En förbättrad polymeraskedjereaktion-restriction fragment length polymorphism metod för genotypning Pufferfish arter genom vätskekromatografi / masspektrometri beskrivs. En omvänd-fas-kiseldioxid monolit kolonn användes för separering av digere amplikoner. Denna metod kan belysa de monoisotopisk massorna av oligonukleotider, vilket är användbart för identifiering av baskompositionen.
En förbättrad version av en polymeraskedjereaktion (PCR) -restriction fragment length polymorphism (RFLP) -metoden för genotypning toxiska Pufferfish arter genom vätskekromatografi / elektrosprayjonisering masspektrometri (LC / ESI-MS) beskrivs. DNA-extraktion utförs med användning av en kiselmembranbaserad DNA-extraktion kit. Efter PCR-amplifiering med användning av en detergent-free PCR-buffert, är restriktionsenzymer sattes till lösningen utan att rena reaktionslösningen. En omvänd-fas-kiseldioxid monolit-kolonn och en Fourier-trans högupplösande mass-spektrometer med en modifierad Kingdon fälla analysator användes för separation och detektion, respektive. Den mobila fasen, som består av 400 mM 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol, 15 mM trietylamin (pH 7,9) och metanol, avges vid en flödeshastighet av 0,4 ml / min. Cykeltiden för LC / ESI-MS-analys är 8 min inklusive ekvilibrering av kolonnen. Avfaltning programvara med en isotop distributionsmodell of oligonukleotiden används för att beräkna motsvarande monoisotopisk massa från masspektrum. För analys av oligonukleotider (intervall 26-79 nukleotider), mass noggrannhet var 0,62 ± 0,74 ppm (n = 280) och utmärkt noggrannhet och precision upprätthölls under 180 timmar utan användning av ett lås massa standard.
Masspektrometri (MS) är en accepterad teknik för snabb och tillförlitlig identifiering av nukleinsyror, matris assisterad laserdesorption / jonisering (MALDI) och elektro (ESI) som används för jonisering 1,2. MALDI tekniken kombineras typiskt med en time-of-flight (TOF) Analyzer, emellertid tillämpningen av MALDI-TOF MS begränsas till korta oligonukleotider (~ 25 nukleotider (nt)) på grund av den efterföljande fragmentering, adduktbildning och låg joniseringseffektivitet 1,2. Däremot är ESI tillämplig till längre oligonukleotider (> 100 nt), men många laddningstillstånd av multipla laddade joner ([M-nH] n-) produceras samtidigt från biomakromolekyler och därmed massan av analyten kan överstiga den övre gränsen för m / z området för spektrometer. Detta kräver tolkning av invecklad spektra, dvs omvandling av en laddningstillstånd serie till motsvarande massavia avfaltning.
I fallet med massmätning av en liten molekyl, toppen av den monoisotopiska massan, dvs, är massan av den molekyl som innehåller endast den vanligaste isotopen av varje element den mest förekommande och observeras naturligt 3. När molekylvikten ökar, blir de isotopfördelnings skiftar till högre m / z och monoisotopisk topp skyms av baslinjen buller 3-5. När monoisotopisk topp är inte längre detekterbar för massorna större än 10 kDa 3, är den genomsnittliga molekylvikt som används för mätning i stället för monoisotopisk massa 5. I sådana fall, endast kan observeras isotopfördelning, i vilken var och en av de individuella topparna är åtskilda av en Da när en högupplösande mass-analysator såsom en TOF, en Fourier-transform modifierad Kingdon fälla analysator 6, eller en Fourier-trans ion cyklotron resonans analysator används för analys. Emellertid är den mest förekommande toppen sometimes inte överensstämmer med den genomsnittliga molekylvikt 5. Dessa problem kan leda till svårigheter för noggrann bestämning analyter.
