men mange ladetilstander på multippel ladede ioner ([M-nH] n-) fremstilles samtidig fra biomacromolecules og dermed massen av analytten kan overstige den øvre grensen for m / z spekter av spektrometeret. Dette krever tolkning av korrugert spektra, dvs. omdanning av en ladetilstand serie til den tilsvarende massevia deconvolution.
I tilfelle av massen måling av et lite molekyl, toppen av monoisotopic masse, det vil si, er massen av molekylet inneholdende bare den vanligste isotop av hvert element den mest tallrike og observert naturlig tre. Som de molekylære øker vekten, blir isotoper distribusjons skifter til høyere m / z og monoisotopic topp skjult av baseline støy 3-5. Når monoisotopic toppen lenger kan påvises for masser som er større enn 10 kDa 3, er den gjennomsnittlige molekylvekt som brukes for måling i stedet for monoisotopic massen 5. I slike tilfeller kan det isotop-fordeling hvor hver av de individuelle topper blir atskilt med en Da bare observeres når en høy oppløsningsmasse analysator slik som et TOF, en Fourier-transform modifisert Kingdon felle analysator 6, eller en Fourier-transformasjon ion syklotron resonans analysator er brukt for analyse. Imidlertid er den mest tallrike topp sometimes ikke forenlig med gjennomsnittlig molekylvekt 5. Disse problemene kan føre til problemer for nøyaktig bestemmelse av analytter.
På grunn av variasjonen i den naturlige overflod av stabile isotoper og vanskelighetene i den bestemmer den midlere molekylvekt, er måling av monoisotopic massen ideell for masse karakterisering av biomolekyler 3,4. I praksis om en monoisotopic topp kan observeres eller ikke, den monoisotopic massen kan bli estimert ved å sammenligne mønsteret av den observerte isotopiske distribusjon til den teoretiske en beregnet fra en modell analytt 4,7-10. Beslaget algoritmen 8 er nå innlemmet i proprietær programvare.
I sammenheng med ESI-MS, er dissosiasjon av en DNA-dupleks, rensing og avsalting som kreves for direkte måling for å unngå svikt i ionisering grunnet ion undertrykkelse og adduktdannelse 2,10-14. Disse prosedyrene er troublesome imidlertid helautomatisk analysesystemer er blitt utviklet kommersielt som omfatter polymerase kjedereaksjon (PCR), prøvepreparering og ESI-MS for påvisning av patogener 15-20. En annen tilnærming er å innføre væskekromatografi (LC) for separasjon. LC gir en on-line separasjon av analytter i kjøl stoffer og krever ikke en arbeidskrevende prøvepreparering før ioniseringshodet 21,22. Imidlertid er separasjonen av nukleinsyrer ved hjelp av en MS-kompatibel mobil fase vanskeligere enn for de fleste andre forbindelser, så som medikamenter, peptider og proteiner på grunn av den polyanioniske art av nukleotidene. De mest vellykkede eksemplene på LC / ESI-MS involverer bruk av ione-par omvendt-fase LC. En mobil fase av 1,1,1,3,3,3-heksafluor-2-propanol (HFIP) -triethylamine (TEA) -metanol ble opprinnelig foreslått av Apffel et al. For separering og detektering av korte oligonukleotider 23. Bruk av LC / ESI-MS genotyping for differentiation av patogene arter, enkelt-nukleotid polymorfismer og korte tandemrepetisjoner er rapportert ved bruk av en kapillær polymer-monolitt kolonne som kan skille lengre oligonukleotider 1,21,24-33.
I Japan og USA, har alvorlig matforgiftning oppstått på grunn av feilidentifisering og upassende utarbeidelse av pufferfish, og dette er til tross for at fordelingen og utarbeidelse av pufferfish er strengt kontrollert av mat sikkerhetslovgivningen 34,35. Videre en tilsiktet mord ved hjelp pufferfish ekstrakt skjedde i Japan 36. Derfor er differensiering av Pufferfish arter kreves fra både folkehelsen og rettsmedisinske etterforsknings standpunkter. I tillegg, fordi Takifugu rubripes er langt dyrere enn andre typer pufferfish, en differensiering kapasitet er også nødvendig i sammenheng med mat svindel undersøkelser.
Her er en detaljert fremgangsmåte for å bestemme monoisotopic masse av et PCR-produkt ved LC / ESI-MS ved anvendelse av en revers-fase silika-kolonne og monolitt en høy oppløsning massespektrometer beskrives. Nærmere bestemt, har tilnærmingen er utviklet for å muliggjøre differensiering av toksiske Pufferfish arter basert på bruk av PCR rflp (RFLP) metode 37, som er det første eksempel på arter differensiering av dyr ved hjelp av MS.
