Introduction
Animais usar chemosensation distinguir condições vantajosas para além de condições desvantajosas. Esta percepção pode ser crítico para coisas como determinar a melhor fonte de alimento, evitando substâncias tóxicas ou determinar o melhor parceiro de acasalamento 1. Chemosensation é frequentemente dividida em dois componentes sensoriais: olfato e sentidos gustativos. A principal característica distintiva desses sentidos é que o olfato (cheiro) é usado para provar o ambiente químico gasoso circundante, enquanto gustação (gosto) requer contato físico com um substrato não-volátil. Ambas as modalidades sensoriais estimular respostas neurológicas que são tratados e descodificados no cérebro para produzir o comportamento atração ou repulsão adequada 2. Estes sentidos são, portanto, fundamental para a sobrevivência animal.
A mosca da fruta Drosophila melanogaster é um organismo modelo que continua a crescer em popularidade para o uso em compreendering como insetos perceber cheiro e sabor. As moscas de fruta oferecem enormes vantagens sobre outros sistemas modelo devido à riqueza de ferramentas genéticas disponíveis para a dissecção das vias moleculares, celulares e comportamentais. Trabalho ao longo dos últimos 15 anos tem sido particularmente instrumental na caracterização das identidades celulares específicos, receptores neuronais e mecanismos envolvidos, tanto cheiro e sabor sinalização. Agora, o poder da genética de Drosophila está sendo usado para elucidar como esses processos são codificados no neurônio único e circuito único nível 3-6. Assim, ensaios que fornecem assim marcou leituras de alterações de vias sensoriais são vitais para o avanço contínuo destes campos.
Embora uma grande parte se sabe sobre como os sinais olfativos são codificados e processados no cérebro, e muito menos se sabe sobre mecanismos semelhantes na via gustativa. Descrevemos aqui um protocolo que pode ser usado para determinar preferen gustativasce em Drosophila. Drosophila, como mamíferos, geralmente preferem compostos sabor doce ao invés de compostos sabor amargo. Qualquer combinação destas fontes de alimentos podem ser utilizados na presente concepção experimental para determinar como alterações genéticas conhecidas afectar a escolha gosto. Além disso, as estratégias de intervenção farmacológica semelhante pode ser avaliada pelos seus efeitos sobre a preferência de paladar dos animais. A facilidade e flexibilidade deste ensaio torna um paradigma útil para a compreensão da natureza da percepção gustativa em Drosophila.
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Protocol
1. A fome
- Prepare mosca frascos de fome saturando uma bola de algodão com 18,2 mohms de água no fundo de um frasco de mosca padrão. Alternativamente, semelhante saturar uma pequena tira de papel de filtro com 18,2 mohms água e coloque em um ângulo dentro do frasco.
- Recolha moscas em conjuntos de ~ 100 animais em uma almofada de CO 2 e em seguida, adicione as moscas para um frasco preparado.
Nota: Os melhores resultados são obtidos com os animais que são menos do que 5 dias de idade. No entanto, a idade exacta dos animais pode ser controlada como uma variável de experimental para determinar mudanças na preferência do gosto ao longo do tempo. - Use uma rolha bola de algodão ou espuma para proteger os frascos fechados. Coloque os frascos em seu lado em uma incubadora de ambiente controlado. Manter a temperatura a 25 ° C, e a humidade superior a 70%. Deixar frascos intocadas durante 24 h.
2. Taste Ensaio Preferências
- Preparar todas as saborizantes para o ensaio no mesmo dia ums testes.
Nota: Os tastants exatos a serem usados irão variar dependendo da pergunta experimental ser perguntado. Os seguintes são exemplos de saborizantes utilizados neste protocolo. Ver secção 4 para otimizações.- Prepare o controle saborizante (sacarose 1 mM) através da combinação de 10 ml de solução de sacarose 100 mM, 13 ul de corante vermelho, e 977 ul de 18,2 mohms água.