Med tanke på variationen i naturliga överflöd av stabila isotoper och svårigheterna i bestämmer medelmolekylvikt, är mätning av monoisotopisk massa idealisk för mass karaktärisering av biomolekyler 3,4. I praktiken, om en monoisotopiska topp kan observeras eller ej, av enkla isotoper massan kan uppskattas genom att jämföra mönstret för den observerade isotop distribution till den teoretiska beräknas utifrån en modell analyt 4,7-10. Beslaget algoritm 8 nu införlivas proprietär programvara.
Inom ramen för ESI-MS, är dissociation av en DNA-duplex, rening och avsaltning krävs för direkt mätning för att undvika fel på jonisering på grund av jon-undertryckning och adduktbildning 2,10-14. Dessa förfaranden är troublesome dock helautomatiserade analyssystem har utvecklats kommersiellt innebär polymerase chain reaction (PCR), provberedning och ESI-MS för detektion av patogener 15-20. Ett annat tillvägagångssätt är att införa vätskekromatografi (LC) för separation. LC ger en on-line separation av analyter från samexisterande substanser och kräver inte en mödosam provberedning före jonisering 21,22. Emellertid är svårare än för de flesta andra föreningar såsom läkemedel, peptider och proteiner på grund av den polyanjoniska naturen av nukleotiderna separation av nukleinsyror med användning av en MS-kompatibel mobil fas. De mest lyckade exempel på LC / ESI-MS involverar användningen av jonpar-omvänd-fas-LC. En mobil fas av 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol (HFIP) -triethylamine (TEA) -metanol ursprungligen föreslagits av Apffel et al. För att separera och detektera korta oligonukleotider 23. Tillämpning av LC / ESI-MS genotypning för differentiation patogen art, single-nucleotide polymorphisms och korta tandemupprepningar har rapporterats med hjälp av en kapillär polymer monolit kolumn som kan separera längre oligonukleotider 1,21,24-33.
I Japan och USA, har allvarliga matförgiftning inträffat på grund av felidentifiering och olämplig framställning av blåsfisk, och detta trots att distribution och framställning av blåsfisk är strikt kontrollerat av lagstiftning livsmedelssäkerhet 34,35. Dessutom gjorde ett avsiktligt mord med hjälp av blåsfisk extrakt förekommer i Japan 36. Därför är differentiering av Pufferfish arter krävs från både folkhälsan och rättsutredningsställningstaganden. Dessutom, eftersom Takifugu rubripes är mycket dyrare än andra typer av blåsfisk, behövs också en differentiering kapacitet i samband med utredningar mat bedrägeri.
Här, en detaljerad metod för att bestämma monoisotopic massa av en PCR-produkt med LC / ESI-MS med användning av en omvänd-fas-kiseldioxid monolit-kolonn och en hög upplösning masspektrometer beskrivs. Specifikt har den metod utvecklats för att tillåta differentiering av giftiga Pufferfish arter baserade på användning av PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) metoden 37, som är det första exemplet för arter differentiering av djur med hjälp av MS.
För att extrahera DNA, är ett kommersiellt kit för att utvinna DNA från blod och vävnader som används i enlighet med protokollet av tillverkaren mindre modifiering (mängd proteinas K och centrifugering av lys lösning). Emellertid kan vilken som helst extraktion kit användas så länge som cellulärt DNA kan extraheras med tillfredsställande återhämtning och renhet för PCR. Denna metod har testats med muskler, fena, lever, äggstockar och hud 37. Fin är särskilt lämplig på grund av den stora ytan, vilket möjliggör snabb lys med proteinas K. färska, frysta, torkade, kokt och bakade Pufferfish prover testades framgångsrikt 37.
