Introduction
Dyr bruke chemosensation å skille fordelaktige betingelser bortsett fra ufordelaktige forhold. Denne oppfatningen kan være kritisk for slike ting som å bestemme den beste matkilde, unngå giftige stoffer eller å bestemme den beste tilpassede partner 1. Chemosensation blir ofte delt inn i to sensoriske komponenter: olfactory sanser og smaks sanser. En hoved som særpreger disse sansene er at luktesansen (lukt) brukes til å sample det omgivende gassformet kjemisk miljø mens gustation (smak) krever fysisk kontakt med en ikke-flyktig substrat. Begge sensoriske modaliteter stimulere nevrologiske reaksjoner som er behandlet og dekodet i hjernen til å produsere den aktuelle attraktive eller frastøtende oppførsel 2. Disse sansene er derfor avgjørende for dyr å overleve.
Frukten fly Drosophila melanogaster er en modellorganisme som fortsetter å vokse i popularitet for bruk i forståelseing hvordan insekter oppfatter lukt og smak. Fruktfluer har store fordeler i forhold til andre modellsystemer på grunn av den rikdom av genetiske verktøy for disseksjon av molekylære, cellulære og atferds veier. Arbeid i løpet av de siste 15 årene har vært spesielt instrumental i å karakterisere de spesifikke cellulære identiteter, nevrale reseptorer, og signaliserte mekanismer som er involvert i både lukt og smak. Nå vil strømmen til Drosophila genetikk blir brukt til ytterligere å belyse hvordan disse prosessene blir kodet på enkelt neuron og enkelt krets nivå 3-6. Derfor analyser som gir lett scoret avlesninger av endringer i sensoriske baner er avgjørende for den videre forkant av disse feltene.
Mens mye er kjent om hvordan luktsignaler blir kodet og bearbeides i hjernen, er mye mindre forstått om tilsvarende mekanismer i smaks pathway. Vi beskriver her en protokoll som kan brukes for å fastslå smaks preference i Drosophila. Drosophila, som pattedyr, vanligvis foretrekker søte smaker forbindelser i motsetning til bitre smaker forbindelser. Enhver kombinasjon av disse kildene kan anvendes i denne eksperimentelle konstruksjon for å bestemme hvordan kjente genetiske endringer påvirke smak valg. I tillegg kan farmakologisk intervensjon strategier på lignende måte bli vurdert for deres virkninger på dyrenes smak preferanse. Den enkle og fleksibiliteten i denne analysen gjør det en nyttig paradigme for forståelsen av gustatory oppfatning i Drosophila.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sult
- Forbered fly sult ampuller ved å mette en bomullsdott med 18,2 Megohm vann ved bunnen av en standard flue ampulle. Alternativt, på samme måte mette en liten stripe av filterpapir med 18,2 Megohm vann og legg i en vinkel i hetteglasset.
- Samle fluer i sett av ~ 100 dyr på en CO 2 pad og deretter legge fluene til en forberedt hetteglass.
Merk: De beste resultater oppnås med dyr som er mindre enn 5 dager gamle. Imidlertid kan den nøyaktige alderen til dyrene styres som en eksperimentell variabel for å bestemme forandringer i smak preferanse over tid. - Bruk en bomullsdott eller skum stopper for å sikre ampullene lukket. Plasser hetteglassene på sin side på en miljømessig kontrollert kuvøse. Holde temperaturen ved 25 ° C, og den fuktighet over 70%. La ampuller urørt i 24 timer.
2. Taste Preference analysen
- Forbered alle tastants for analysen på samme dag ens testing.
Merk: De eksakte tastants som skal brukes, vil variere avhengig av eksperimentelle spørsmålet blir stilt. Det følgende er eksempel tastants anvendt i denne protokollen. Se avsnitt 4 for optimaliseringer.- Forbered kontroll tastant (1 mM sukrose) ved å kombinere 10 pl 100 mM sukrose løsning, 13 mL av rød konditorfarge, og 977 mL 18,2 Megohm vann.
- Forbered eksperimentelle tastant (5 mM sukrose) ved å kombinere 50 pl 100 mM sukrose løsning, 10 ul blå konditorfarge, og 940 mL 18,2 Megohm vann.
- Gjøre analyse kamre ved hjelp av en standard 100 mm x 15 mm petriskål av plast fremstilles på følgende måte:
- Plasser tre 10 mL dråper kontroll tastant nærmeste kanten av platen ved 12-tiden og en annen 3 dråper på 6:00. Pass på at avstanden mellom dråper er lik.