For å ekstrahere DNA, er et kommersielt sett for å ekstrahere DNA fra blod og vev som brukes i henhold til protokollen fra produsenten med mindre modifiseringer (mengde av proteinase K og sentrifugering av lysis løsning). Imidlertid kan en hvilken som helst ekstraksjon kit benyttes så lenge som cellulært DNA kan ekstraheres med passende utvinning og renhet for PCR. Denne fremgangsmåten har blitt testet ved hjelp av muskler, finnen, lever, ovarie, og hud 37. Fin er spesielt egnet på grunn av det store arealet, noe som muliggjør rask lysis med proteinase K. fersk, frossen, tørket, kokt og bakt Pufferfish prøver ble testet med hell 37.
PCR primersett (tabell 1) er utformet for pufferfish og forsterker den mitokondrielle 16S ribosomal RNA genet av pufferfish. Mål-DNA for å forsterke er 114-115 bp (genus Takifugu) og 86 bp (genus Lagocephalus) (tabell 5). For å lette metoden development, ble syntetisert oligonukleotider som har de målsekvenser som brukes for referanse i stedet for å samle autentiske Pufferfish prøver. Den primersett kan erstattes av en annen primer angitt i respons til formålet, men endelige DNA-lengde etter enzymatisk spaltning bør være mindre enn 100 nt når det gjelder å opprettholde kvaliteten av massespekteret som kreves for vellykket dekonvolvering. I tillegg bør nitrogentrykk i den C-felle reduseres når målet oligonukleotidet er lengre enn 75 nt, og kvaliteten på massespekteret er utilstrekkelig for vellykket dekonvolvering. Slike begrensninger kan styres via den senere tids utvikling i instrument-programvare, ellers ventilen for den C-fellen inne i selve kabinettet må innstilles som beskrevet i fremgangs delen. Som for prøveopparbeidelse, er bruk av vaskemiddel frie reagenser kritisk for den påfølgende LC i form av passende topp form, tilstrekkelig peak intensitet og stabil oppholdstid 31.
<p class = "jove_content"> A PS-DVB kapillar-monolitt kolonne 21,24-33, en C-18 revers-fase partikkelformig silikakolonne 23,40,41 og en hydrofob interaksjonskromatografi (HILIC) kolonne 42 er blitt anvendt for LC / ESI-MS analyse av oligonukleotider. Blant dem er det kapillære monolitten kolonnen overlegne i forhold til de andre i form av separasjonskapasiteten, men det kapillær monolitten kolonnen som brukes i tidligere studier ble gjort i huset og drevet ved en lav strømningshastighet (2 mL / min), noe som krever instrumentering dedikert til micro LC. For å lette enkel betjening, ble kommersielt tilgjengelige kolonner evaluert for separasjon av lange oligonukleotider ved høyere strømningshastigheter (100 til 400 ul / min). Tre par av DNA-duplekser (26, 37 og 53 bp) ble separert ved anvendelse av de ovennevnte kolonner, imidlertid syklustider på C-18-bundet partikkelformig silikakolonne og PS-DVB monolitten kolonne var 65 og 70 min, respektivt , mens det av den C- <sub> 18-bundet silika monokolonne var 8 min (figur 1). Tar rask analyse i betraktning, ble den C-18-bundet silika monokolonne valgt for vårt formål til tross for den begrensede separasjonskapasiteten; men de gjenværende to kolonner kan anvendes når forbedret separasjon er påkrevd. Teoretisk sett, i tilfelle av en monokolonne, er det ingen mellomliggende volum, og den mobile fase vil bli tvunget til å strømme gjennom porene i den faste fase og samtidig opprettholde en konsistent banelengde, og dermed muliggjør en effektiv separering 27. Slike prosesser vil bli åpenbart, spesielt i analyse av biomacromolecules slik som et oligonukleotid, som den langsomme diffusjon av de store molekyler. En av de praktiske fordelene ved et monolitt kolonne er at det mottrykk er lavere enn den til en partikkelformet silikakolonne 27. Til tross for den høye strømningshastighet (400 ul / min) og lav kolonnetemperatur (20 ° C), maks mottrykk avSystemet var 12,5 MPa 37. Dette er den første demonstrasjon av fordelen av en C-18-bundet silika monokolonne for hurtig analyse av en lang oligonukleotid. På grunn av den høye strømningshastighet, er en dedikert instrument for mikro