PCR-primer set (tabell 1) är avsedd för blåsfisk och förstärker mitokondriella 16S ribosomala RNA-genen av blåsfisk. Mål-DNA för att amplifiera är 114-115 bp (släktet Takifugu) och 86 bp (släktet Lagocephalus) (tabell 5). För att underlätta metoden development, syntetiserades oligonukleotider med målsekvenserna användas för referens istället för att samla autentiska Pufferfish prover. Primer set kan ersättas av en annan primer in som svar på syftet bör dock slutliga DNA längd efter enzymatisk spjälkning vara mindre än 100 nt när det gäller att upprätthålla kvaliteten på masspektrum krävs för en lyckad avfaltning. Dessutom bör kvävetryck i den C-fällan minskas när målet oligonukleotiden är längre än ca 75 nt och kvaliteten på masspektrumet är otillräcklig för framgångsrik avfaltning. Sådana begränsningar kan styras genom den senaste utvecklingen i instrumentets programvara, annars ventilen för C-fällan inuti chassit måste vara inställda som beskrivs i protokollet avsnitt. När det gäller provberedning, är avgörande för den efterföljande LC när det gäller lämplig toppform, tillräcklig toppintensiteten och stabil uppehållstid 31 användning av tvättmedelsfria reagens.
<p class = "jove_content"> A PS-DVB kapillär monolit kolonn 21,24-33, en C 18 omvänd fas partikelformig silikakolonn 23,40,41 och en hydrofob interaktionskromatografi (HILIC) kolumn 42 har använts för LC / ESI-MS-analys av oligonukleotider. Bland dem är den kapillära monolit kolumnen överlägsen de andra när det gäller separationskapacitet, var dock kapillär monolit kolonn som användes i tidigare studier görs internt och arbetar vid en låg flödeshastighet (2 ul / min), vilket kräver instrumentering tillägnad mikro LC. För att underlätta enkel användning, var kommersiellt tillgängliga kolonner utvärderas för separationen av långa oligonukleotider vid högre flödeshastigheter (100 till 400 | j, l / min). Tre par av DNA-duplex (26, 37 och 53 bp) separerades med användning av de ovan nämnda kolonner är emellertid de cykeltider av C 18 -bunden partikelformig kiseldioxid-kolonn och PS-DVB monolit kolonn var 65 och 70 min, respektive , medan den hos den C <sub> 18 -bunden kiseldioxid monolit kolonnen var åtta minuter (Figur 1). Ta en snabb analys i beaktande, var C18 -bunden kiseldioxid monolit kolonn valt för våra ändamål trots den begränsade kapaciteten separation; men de återstående två kolumner kan användas när det krävs förbättrad separation. Teoretiskt i fallet med en monolit-kolonn, finns det ingen interstitiell volym och den mobila fasen skulle tvingas att strömma genom porerna i den fasta fasen och samtidigt upprätthålla en konsekvent banlängd, vilket möjliggör en effektiv separation 27. Sådana processer skulle bli manifesterad, i synnerhet vid analys av biomakromolekyler såsom en oligonukleotid, såsom den långsamma diffusionen av stora molekyler. Ett av de praktiska fördelarna med en monolit kolonn är att mottrycket är lägre än det för en partikelformig silikakolonn 27. Trots den höga flödeshastigheten (400 | j, l / min) och låg kolonntemperatur (20 ° C), maximalt baktryck avSystemet var 12,5 MPa 37. Detta är den första demonstrationen av fördelen med en C 18 -bunden kiseldioxid monolit kolumnen för snabb analys av en lång oligonukleotid. Grund av den höga flödeshastigheten, är en särskilt instrument för mikro-LC och exakt inriktning vid gränsytan inte nödvändig. I stället är en uppvärmd ESI sond som krävs för att dissociera DNA duplex och hjälpa jonisering av DNA som beskrivs senare.Jonpar-kromatografi är vanligen används för MS-kompatibel separation av oligonukleotider. Men en jon-par reagens stör i allmänhet med ESI processen och minskar känsligheten hos ESI-MS. Därför är HFIP ofta används för den mobila fasen för att förbättra känsligheten av oligonukleotiden. Emellertid HFIP (kokpunkt 59 ° C) förångas snabbt vid gränssnittet innan metanol (kokpunkt 65 ° C) och, därför, denna förlust av lösningsmedel ökar pH och främjar dissociation av jonpar-reagens (dvs, TEA)från oligonukleotiden. Eftersom den nuvarande metoden utnyttjar en uppvärmd ESI sond, som nebulizes eluatet med varm kvävgas vid 350 ° C, kan denna effekt vara över betonas. I stället för HFIP-TEA-buffert, Erb och Oberacher rekommenderade cyclohexyldimethylammonium acetat (CycHDMAA, pH 8,4) för genotypning analys på grund av en minskning av adduktbildning med spårmetalljoner 33. Författarna drog slutsatsen att CycHDMAA självt undertryckte bildningen av metall addukten. Trots litteraturen har betydande adduktbildning inte observerats i föreliggande metod. Dessutom är anmärkningsvärd fördel med HFIP-TEA-metanol-system som den topp som erhölls med HFIP-TEA-metanol-systemet var 17 gånger större än den som erhålls från CycHDMAA-acetonitrilsystem när man analyserar en 86 bp amplikon av T. poecilonotus (data ej visade). En nackdel med HFIP-TEA-metanol-system är emellertid de ökade kostnaderna i förhållande till CycHDMAA-acetonitrilsystem.