- Plasser tre 10 mL dråper eksperimentell tastant nærmeste kanten av platen på tre og enandre tre dråper på 9:00. Pass på at avstanden mellom dråper er lik.
- Gjenta trinn 2.2.1 og 2.2.2 for så mange replikater som ønsket.
- Tom en ampulle med ~ 100 sultet fluer på en CO 2 pute akkurat lenge nok til å bedøve alle dyr (ca. 10 sek). Pensle dyrene inn i midten av en forberedt analysen kammer og dekk med parabolen lokk.
Merk: Lengre perioder med CO 2 eksponering bør unngås for å øke utvinningen tid og begrense interferens med fôring atferd. Eksponering for is (~ 5 min) kan bli anvendt for bedøvelse for å unngå CO 2 atferdsmessige effekter som kan oppstå fra og med begrenset eksponering. - Plasser analysekammeret i et ugjennomsiktig pappeske. Husk å merke utsiden av esken med tilstanden og genotype blir testet.
- Plasser hele oppsettet (analysekammer som finnes på pappeske fra trinn 2.4) i en 25 ° C inkubator med minst 70% fuktighet i 2 timer. Gjenta trinn 2.3 gjennom 2.5 for alle replikater.
- Etter 2 timer plassere analyse kamre, fortsatt finnes i pappesker, direkte inn i en -20 ° C fryser til den er klar for kvantifisering.
3. Smak Preference analysen Kvantifisering
- Tillate en enkelt assay kammer for å varme opp til romtemperatur (ca. 5 min).
- Under en disseksjon mikroskop, med en børste eller pinsett, gruppe dyr basert på fargen på magen: rød, blå, lilla eller klar (figur 1).
- Registrere antall dyr i hver gruppering. Tenk klare dyrene ikke har deltatt i analysen og derfor ikke inkludere dem i noen beregninger.
- Beregn preferanse indeksen i henhold til en av de følgende ligninger:
- Hvis den eksperimentelle tastant av interesse er lagt til rødt fargestoff, og deretter bruke (N rød + 0,5N lilla) / (N rød + N blå + N lille).
- Hvis den eksperimentelle tastant legges til blått fargestoff, deretter justere ligningen til (N blå + 0,5 N lilla) / (N blå + N rød + N lilla).
- Gjenta beregningene for alle eksperimentelle forhold og paralleller.
4. Optimalisering av Taste Preference analyse
- Empirisk å bestemme konsentrasjonen av konditorfarge indikatorer som kan brukes slik konditorfarge ikke påvirker resultatet av analysen smak, som følger:
- Forbered 4 tastants bruker samme base sammensatt (f.eks 5 mM sukrose) som angitt i trinn 2.1, men utelater konditorfarge.
- Legg 1,3% rød konditorfarge til en av tastants. Gjøre de resterende 3 tastants med blå konditorfarge av varierende konsentrasjoner i hvert rør (for eksempel 0,6%, 1% og 1,3%).
- Komplett protokoll trinn 2.2 gjennom 3.4 for hver tastant par: 1,3% rød vs. 0,6% blå; 1,3% rød vs. 1% blått og1,3% rød vs. 1,3% blå.
- Gjenta trinn 4.1.1-4.1.3 med ulike prosenter av blå konditorfarge inntil de preferanse indeks gjennomsnitt en verdi fra 0 (figur 2).
Merk: Som et utgangspunkt, 1,3% rød konditorfarge kombinert med 1% blå konditorfarge gir vanligvis gode resultater. Hvis ingen tilfredsstillende konsentrasjon av blå konditorfarge kan bli matchet til 1,3% fargestoff, deretter steg 4.1.1 via 4.1.3 kan gjentas med varierende konsentrasjoner av rød farge og en konstant konsentrasjon av blå konditorfarge. - Analyser alle forhold som skal testes med de samme optimaliserte konditorfarge konsentrasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Noen typiske resultater fra smakspreferanse analyser er vist nedenfor. I de fleste forsøk en viss variasjon i intensiteten av abdominal fargestoffer vil bli sett (figur 1). Enhver farge i magen om intens eller svak regnes som en positiv inntak. Det er derfor tilrådelig for forskere å score dyr mens blinde til den eksperimentelle betingelsen for å begrense eventuelle skjevheter.