- Prepare saborizante experimental (sacarose a 5 mM) ao combinar 50 ul de solução de sacarose 100 mM, 10 ul de corante azul de alimentos, e 940 ul de água 18,2 mohms.
- Adicione câmaras de ensaio com 100 mm x 15 milímetros prato de petri de plástico padrão preparado da seguinte forma:
- Coloque três gotas de 10 ul de saborizante de controle mais próximo da borda da placa às 12 horas e mais 3 gotas às 6 horas. Assegure-se que o espaçamento entre as quedas é semelhante.
- Coloque três gotas de 10 ul de saborizante experimental mais próximo do bordo da placa de 03:00 e umoutros 3 gotas às 9 horas. Assegure-se que o espaçamento entre as quedas é semelhante.
- Repita os passos 2.2.1 e 2.2.2 para tantas repetições como desejado.
- Vazio 1 frasco de ~ 100 moscas famintas em uma almofada de CO 2 apenas o tempo suficiente para anestesiar todos os animais (aproximadamente 10 segundos). Escovar os animais no meio de uma câmara de ensaio preparada e cobrir com a tampa prato.
Nota: longos períodos de exposição ao CO 2 deve ser evitada para melhorar o tempo de recuperação e interferência limite com o comportamento alimentar. A exposição ao gelo (~ 5 min) pode ser usado para anestesiar para evitar CO 2 efeitos comportamentais que podem surgir de uma exposição limitada. - Coloque a câmara de ensaio em uma caixa de papelão opaco. Certifique-se de rotular o exterior da caixa com a condição e genótipo que está sendo testado.
- Coloque a configuração inteira (câmara de ensaio contido dentro da caixa de cartão a partir do passo 2.4) em uma incubadora a 25 ° C com, pelo menos, 70% de humidade durante 2 h. Repita os passos 2.3 através de 2.5 para todas as repetições.
- Após 2 horas, colocar as câmaras de ensaio, ainda contidos dentro de caixas de cartão, directamente num congelador a -20 ° C até estar pronto para a quantificação.
3. Taste Quantificação Preferência Assay
- Permitir que uma única câmara de ensaio a aquecer até à temperatura ambiente (aproximadamente 5 min).
- Sob um microscópio de dissecação, usando um pincel ou um par de fórceps, animais do grupo com base na cor de seu abdômen: vermelho, azul, roxo ou clara (Figura 1).
- Grave o número de animais de cada grupo. Considere animais claras para não participaram no ensaio e, portanto, não incluí-los em todos os cálculos.
- Calcular o índice de preferência de acordo com uma das equações seguintes:
- Se o saborizante experimental de interesse é adicionado ao corante vermelho, em seguida, usar (N vermelho + 0,5 N roxo) / (N vermelho + N azul + N purple).
- Se o saborizante experimental é adicionado ao corante azul, em seguida, ajuste a equação (N azul + 0,5 N roxo) / (N azul + N vermelho + N roxo).
- Repita os cálculos para todas as condições experimentais e repetições.
4. Optimization of Taste Preferências Assay
- Empiricamente determinar a concentração de indicadores de coloração de alimentos para ser usado de modo corante alimentar não afecta o resultado do ensaio de gosto, como se segue:
- Prepare saborizantes 4 utilizando o mesmo composto de base (por exemplo, sacarose a 5 mM), conforme indicado na etapa 2.1, mas omitindo o corante alimentar.
- Adicionar 1,3% corante vermelho para um dos saborizantes. Adicione os restantes 3 saborizantes com corante alimentar azul de várias concentrações em cada um dos tubos (por exemplo, 0,6%, 1% e 1,3%).
- protocolo completo as etapas de 2.2 a 3.4 para cada par saborizante: 1,3% vs. 0,6% vermelho azul; 1,3% vs. vermelho 1% de azul e1,3% vs. 1,3% vermelho azul.
- Repita o passo 4.1.1-4.1.3 com diferentes porcentagens de coloração de alimento azul até as médias preferência índice Um valor de 0 (Figura 2).