Beräkning av enkla isotoper massa kräver separation av isotop toppar multiplicera laddade joner. Därför är upplösningen kritiskt för den föreliggande analysen. Även erforderlig upplösning makt beror på baspar längd analyt konventionella TOF analysatorer, som har en upplösning makt flera tiotusentals, kan begränsas för analys av korta oligonukleotider.
De teoretiska monoisotopisk massor som visas i Tabell 4 beräknades från motsvarande baskompositioner av analyterna. Alternativt Muddiman et al. Utvecklat ett program för att beräkna baskompositionen från den exakta massan 43. Ett liknande program integrerades i automatiserad ESI-MS-system 16-18. Användningen av dessa algoritmer kan förbättra robustheten hos föreliggande förfarande eftersom en uppmätt monoisotopisk massa inte alltid överensstämmer med en unik baskomposition ovinge till massan tolerans på 3 ppm till följd av den oundvikliga fel mätningen. Tyvärr, vi kunde inte få dessa program för den aktuella studien.
Den nuvarande monoisotopisk massbaserad bestämning art kan vara lämpliga inte bara för differentieringen av blåsfisk utan även för detektering av andra DNA-polymorfismer eftersom den nuvarande metoden bygger på att analysera baskompositionen och inte innebär ett förfarande som särskilt utformade för blåsfisk. Som för påvisande av DNA-polymorfism, är den dedikerade ESI-MS-system helt automatiserad och enkel att använda, som kan vara lämpliga för diagnostisk användning, såsom detektion av patogener 15,17,18,20,30. Omvänt är den nuvarande metoden genomförbar med gemensamma forsknings instrument och apparater och därför lämpar sig för forsknings användningsområden. ESI-MS har redan använts för humant DNA-polymorfism som single nucleotide polymorphism 13,28,32, kort tandem upprepning 26Och mitokondrie-DNA analsis 16,19. Micro RNA analyserades också genom kapillär LC / ESI-MS 44. Dessa publicerade ansökningar kan också realiseras genom föreliggande metod. Dessutom kan denna metod vara lämplig för att övervaka växelverkan mellan oligonukleotid och låg molekylvikt föreningar, såsom interaktionen av antibiotika och ribosomalt RNA 45 på grund av separationen vid låg temperatur. I sådana fall, oligonukleotider och låg molekylvikt föreningar bör detekteras samtidigt, vilket är en fördel med att använda LC / ESI-MS.
Det finns en begränsning som instrumente inte är lämpligt för att utföra parallell analys som i konventionella tekniker såsom Sanger-sekvensering och realtids-PCR. Dessutom identifierar den föreliggande metoden bara baskomposition och varje bas substitution inom samma molekyl kan inte särskiljas. Emellertid kan MS-baserad DNA-analys som beskrivs här fortfarande har meriter i termins av noggrannhet i jämförelse med den DNA-bindande färgämnesbaserade tekniker såsom gelelektrofores och realtids-PCR.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research by the Japanese Society for the Promotion of Science (15K08060).