Det er også viktig å velge konsentrasjoner av matvarefargestoffer som ikke påvirker resultatet av preferanse analysen. Et eksempel på konsekvensene av å bruke forskjellige konditorfarge konsentrasjoner er vist i figur 2. I dette eksempel ble mengden av rødt mat fargestoff holdt ved 1,3% mens mengden av blått mat fargestoff ble variert:. 0,6%, 1%, og 1,3 %. Hver fargestoff ble tilsatt til 5 mM sukrose for å sikre en høy andel av deltakerne i analysen. Smaken preference analyse ble så utført på 3 replikater fra hver tilstand og preferansen indeksen beregnes i henhold til ligningen i 3.4.1. Én prosent blått fargestoff kombinert med 1,3% rødt fargestoff ble funnet å være optimal for disse eksperimentene som demonstrert ved svikt i dyr for å velge sukrose til stede i en farge over den andre (foretrukket indeksverdi nær 0,5). Når bare 0,6% blått fargestoff ble koblet med 1,3% rødt fargestoff, dyr valgte klart rødt fargestoff sukrose-prøver (preferanse indeksverdi nær til 1), selv om den sukrosekonsentrasjon var identisk for begge farger. Ved hjelp av like mengder av mat fargestoff resulterte i en liten, men statistisk signifikant, preferanse for sukrose prøver inneholdende blå fargestoff (preferanse indeksverdi <0,5). De optimale verdier som er identifisert her ble funnet å gi konsistente resultater over et 10 gangers spekter av sukrose konsentrasjoner som varierer fra 1 mM til 10 mM. Likevel bør de mengder som er identifisert her anses startverdier og faktiske concentrations bør beregnes empirisk for alle tilstander som skal testes før innkjøring eksperimentelle prøver.
Valget av hvilke ligningen skal brukes for beregning av preferanse indeksen er basert på oppsettet av forsøket og tiltrekningen mot aversjon målene for forsøket. Som vist i eksempelet i figur 3, fluer vist en preferanse for høye konsentrasjoner av sukrose versus lavere konsentrasjoner, og denne innstillingen kan bli reversert ved tilsetning av syre. Ligningen (N blå + 0,5 N lilla) / (N + N blå rød + N purpur) fra 3.4.2 ble brukt til å beregne preferanse indeksen for 3 replikater av hver eksperimentell tilstand ettersom forbindelsen av interesse ble plassert i det blå fargestoff . En preferanse indeksen nær 1 indikerer at når tilbudt valget mellom en mM sukrose (i rødt) og 5 mM sukrose (i blått), fluene nesten alltid valgte høyere konsentrasjoner asjon. Motsatt, ble en andre gruppering av fluer gitt de samme muligheter, bortsett fra at 10% eddiksyre ble kombinert med 5 mM sukrose alternativ (i blått). Fluer nesten helt unngått denne situasjonen sett med preferanse indeksen nær 0, i samsvar med kjente responser til høye konsentrasjoner av syre 7.
Figur 1: Taste preferanseanalyseresultatene. Noen eksempler på variasjonen av abdominal farging er vist. Mørk rød inge (A). Lys rød inge (B). Mørk blå inge (C). Lyseblå inge (D). Lilla livet anses når hele fargen vises lilla (E), eller når forskjellige regioner av magen viser deler av rød (pilspiss) og separate deler av blå (pil) (F).//www.jove.com/files/ftp_upload/54403/54403fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Kontrollere for mat hårfarging effekter. Tilsetting av konditorfarge til tastants bør ikke ha noen effekt på dyrenes smak preferanse. Å variere konsentrasjonen av blått fargestoff og samtidig opprettholde en konstant konsentrasjon av rødt fargestoff viste en optimal kombinasjon av 1,3% til 1,0% rød blå. Dette vises med en preferanse indeksverdi nær 0,5. Verdier er gjennomsnitt ± standardavvik. * p <0.05, *** p <0,001 fra tosidig t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. Smaken preferanse test som benyttes for tiltrekning og aversjon Drosophila er naturlig tiltrukket høye sukrose konsentrasjoner som sett av en preferanse indeksverdi nær en når de får valget mellom 5 mM sukrose (i blått) og 1 mM sukrose (i rødt) . Tilsette en motvilje forbindelse slik som syre til 5 mM sukrose alternativ reverserer dette valg for høy sukrose som preferanse indeksen faller til nær 0. Verdiene er gjennomsnitt ± standardavvik. *** p <0,0001 fra tosidig t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet en enkel, men effektiv protokoll for å bestemme smak preferanse i Drosophila. Versjoner av denne analysen blir rutinemessig brukt i eksperimenter for å bestemme bidrag fra smaksreseptorer (GRS) til å oppfatte de ulike kvaliteter (bitter, søt, sur, salt og umami) av smaks forbindelser. Drosophila genomet inneholder ca 60 gener som koder for 68 identifiserte smaksreseptorer ved alternativ spleising 8,9. Imidlertid kan andre proteiner slik som ionotrope glutamatreseptorer og TRP kanaler har også blitt vist å spille en rolle i smak 10-13. Derfor er det omfattende mangfold i diskriminerende effekt på smak i insekter. I tillegg, i motsetning til reseptorer for lukt, smaksreseptorer er uttrykt i celler som ligger over hele fly. Sensilla inneholder kombinasjoner av nerveceller som uttrykker ulike smaksreseptorer kan bli funnet på labellum, ben, vinger og eggleggningsrør 14. Som sådan,Drosophila stole på smak diskriminering for en rekke atferd utover ernæring oppkjøp inkludert frieri og egglegging.