Nota: Como ponto de partida, de 1,3% corante vermelho juntamente com 1% de azul corante alimentar normalmente produz bons resultados. Se há concentração satisfatória de coloração de alimento azul pode ser correspondido a 1,3% de corante, então passo 4.1.1 através 4.1.3 pode ser repetido com concentrações variadas de coloração vermelha e uma concentração constante de coloração de alimento azul. - Analisar todas as condições a serem testadas com as mesmas concentrações de corante alimentar otimizados.
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Representative Results
Alguns resultados típicos de ensaios de preferência do gosto são mostrados abaixo. Na maioria das experiências alguma variação na intensidade de coloração abdominal será visto (Figura 1). Qualquer coloração no abdómen se intensa ou fraca é considerada uma ingestão positivo. Portanto, é aconselhável para os investigadores para marcar animais, enquanto cegos à condição experimental, de modo a limitar os potenciais vieses.
Também é importante escolher as concentrações de corantes alimentares que não afectam o resultado do ensaio de preferências. Um exemplo das consequências da utilização de várias concentrações de coloração de alimentos é mostrada na Figura 2 Neste exemplo, a quantidade de corante alimentar vermelho foi mantida a 1,3%, enquanto a quantidade de corante azul de comida foi variada:. 0,6%, 1%, e 1,3 %. Cada corante foi adicionado a 5 mM de sacarose para assegurar uma percentagem elevada de participantes no ensaio. O prefere gostoNCE ensaio foi, então, realizada em 3 repetições de cada condição e o índice de preferência calculada de acordo com a equação em 3.4.1. Um por cento do corante azul acoplado com 1,3% de corante vermelho foi encontrado para ser óptima para estas experiências tal como demonstrado pela incapacidade dos animais para escolher sacarose presente em uma cor sobre a outra (de preferência o valor do índice próximo de 0,5). Quando apenas 0,6% de corante azul foi emparelhado com 1,3% de corante vermelho, animais escolheu claramente a (valor de preferência para um índice de perto) de corante vermelho amostras de sacarose, mesmo que a concentração de sacarose foi idêntica para ambas as cores. Usando a mesma quantidade de corante alimentar resultou em uma leve, embora estatisticamente significativa, a preferência para amostras de sacarose contendo corante azul (valor de preferência índice <0,5). Os valores óptimos identificados aqui foram encontrados para se obter resultados consistentes numa gama de 10 vezes nas concentrações de sacarose na gama de 1 mM a 10 mM. No entanto, as quantidades identificadas aqui devem ser considerados valores e concentrati reais começandoons devem ser calculados empiricamente para todas as condições para ser testado antes de executar amostras experimentais.
A escolha de qual equação a ser usado para o cálculo do índice de preferência é baseada na configuração da experiência e a atracção em relação metas aversão do experimento. Como mostrado no exemplo da Figura 3, moscas demonstrou uma preferência por concentrações elevadas de sacarose versus as suas concentrações mais baixas e essa preferência pode ser revertido com a adição de ácido. A equação (N azul + 0,5 N roxo) / (N azul + N vermelho + N roxo) a partir de 3.4.2 foi utilizado para calcular o índice de preferência por 3 repetições de cada condição experimental desde o composto de interesse foi colocado no corante azul . Um índice de preferência próximo de 1 indica que, quando ofereceu a escolha entre a sacarose 1 mM (em vermelho) e sacarose 5 mM (em azul), as moscas quase sempre escolheu o maior concentr ção. Por outro lado, um segundo grupo de moscas foram dadas as mesmas opções excepto que o ácido acético a 10% foi combinada com a opção de sacarose 5 mM (em azul). Moscas quase totalmente evitado esta situação como visto com o índice de preferência próximo de 0, consistente com respostas conhecida a altas concentrações de ácido 7.