LC og presis justering ved grenseflaten ikke er nødvendig. I stedet er en oppvarmet ESI sonde er nødvendig for å dissosiere DNA-dupleks og hjelpe til ionisering av DNA som beskrevet senere.Ionepar-kromatografi er vanligvis brukes for MS-kompatible separasjon av oligonukleotider. Imidlertid kan en ione-par-reagens generelt forstyrrer ESI prosessen og reduserer følsomheten av ESI-MS. Derfor er HFIP ofte brukt for den mobile fasen for å forbedre følsomheten av oligonukleotidet. Imidlertid HFIP (kokepunkt 59 ° C) fordamper hurtig ved grenseflaten før metanol (kokepunkt 65 ° C), og derfor dette tapet av oppløsningsmiddel øker pH og fremmer dissosiasjon av ione-par-reagens (dvs. TEA)fra oligonukleotidet. Fordi den foreliggende fremgangsmåte anvender en oppvarmet ESI sonde, som nebulizes eluatet med varm nitrogengass ved 350 ° C, kan denne effekten understrekes sterkt nok. I stedet for HFIP-TEA buffer, Erb og Oberacher anbefales cyclohexyldimethylammonium acetat (CycHDMAA, pH 8,4) for genotyping analyse på grunn av en reduksjon i adduktdannelse med spormetallioner 33. Forfatterne sluttet at CycHDMAA seg undertrykket dannelsen av metall adduktet. Til tross for den litteratur, har betydelig adduktdannelse ikke blitt observert i den foreliggende fremgangsmåte. Dessuten er det bemerkelsesverdig fordel for HFIP-TEA-metanol system at topparealet oppnådd med HFIP-TEA-metanol system var 17 ganger større enn det som ble oppnådd fra den CycHDMAA-acetonitril-system for å analysere en 86 bp fragment av T. poecilonotus (data ikke vist). En ulempe ved de HFIP-TEA-metanol system, er imidlertid den økte kostnaden i forhold til den CycHDMAA-acetonitril-system.
Beregning av monoisotopic massen krever separasjon av isotoper toppene formere ladede ioner. Derfor er oppløsning kritisk for den foreliggende analyse. Selv om nødvendig oppløsning strømmen er avhengig av basepar lengde av analytten, konvensjonelle TOF analysatorer, som har en oppløsning kraft på flere titalls tusen, kan være begrenset til analyse av korte oligonukleotider.
De teoretiske monoisotopic massene er vist i tabell 4, ble beregnet ut fra den tilsvarende base sammensetninger av analytter. Alternativt Muddiman et al. Utviklet et program for å beregne basesammensetningen fra nøyaktig masse 43. Et lignende program ble integrert i automatiserte ESI-MS system 16-18. Bruken av disse algoritmene kan forbedre robustheten den nåværende metoden fordi en målt monoisotopic masse ikke alltid svarer til en unik base komposisjon ovinge til massen toleranse på 3 ppm som følge av den uunngåelige målefeil. Dessverre kunne vi ikke få tak i disse programvareprodukter for denne studien.
Den foreliggende monoisotopic masse-basert bestemmelse art kan være egnet ikke bare for differensiering av pufferfish men også for påvisning av andre DNA-polymorfismer fordi den foreliggende fremgangsmåte er basert på analyse av basisblandingen og ikke involverer en prosedyre spesielt utformet for pufferfish. Når det gjelder påvisning av DNA-polymorfisme, er den dedikerte ESI-MS system helautomatisk og lett å betjene, noe som kan være egnet for diagnostisk anvendelse slik som påvisning av patogener 15,17,18,20,30. Omvendt er den foreliggende fremgangsmåte mulig med vanlige forskningsinstrumenter og apparater, og derfor egnet for forsknings- formål. ESI-MS har allerede blitt brukt til menneskelig DNA polymorfisme som enkeltnukleotidpolymorfi 13,28,32, kort tandem repetisjon 26Og mitokondrielle DNA analsis 16,19. Micro RNA ble også analysert via kapillær LC / ESI-MS 44. Disse publiserte søknader kan også realiseres ved den foreliggende fremgangsmåte. I tillegg kan denne metoden være egnet for overvåkning av interaksjon mellom oligonukleotid og lav-molekylvekt-forbindelser, såsom interaksjonen av antibiotika og ribosomalt RNA 45 på grunn av den lave temperatur separasjon. I slike tilfeller, oligonukleotider og lav-molekylvekt-forbindelser skal bli detektert samtidig, noe som er en fordel med å bruke LC / ESI-MS.