Denne smak analyseteknikk kan anvendes for å håndtere mange forskjellige eksperimentelle spørsmål. For eksempel, siden smak, frieri, og egg legging atferd er viktige hensyn for mange dyr, kan denne protokollen være skalerbar til andre viktige insekter som flått og mygg. En slik utvikling kan være nyttig for sykdom vektorstyring og plantevernmiddel utvikling. I tillegg kunne dette assay bli skalert opp for bruk i termin genetiske skjermer som har gjort Drosophila en så kraftig undersøkelses verktøy i flere tiår. Den komplette molekylære forståelse av smaksreaksjonsveier er ikke kjent. Identifisere forstyrrelser i nye gener som formidler smakspreferanser i denne analysen kan bidra til å fylle viktige hull i smak krets kunnskap. Videre, ettersom betydningen av prekliniske modeller for sykdom consetter å øke, kan farmakologiske skjermer som påvirker smakssignalmekanismer enkelt utføres ved å legge terapeutiske forbindelser til tastants i denne protokollen. Derfor er robust analysen beskrevet her er en potensielt verdifullt verktøy for mange forskjellige linjer av forskning.
Det er flere fordeler med å bruke denne protokollen for analyse av smak preferanse. Tidlige versjoner av denne fôring paradigmet utnyttes bare én farge for påvisning av inge tastants og populære eksisterende applikasjoner gjøre bruk av mikrotiterplater for tastant levering 15-18. Petriskål analysen kammer som brukes i denne protokollen er en noe felles produkt som finnes i laboratorier for øyeblikket ikke forberedt på å utføre smaks analyser. Sannsynligheten for å ha et assay kammer som allerede er til stede, og derfor bidrar til å lette testing av nye hypoteser uten tid eller penger investering i nytt utstyr. Dessuten er kombinasjonen av å bruke blå og røde fargestoffer som er verdifullt for å sikre at alledyr telles i eksperimentet faktisk deltok i forsøket. Selv etter 24 timer av sult, kan noen friske dyr med klare underlivet etter beiteperioden bli sett. Eliminere disse dyrene fra preferanse indeksen beregningen er nødvendig for å sikre en nøyaktig måling av befolkningen. I tillegg, etter sult noen dyr vil alltid dø før de er i stand til å delta i analysen. Mens noen døde dyr kan tørke ut og kan lett fjernes før telling, kan andre døde dyr være vanskeligere å identifisere. Inkludering av fargestoff i begge matvalg derfor sikrer at kun friske dyr som forbrukes en matkilde anses for forsøket. Dette reduserer variabiliteten av resultatene som kan sees i én farge versjoner av denne analysen. I tillegg gjør bruk av to farger også dyr som beiter på begge substratene som skal identifiseres av den blandede lilla farge i de underlivet. Disse dyrene enre viktige fordi de viser at noen individer kan ha svakere preferanser enn hele konsernet. Det bør bemerkes at vi har også hatt suksess med blå og gule mat fargestoffer for voksen smak analysen der dyr beiter på begge underlag stille grønne underlivet. I denne sammenheng har vi funnet ut at de gule underlivet er noe mindre opplagt å score enn røde underlivet, men likevel noen forskere foretrekker dette alternativet. Som med de farger som brukes i denne protokollen, en riktig balanse av matvarefargestoffer må bestemmes empirisk for å sikre at fargestoffer har en effekt på dyrenes preferanse.