Figura 1: preferência do gosto resultados do ensaio. Alguns exemplos de variação de coloração abdominal são mostrados. Vermelho escuro ingerido (A). Luz vermelha ingerido (B). Azul escuro ingerido (C). Azul claro ingerido (D). Abdomens roxas são considerados quando toda a coloração aparece roxo (E), ou quando regiões distintas das porções abdômen mostra de vermelho (seta) e porções separadas de azul (seta) (F).//www.jove.com/files/ftp_upload/54403/54403fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Controlando para efeitos de coloração de alimentos. A adição de corante alimentar para os tastants não deve ter qualquer efeito sobre a preferência do gosto dos animais. Variando a concentração de corante azul, mantendo uma concentração constante de corante vermelho revelou uma combinação óptima de 1,3% de vermelho a 1,0% de azul. Isto é indicado por um valor de preferência índice próximo de 0,5. Os valores são a média ± desvio padrão. * p <0,05, *** p <t de Student 0,001 a partir de dois lados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. O ensaio gosto preferência utilizado para a atração e aversão Drosophila são naturalmente atraídas para altas concentrações de sacarose como visto por um valor de preferência índice próximo de 1, quando dada a escolha entre a sacarose 5 mM (em azul) e sacarose 1 mM (em vermelho) . A adição de um composto tal como o ácido aversiva para a opção de sucrose a 5 mM inverte esta escolha em alta sacarose como o índice de preferência cai para perto de 0. Os valores são a média ± o desvio padrão. *** p <0,0001 de t de Student dos dois lados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nós descrevemos um protocolo simples, mas eficaz para determinar a preferência gosto em Drosophila. Versões deste ensaio são rotineiramente usados em experimentos para determinar as contribuições dos receptores gustativos (GRS) para perceber as diferentes qualidades (amargo, doce, azedo, salgado e umami) de compostos de gosto. O genoma de Drosophila contém cerca de 60 genes que codificam receptores gustativos 68 identificados por splicing alternativo 8,9. No entanto, outras proteínas, tais como receptores de glutamato ionotrópicos e canais TRP também demonstraram desempenhar um papel no gosto 10-13. Portanto, existe uma extensa diversidade no poder discriminatório de sabor em insectos. Além disso, ao contrário dos receptores de cheiro, gosto receptores são expressos nas células localizadas em todo o mosca. Sensilas contendo combinações de neurônios que expressam receptores de sabor diferentes podem ser encontrados no labelo, pernas, asas e ovipositor 14. Como tal,Drosophila contar com a discriminação gosto por uma série de comportamentos para além de aquisição de nutrição, incluindo corte e postura de ovos.
Esta técnica de análise de sabor pode ser aplicado para tratar muitas perguntas experimentais diferentes. Por exemplo, uma vez que gosto, de corte e ovos comportamentos que colocam são considerações importantes para muitos animais, este protocolo pode ser escalável para outros insetos importantes, como carrapatos e mosquitos. Tal avanço pode revelar-se útil para a gestão dos vectores de doenças e desenvolvimento de pesticidas. Além disso, este ensaio pode ser aumentada a escala para uso em telas genéticos para a frente que foram feitas de Drosophila um instrumento de investigação poderosa para décadas. A compreensão molecular completa das vias de sabor não é conhecido. Identificar interrupções em novos genes que medeiam preferências de gosto neste ensaio poderia ajudar no preenchimento de lacunas importantes no conhecimento circuito gosto. Além disso, como a importância dos modelos pré-clínicos de doença continua a aumentar, telas farmacológicos que afetam os mecanismos de sinalização gustativas pode ser facilmente realizada por adição de compostos terapêuticos aos tastants neste protocolo. Portanto, o ensaio robusto descrito aqui é um instrumento potencialmente valiosa para muitas diferentes linhas de investigação.
