Summary
Um protocolo para reduzir as heterogeneidades espaciais dos sinais de iões em espectrometria de massa MALDI por regulação da temperatura do substrato durante o processo de secagem da amostra é demonstrada.
Protocol
NOTA: Este protocolo é desenvolvido para reduzir a heterogeneidade espacial do fragmento maltotriose e bradicinina (1-7) preparado com o método da gota seco. O protocolo consiste em três etapas principais, incluindo a preparação e pré-condicionamento, a deposição de amostra e de secagem e análise de dados de espectrometria de massa. Os procedimentos são descritos e descritos com mais detalhe a seguir:
1. Preparação e pré-condicionamento
- Limpeza da placa de amostra
- Usar luvas de borracha nitrílica e mão-lavar a placa de amostra suavemente com detergente e destilada-água deionizada (DDW).
- Lavar a placa de amostra com metanol (MeOH) e DDW.
- Insira a placa de amostra num copo de 600 ml e encher com DDW.
- Sonicar a amostra na placa de DDW durante 15 minutos num banho de ultra-sons (200 W, 40 kHz).
- Remover DDW a partir do recipiente e encher a proveta com MeOH.
- Sonicar a placa de amostra em MeOH durante 15 min no banho de ultra-sons (200 W, 40 kHz).
- Blow off as gotas de solvente na placa com azoto gasoso e manter a placa de amostra seca, antes da deposição da amostra.
- Regulação da temperatura de secagem Câmara
NOTA:. A câmara de secagem é de 35 x 20 x 45 cm3 (W x D x H) câmara de acrílico Figura 1 mostra a imagem deste sistema de secagem. A câmara é purgado com gás azoto a temperatura ambiente através de um medidor de fluxo de gás a uma velocidade de fluxo constante para manter uma condição de baixa humidade relativa controlada por um higrómetro calibrado instalado no interior da câmara de secagem. Um bloco de base de cobre na câmara de secagem equipada com uma constante circulação de água de temperatura programado é utilizado para acomodar placas de amostra de aço inoxidável. O bloco de base de cobre é capaz de regular a temperatura da placa de amostra de 5 a 25 ° C. As temperaturas do ar, do bloco da base de cobre, e a placa de amostra são monitoradas por termopares tipo K.- Abra a porta e colocar rapidamente a placa de amostra sobre o cobrebloco da base, em seguida, fechar a porta.
- ajustar manualmente o medidor de vazão de gás para definir a taxa de fluxo de azoto a 10 pés cúbicos padrão por hora (scfh).
- Monitorar a umidade relativa do ar na câmara de secagem pelo higrômetro e afinar o medidor de vazão de gás para garantir a umidade relativa do ar é sempre inferior a 25%.
- Monitorar a temperatura da placa amostra por termopares tipo K e ajustar a temperatura da água de circulação manualmente até que o prato da amostra atinge 5 ° C durante experimento ou à temperatura ambiente (25 ° C) para o controlo.
NOTA: De modo a estabilizar a placa de amostra a uma temperatura concebido, a temperatura de circulação de água é tipicamente definido de 0 a 5 ° C mais baixa do que a amostra concebido. Por exemplo, para manter a 5 ° C na placa de amostra, o ajuste da temperatura da bomba de circulação de água está compreendida no intervalo de 0 a 2 ° C; para manter a placa de amostras a 25 ° C, a regulação da temperatura da bomba de circulação de água é na gama de 23 a 25 ° C. - Assegurar que as temperaturas exigidas e a humidade relativa são atingidos (Tabela 1), antes da deposição da amostra.
NOTA: Todos os parâmetros, bem como os seus valores de ajuste para os processos de secagem com temperaturas de chapa de amostra diferentes estão apresentados na Tabela 1.
NOTA: a uma temperatura baixa placa de amostra, a condensação de água na chapa de amostra, pode ocorrer se a porta da câmara é aberta para um longo período de tempo. Se ocorrer condensação de água, fechar a porta e não depositar qualquer amostra nele até a condensação da água é seco.
- Preparação da matriz e do analito Soluções
- Preparação de soluções de matriz
- Preparar solução 0,1 M THAP com 50% de acetonitrilo (ACN): 50% solução aquosa de DDW.
- Preparação de analitos
- Prepare 10 -4 solução maltotriose M com DDW.
- Preparar 10 -5 M fragmento bradicinina (1-7) em solução a 50% de acetonitrilo(ACN): 50% solução aquosa de DDW.
- Preparação de soluções de matriz
2. A deposição da amostra e Secagem
- Pré-mistura de 0,25 ml de solução 0,1 M THAP e 0,25 ul de 10 -4 M de maltotriose ou soluções em um tubo de microcentrífuga de 10 -5 M fragmento bradicinina (1-7).