Selv om dette smak preferanse analysen er god på å bestemme hvordan en populasjon av fluer reagerer på forskjellige tastants, betyr det ikke gi noen informasjon om enkeltdyre svar eller faktiske matinntak. Andre analyser som ofte brukes for å studere smak i Drosophila systemer tilbyr bedre oppløsning av disse parametrene 19 </ Sup>. Nærmere bestemt er det snabel forlengelse analysen svært nyttig for å overvåke den faktiske atferdsresponsen av enkelt fluer til dråper flytende mat. Likeledes en kapillær fôring paradigmet (CAFE) tilbyr en robust måte å vurdere mengden av inntatt forbindelser i enkelt fluer, med den ekstra fordelen at analysen er i stand til å enkelt overvåkes i løpet av lange perioder av gangen. En annen begrensning av befolkningen basert smak analysen her lyve på noe subjektive natur scoring. Som illustrert i figur 1 er det alltid en viss grad av variasjon i mengden av mat konsumert og / eller skilles ut ved hvert dyr. Derfor intensiteten av abdominal farge varierer. Det er god praksis for forskere å score dyrene mens blinde til forholdene i platen. For å oppnå dette, er det anbefalt å unngå å skrive tastant identiteter på platene, men i stedet merke boksene platene er plassert i, slik at platene kan telles i et objektiv som manner som mulig. Det er også klokt å bekrefte resultatene ved å rotere tastant av interesse for alternative farger i egne eksperimenter. Dette ytterligere analyse bør sikre robust nøyaktigheten av resultatene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben) | McCormick | N/A | |
| Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers | Fisher | 03-395-455 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | BP2401-500 | |
| Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope | W. Nuhsbaum, Inc. | 10446294 | |
| Petri dish (100 mm x 15 mm) | BD Falcon | 351029 | Reuseable if thoroughly washed and dried |
| Quick-Snap Microtubes | Alkali Scientific Inc. | C3017 | |
| Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben) | McCormick | N/A | |
| Sucrose | IBI Scientific | IB37160 |
References
- Herrero, P. Fruit fly behavior in response to chemosensory signals. Peptides. 38 (2), 228-237 (2012).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annu Rev Neurosci. 30, 505-533 (2007).
- Harris, D. T., Kallman, B. R., Mullaney, B. C., Scott, K. Representations of Taste Modality in the Drosophila Brain. Neuron. 86 (6), 1449-1460 (2015).
- Hong, E. J., Wilson, R. I. Simultaneous encoding of odors by channels with diverse sensitivity to inhibition. Neuron. 85 (3), 573-589 (2015).
- Kain, P., Dahanukar, A. Secondary taste neurons that convey sweet taste and starvation in the Drosophila brain. Neuron. 85 (4), 819-832 (2015).
- Masek, P., Worden, K., Aso, Y., Rubin, G. M., Keene, A. C. A dopamine-modulated neural circuit regulating aversive taste memory in Drosophila. Curr Biol. 25 (11), 1535-1541 (2015).
- Charlu, S., Wisotsky, Z., Medina, A., Dahanukar, A. Acid sensing by sweet and bitter taste neurons in Drosophila melanogaster. Nat Commun. 4, 2042 (2013).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R.
- Scott, K., et al. A chemosensory gene family encoding candidate gustatory and olfactory receptors in Drosophila. Cell. 104 (5), 661-673 (2001).
- Kim, S. H., et al. Drosophila TRPA1 channel mediates chemical avoidance in gustatory receptor neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8440-8445 (2010).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a clade of ionotropic receptors are candidate taste and pheromone receptors. Neuron. 83 (4), 850-865 (2014).
- Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
- Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel. Nat Neurosci. 16 (10), 1468-1476 (2013).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C.
- Rodrigues, V., Cheah, P. Y., Ray, K., Chia, W. malvolio, the Drosophila homologue of mouse NRAMP-1 (Bcg), is expressed in macrophages and in the nervous system and is required for normal taste behaviour. EMBO J. 14 (13), 3007-3020 (1995).
- Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster. Genetics. 119 (2), 399-406 (1988).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
- French, A. S., et al. Dual mechanism for bitter avoidance in Drosophila. J Neurosci. 35 (9), 3990-4004 (2015).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