DNeasy Blood & Tissue Kit (50) | Qiagen | 69504 | DNA extraction kit |
Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
Ethanol (99.5+ vol%) | Wako | 054-07225 | For dilution of wash buffers |
TE buffer (pH 8.0) | Wako | 310-90023 | For dilution of DNA sample |
PCR primer | Fasmac | NA | Purified with reverse-phase cartridge column by the supplier |
Template DNA | Eurofins Genomics | NA | Purified by HPLC by the supplier |
Ultrapurified water | NA | NA | Generated with a Milli-Q Direct water purification system (Merck Millipore), used for sample preparation |
Detergent Free 5X Phusion HF Buffer | Thermo Fisher | F-520L | Use instead of the provided buffer of DNA polymerase |
Pfu-X DNA polymerase | Jena Bioscience | PCR-207S | |
dNTP mix (20 mM each) | Jena Bioscience | NA | Supplied with the DNA polymerase |
10× Universal buffer M | Takara Bio | NA | Containing 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol and 500 mM NaCl |
Dra I | Thermo Fisher | FD0224 | Restriction enzyme |
Msp I | Thermo Fisher | FD0544 | Restriction enzyme |
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Fluka | 42060-50ML | Eluent additive for LC-MS grade. |
Triethylamine (TEA) | Fluka | 65897-50ML | Eluent additive for LC-MS grade. |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | For preparation of calibrant. |
Sodium hydroxide (1.0 M) | Fluka | 72082 | Dilute to 10 mM with ultrapurified water and use for titration of trifluoroacetic acid. |
Acetonitrile | Fluka | 34967 | For preparation of calibrant, LC/MS grade. |
Methanol | Kanto | 25185-76 | For mobile phase, LC/MS grade. |
Water | Thermo Fisher | W6-1 | For mobile phase, LC/MS grade. |
Microcentrifuge tube (0.5 ml) | Eppendorf | 0030123301 | PCR clean grade |
Microcentrifuge tube (1.5 ml) | Eppendorf | 0030123328 | PCR clean grade |
UVette | Eppendorf | 0030106300 | Disposable UV cuvette. |
Gel Green | Biotium | 41004 | Fluorescent DNA stain |
Cosmospin filter G (0.2 μm) | Nakalai Tesque | 06549-44 | Made of hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane. Any centrifugal filter unit (pore size, 0.2–0.5 μm) made of hydrophilic PTFE or another low-binding membrane is applicable. |
300-μl PP screw vial | American Chromatography Supplies | V0309P-1232 | |
Preassembled screw cap and septa | Finneran | 5395-09R | |
Monobis C18 analytical column (2.0×50 mm, mesopore size = 30 nm) | Kyoto Monotech | 2050H30ODS | Outside Japan, available for purchase from GL Sciences via its distributors. (http://www.glsciences.com/distributors/) |
Monobis C18 guard column | Kyoto Monotech | GCSET-ODS3210 | Holder included. |
Cadenza CW-C18 (3.0×250 mm) | Imtakt | CW036 | C18-bonded particulate silica column |
ProSwift RP-4H (1.0×250 mm) | Thermo Fisher | 066640 | Poly(styrene-divinylbenzene) monolith column |
Themo Mixer C | Eppendorf | 5382 000.023 | For digestion of fish tissues. |
Spectrophotometer | Shimadzu | UV-3150 | Quantification of DNA concentration. |
Thermal cycler | Bio-Rad | T100 | |
Portable refrigerator | Twinbird | D-CUBE | For aqueous mobile phase to avoid evaporation of HFIP. This can be replaced by an ice box. |
Ultimate 3000 liquid chromatograph | Thermo Fisher | NA | |
Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher | NA | Fourier transform mass spectrometer equipped with the modified Kingdon trap analyzer. |
Protein deconvolution 3.0 | Thermo Fisher | NA | Use version 3.0 or higher having an isotopic patter model of nucleotide. |