- Vortex a solução misturada por 3 s.
- Centrifugar a solução mista de 2 seg (2000 xg) para recolher a solução no fundo do tubo de centrifugação.
- Abrir a porta da câmara de secagem, cuidadosamente depositar 0,1 ul da solução na placa de amostra com uma pipeta e fechar a porta imediatamente.
- Aguarde até que a gota de amostra a secar.
. NOTA: Os tempos de secagem tipicamente observada com temperaturas de chapa de amostra diferentes estão listados na Tabela 1 para a temperatura da placa de amostra de 5 ° C, o tempo médio de secagem é de 800 a 1000 seg; para temperatura da placa de amostra de 25 ° C, o tempo médio de secagem é de 100 a 150 sec. - Após a secagem, abrir a porta da câmara de secagem.
- Ajustar a temperatura da água de circulação até à temperatura ambiente (25 ° C).
NOTA: Ignore este passo se a placa de amostra é mantida constantemente à temperatura ambiente (25 ° C) durante o processo de secagem. - Depois da amostra de temperatura da placa de voltar à temperatura ambiente (25 ° C), remover o prato da amostra a partir da câmara de secagem.
- Examinar a morfologia da amostra sob um microscópio estereoscópico de 5x e tomar imagem de campo brilhante um instantâneo.
NOTA: Se as morfologias de cristal não são como esperado, é necessário preparar uma nova amostra com o mesmo procedimento. Morfologias cristalinas típicas são apresentadas nos painéis superior da Figura 2.
NOTA: Nos casos com temperaturas de chapa de amostra baixa, tal como 5 ° C, é importante para aquecer a placa de amostra para a temperatura ambiente antes de o levar para fora da câmara de secagem. Ao depositar as amostras, não mantenha o solutio pré-misturadon na ponta da pipeta ao longo de 10 seg. NÃO usar a solução pré-misturada de novo depois de depositar as amostras. Os painéis superior da Figura 2 mostrar as imagens de campo brilhante de amostras preparadas com temperaturas de chapa de amostra diferentes.
Análise 3. Espectrometria de Massa de dados
- Dados de espectrometria de massa Aquisição
NOTA: Após a preparação, a amostra pode ser analisada utilizando espectrometria de massa de imagem. No presente estudo, as experiências de imagiologia MS são realizados utilizando um sincronizado TOF dupla polaridade construído em laboratório (DP-TOF) espectrómetro de massa de imagiologia. 15 espectrómetros de massa MALDI-TOF comercial com capacidade de imagiologia também são adequados para tais experiências. O espectrómetro de massa é operado na extração linear e modos de iões positivos com atrasos de extração otimizados. A energia cinética dos iões é de 20 kV. O tamanho do feixe de laser é de 35 um de diâmetro sobre a superfície da amostra, e o espectro de cada ponto representa a avraiva de 5 disparos de laser.- Insira a placa de amostra para o espectrómetro de massa MALDI.
- Realizar imagem análise de espectrometria de massa para a amostra preparada em passos 2.1-2.9.
- Selecione um pico de massa característica da lista de massa mostrado na janela de resultados e clique em "2D" para traçar uma imagem ion bidimensional.
NOTA: Para maltotriose misturado com THAP, os picos característicos são sodiated maltotriose, THAP protonada e sodiated THAP. Por fragmento de bradicinina (1-7) misturado com THAP, os picos característicos incluem protonado fragmento bradicinina (1-7), THAP protonado, e sodiated THAP. - Clique nos botões de ajuste na janela de pop-up para determinar os limites superior e inferior da intensidade do sinal e clique em "salvar uma imagem". Esta configuração define o contraste das imagens íon.
NOTA: Em cada conjunto individual de dados, as regiões rachados e os pontos nulos mostrando baixa luminosidade são eliminados. - Observar e comparar o íonimagem com a imagem de campo brilhante que foi tomada no passo 2.9.
NOTA: Geração de espectrometria de massa e produção de imagens de iões específicos pode ser conseguida com instrumentos comerciais. Devido à variedade de aquisição de dados e software de análise, os usuários devem seguir as instruções de software fornecidas pelo fornecedor do instrumento para obter imagens de alta qualidade.
- Análise de dados
NOTA: A heterogeneidade das amostras é analisado quantitativamente. Nesta demonstração, cada amostra é dividida em várias áreas concêntricas por software desenvolvido in-house para analisar a distribuição espacial dos íons. A análise pode também ser realizada usando software de análise de dados independente.- Clique os pontos nulos e as regiões rachados na imagem ion mostrado na janela de resultado para remover as áreas sem importância.