Det er en begrensning at den instrumentering er ikke egnet for å utføre parallell analyse som i konvensjonelle teknikker som Sanger-sekvensering og real-time PCR. I tillegg identifiserer den foreliggende fremgangsmåte bare basesammensetning og enhver base substitusjon innenfor det samme molekyl kan ikke skilles fra hverandre. Imidlertid kan MS-baserte DNA-analyse er beskrevet her fortsatt har fortrinn på sikts av nøyaktighet i sammenligning med DNA-bindende fargestoffbaserte teknikker som gelelektroforese og real-time PCR.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research by the Japanese Society for the Promotion of Science (15K08060).
DNeasy Blood & Tissue Kit (50) | Qiagen | 69504 | DNA extraction kit |
Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
Ethanol (99.5+ vol%) | Wako | 054-07225 | For dilution of wash buffers |
TE buffer (pH 8.0) | Wako | 310-90023 | For dilution of DNA sample |
PCR primer | Fasmac | NA | Purified with reverse-phase cartridge column by the supplier |
Template DNA | Eurofins Genomics | NA | Purified by HPLC by the supplier |
Ultrapurified water | NA | NA | Generated with a Milli-Q Direct water purification system (Merck Millipore), used for sample preparation |
Detergent Free 5X Phusion HF Buffer | Thermo Fisher | F-520L | Use instead of the provided buffer of DNA polymerase |
Pfu-X DNA polymerase | Jena Bioscience | PCR-207S | |
dNTP mix (20 mM each) | Jena Bioscience | NA | Supplied with the DNA polymerase |
10× Universal buffer M | Takara Bio | NA | Containing 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol and 500 mM NaCl |
Dra I | Thermo Fisher | FD0224 | Restriction enzyme |
Msp I | Thermo Fisher | FD0544 | Restriction enzyme |
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Fluka | 42060-50ML | Eluent additive for LC-MS grade. |
Triethylamine (TEA) | Fluka | 65897-50ML | Eluent additive for LC-MS grade. |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | For preparation of calibrant. |
Sodium hydroxide (1.0 M) | Fluka | 72082 | Dilute to 10 mM with ultrapurified water and use for titration of trifluoroacetic acid. |
Acetonitrile | Fluka | 34967 | For preparation of calibrant, LC/MS grade. |
Methanol | Kanto | 25185-76 | For mobile phase, LC/MS grade. |
Water | Thermo Fisher | W6-1 | For mobile phase, LC/MS grade. |
Microcentrifuge tube (0.5 ml) | Eppendorf | 0030123301 | PCR clean grade |
Microcentrifuge tube (1.5 ml) | Eppendorf | 0030123328 | PCR clean grade |
UVette | Eppendorf | 0030106300 | Disposable UV cuvette. |
Gel Green | Biotium | 41004 | Fluorescent DNA stain |
Cosmospin filter G (0.2 μm) | Nakalai Tesque | 06549-44 | Made of hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane. Any centrifugal filter unit (pore size, 0.2–0.5 μm) made of hydrophilic PTFE or another low-binding membrane is applicable. |
300-μl PP screw vial | American Chromatography Supplies | V0309P-1232 | |
Preassembled screw cap and septa | Finneran | 5395-09R | |
Monobis C18 analytical column (2.0×50 mm, mesopore size = 30 nm) | Kyoto Monotech | 2050H30ODS | Outside Japan, available for purchase from GL Sciences via its distributors. (http://www.glsciences.com/distributors/) |
Monobis C18 guard column | Kyoto Monotech | GCSET-ODS3210 | Holder included. |
Cadenza CW-C18 (3.0×250 mm) | Imtakt | CW036 | C18-bonded particulate silica column |
ProSwift RP-4H (1.0×250 mm) | Thermo Fisher | 066640 | Poly(styrene-divinylbenzene) monolith column |
Themo Mixer C | Eppendorf | 5382 000.023 | For digestion of fish tissues. |
Spectrophotometer | Shimadzu | UV-3150 | Quantification of DNA concentration. |
Thermal cycler | Bio-Rad | T100 | |
Portable refrigerator | Twinbird | D-CUBE | For aqueous mobile phase to avoid evaporation of HFIP. This can be replaced by an ice box. |
Ultimate 3000 liquid chromatograph | Thermo Fisher | NA | |
Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher | NA | Fourier transform mass spectrometer equipped with the modified Kingdon trap analyzer. |
Protein deconvolution 3.0 | Thermo Fisher | NA | Use version 3.0 or higher having an isotopic patter model of nucleotide. |