Existem várias vantagens de usar este protocolo para a análise da preferência do gosto. As primeiras versões deste paradigma de alimentação utilizado apenas uma única cor para a detecção de tastants ingeridos e aplicações atuais populares fazem utilização de microplacas para entrega saborizante 15-18. A câmara de ensaio de placa de Petri usado neste protocolo é um produto pouco comum encontrada em laboratórios não está preparado para realizar ensaios gustativas. A probabilidade de ter uma câmara de ensaio já na mão, portanto, ajuda a facilitar os testes de novas hipóteses, sem tempo ou dinheiro investimento em novos equipamentos. Além disso, a combinação da utilização de corantes azuis e vermelhos é útil para garantir que todosos animais contados no experimento realmente participaram do experimento. Mesmo depois de 24 horas de fome, alguns animais saudáveis com abdomens claras após o período de alimentação pode ser visto. A eliminação desses animais do cálculo do índice de preferência é necessário para garantir uma medição exacta da população. Além disso, após inanição alguns animais invariavelmente morrem antes de serem capazes de participar no ensaio. Embora alguns animais mortos podem desidratar e pode facilmente ser removido antes da contagem, outros animais mortos, podem ser mais difíceis de identificar. A inclusão de corante em ambas as escolhas alimentares portanto, garante que apenas animais saudáveis que consumiram uma fonte de alimento são considerados para o experimento. Isto reduz significativamente a variabilidade dos resultados que podem ser vistos nas versões única cor deste ensaio. Além disso, a utilização de duas cores também permite que os animais que se alimentam de ambos os substratos a serem identificados pela coloração púrpura misto no seu abdómen. Estes animais dere importantes porque demonstram que alguns indivíduos podem ter preferências mais fracos do que todo o grupo. Deve-se notar que também têm tido sucesso usando azul e amarelo corantes alimentares para este ensaio gosto adulto onde os animais se alimentam de ambos os substratos apresentam abdomens verdes. Neste contexto, descobrimos que os abdomens amarelas são um pouco menos óbvia para marcar de abdomens vermelhos, mas, no entanto, alguns pesquisadores podem preferir esta opção. Tal como acontece com as cores usadas neste protocolo, um equilíbrio adequado de corantes alimentares deve ser determinada empiricamente para garantir os corantes não têm um efeito sobre a preferência dos animais.
Enquanto este ensaio preferência do gosto é bom em determinar como uma população de moscas responde a diferentes saborizantes, ele não fornece qualquer informação sobre respostas de animais individuais ou ingestão de alimentos real. Outros ensaios que são comumente usados para estudar gosto em sistemas Drosophila oferecem melhor resolução destes parâmetros 19 </ Sup>. Especificamente, o ensaio de extensão probóscide é muito útil para monitorar a resposta comportamental real de moscas individuais de gotas de alimentos líquidos. Da mesma forma um paradigma de alimentação capilar (CAF) oferece um meio robusto de avaliar a quantidade de compostos ingerido em moscas individuais, com a vantagem adicional de que o ensaio é capaz de ser facilmente monitorizado durante longos períodos de tempo. Outra limitação do ensaio gosto de base populacional aqui se encontra na natureza um tanto subjetiva de o placar. Tal como ilustrado na Figura 1, há sempre algum grau de variação na quantidade de alimentos consumidos e / ou excretada por cada animal. Portanto, a intensidade da cor varia abdominal. É uma boa prática para pesquisadores para marcar os animais enquanto cegos às condições da placa. Para conseguir isso, recomenda-se a evitar a escrita de identidades de saborizante sobre as placas, mas em vez rotular as caixas as placas são colocadas de modo que as placas podem ser contados como um ma imparcialNNER quanto possível. Também é prudente para confirmar os resultados, rodando o saborizante de interesse para cores alternadas em experiências separadas. Esta análise adicional deve garantir a precisão robusta dos resultados.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben) | McCormick | N/A | |
| Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers | Fisher | 03-395-455 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | BP2401-500 | |
| Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope | W. Nuhsbaum, Inc. | 10446294 | |
| Petri dish (100 mm x 15 mm) | BD Falcon | 351029 | Reuseable if thoroughly washed and dried |
| Quick-Snap Microtubes | Alkali Scientific Inc. | C3017 | |
| Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben) | McCormick | N/A | |
| Sucrose | IBI Scientific | IB37160 |
References
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