NOTA: Este procedimento define a área essencial imagem de iões de. - Clique em "encontrar edge" botão para encontrar a camada mais externa da imagem de ion.
- Clique em "deduzir" para salvar as informações abundância de íons da camada mais externa em um banco de dados e remover esta camada a partir da imagem de íon simultaneamente. Uma caixa de seleção que representa esta camada mais externa aparecerá na lista "de dados de saída" da janela de resultados.
- Repita os passos 3.2.2 e 3.2.3 até que o centro da imagem de iões é definido.
- Clique e selecione todas as caixas de seleção na lista de "dados de saída" e clique em "Exportar" para exportar os dados.
- Abrir os dados exportados usando o software de planilha para calcular a abundância média de iões de cada camada para obter as informações de distribuição espacial de íons.
- Clique os pontos nulos e as regiões rachados na imagem ion mostrado na janela de resultado para remover as áreas sem importância.
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Representative Results
As imagens de campo brilhante, bem como as imagens de MS fragmento maltotriose e bradicinina (1-7) preparado, com a temperatura da placa de amostra de 5 e 25 ° C são apresentados na Figura 1. No caso de maltotriose sodiated, o sinal de iões principalmente povoa na periferia da área de amostra quando é preparado com uma temperatura de placa de amostra de 25 ° C. Diminuindo a temperatura da placa de amostra a 5 ° C, o sinal preenche de forma homogénea sobre toda a área da amostra. A única desvantagem perceptível quando se preparando amostras com menos de 5 ° C é que há mais rachaduras do que as amostras preparadas com menos de 25 ° C. A imagem de iões de fragmento de bradicinina protonada (1-7) mostra uma tendência semelhante como os de maltotriose sodiated. Os resultados de imagiologia MS sugerem que o preparo de amostras sob uma temperatura mais baixa placa de amostra pode redistribuir significativamente as moléculas e reduzir a heterogeneidade.
a Figura 3 mostra os resultados das análises estatísticas para o fragmento de maltotriose e bradicinina (1-7) preparado sob temperaturas placa de amostra de 5 e 25 ° C. Para cada amostra, a intensidade média é normalizada. No caso de maltotriose sodiated com uma temperatura de placa de amostra de 25 ° C, as intensidades de sinal nos centros são muito mais baixos do que aqueles com a temperatura da placa de amostra de 5 ° C. O resultado do fragmento bradicinina protonada (1-7), também apresenta menor variação quando diminuir a temperatura da placa de amostra de 25 para 5 ° C.
Figura 1: Imagem do sistema de amostragem de secagem.A câmara de secagem é feito de acrílico. A câmara é purgado com azoto gasoso à temperatura ambiente para manter uma condição de baixa umidade relativa. Um bloco de base de cobre equipado com uma constante circulação de água de temperatura programado é utilizado para regular a temperatura das placas de amostra de aço inoxidável. Os termômetros monitorar o ar, bloco base de cobre, ea placa de amostra. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A redução da amostra. Temperatura da placa resulta em uma melhor homogeneidade de sinal As imagens de campo brilhante (imagens superiores), bem como as imagens (imagens inferiores MALDI) de maltotriose (a) e bradicinina fragmento (1-7) (b) preparado com THAP sob temperaturas placa de amostras diferentes. o MALDI as imagens foram obtidas por extracção a maltotriose sodiated (m / z: 527) e fragmento de bradicinina protonada (1-7) (m / z: 757) a partir do espectro total, respectivamente. O tamanho do pixel das imagens de íons é de 35 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: a variação do sinal diminui à medida que diminui a temperatura da placa de amostra durante o processo de secagem, as imagens obtidas com MALDI são maltotriose (a) e bradicinina fragmento (1-7) (b) preparado com THAP sob temperaturas placa de amostras diferentes.. Dados vermelhos e azuis indicam a amostra preparada nas temperaturas placa de amostra de 25 e 5 ° C, respectivamente.g "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Amostra temperatura da placa (° C) | Amostra | Temperatura do ar (° C) | A umidade relativa (UR%) | Tempo de Secagem (seg) |
| 5 | maltotriose com THAP | 20 ± 3 | <25 | 800 - 1000 |
| fragmento de bradicinina (1-7) com THAP | ||||
| 25 | maltotriose com THAP | 25 ± 3 | 100-150 | |
| fragmento de bradicinina (1-7) com THAP |
Tabela 1: parâmetros experimentais e condições de secagem sob temperaturas placa de amostra diferentes.
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Discussion
Com base em previsões teóricas anteriores, fluxos hidrodinâmicos induzidas pela temperatura dentro de gotículas pode ultrapassar para fora fluxos capilares induzidas por evaporação do solvente. A eficiência de tais moléculas de recirculação interna é aumentada quando a gradientes de temperatura dentro de um aumento de gotícula. De acordo com os resultados previstos, ao manter a temperatura da placa de amostra abaixo de 5 ° C, mantendo a sua envolvente, à temperatura ambiente, a velocidade média de fluxo de recirculação no interior da gotícula é de cerca de quatro vezes mais rapidamente do que a dos fluxos de capilares externas. Se a temperatura da placa de amostra é o mesmo que o ambiente, a velocidade média dos fluxos de recirculação é de 1.800 vezes mais lento que o fluxo capilar para fora. Os resultados desse cálculo indicam que a diminuição da temperatura da placa de amostra durante a preparação da amostra é vantajosa. As observações experimentais concordam com esta previsão.
O temperamento placa de amostratura deve ser controlado com precisão ao longo da amostra preparação processo. A Tabela 1 mostra o tempo de secagem típico gota com 0,1 ul de amostra sob temperaturas placa de amostras diferentes. Antes de depositar solução da amostra sobre a placa, que é importante para assegurar que a superfície da placa de amostra é seca. Se a condensação de água ocorre quando o preparo de amostras sob baixas temperaturas, a deposição da solução da amostra não é recomendado porque a água condensada amplia áreas de amostra e dilui soluções. Assim, é importante para manter a humidade relativa na câmara de secagem abaixo de 25%. Além disso, ao preparar amostras sob baixas temperaturas, a placa de amostra deve ser quente até à temperatura ambiente antes de retirá-lo da câmara de secagem. Embora menor condensação de água após a conclusão da cristalização da amostra não altera a população de amostra, condensação significativa deve ser evitado.
O uso de soluções pré-misturadas recém é recoremendado. Uma vez que as soluções pré-misturadas são expostos ao ar, pré-cristalizações de as soluções de amostras e ocorrer o tamanho do cristal final e a morfologia pode mudar. Portanto, o processo de pipetagem deve ser realizado com uma eficiência razoável, tipicamente dentro de 10 segundos, para evitar que a gota de amostra de pré-cristalização no interior da ponta de pipeta. Recomenda-se observar morfologias de amostra sob um microscópio para assegurar morfologias de cristal adequados são produzidos, antes da análise de espectrometria de massa. Se as morfologias cristalinas não são tão boa como seria de esperar, repetindo-se o processo de deposição, conforme necessário.
De acordo com os nossos estudos teóricos e experimentais, a preparação de amostras com uma placa de amostra baixa temperatura instalado em condições ambientais melhora a reprodutibilidade dos dados e qualidade em MALDI-MS. Experiências subsequentes também apresentaram aumento significativo da intensidade do sinal com este método de preparação da amostra. Os dados experimentais obtidos por tseu método melhorar consideravelmente a confiabilidade dos espectros de massa MALDI para análises quantitativas. Em comparação com outros métodos que envolvem a composição solução ou alterações de propriedade de superfície, 8,16-18 condição de mudança de secagem é mais simples e mais geralmente aplicáveis para amostras convencionais. Assim, a maioria dos usuários de espectrometria de massa pode se beneficiar dele em aplicações regulares.
Melhorar a homogeneidade sinal MALDI com a diminuição da temperatura da placa de amostra também é eficaz para algumas outras matrizes populares. Por exemplo, a melhoria da α-ciclodextrina (α-CD) homogeneidade sinal com THAP e α-ciano-4-hidroxicinâmico (CHCA) como a matriz sob condições amostra de secagem de baixa temperatura tem sido relatada recentemente. 14 A desvantagem com a mudança de placa de amostras temperatura é que o método é atualmente impróprias para análise de alto rendimento, devido ao longo tempo de secagem da amostra em condições de baixa temperatura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Detergent powder | Alconox | 242985 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Acetonitrile | Merck | 100003 | |
| 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) | Sigma-Aldrich | T64602 | |
| Bradykinin fragment (1-7) | Sigma-Aldrich | B1651 | |
| Maltotriose | Sigma-Aldrich | 47884 | |
| Pipette tips | Mettler Toledo | 17005091 | |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| Equipment | |||
| Milli-Q water purification system | Millipore | ZMQS6VFT1 | |
| Powder-free nitrile gloves | Microflex | SU-690 | |
| 600 ml beaker | Duran | 2110648 | |
| Ultrasonic cleaner | Delta | DC300H | |
| Hygrometer | Wisewind | 5330 | |
| Nitrogen gas flowmeter | Dwyer | RMA-6-SSV | |
| K-type thermocouples | Digitron | 311-1670 | |
| Centrifuge | Select BioProducts | Force Mini | |
| Pipette | Rainin | pipet-lite XLS | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Temperature controllable drying chamber | this lab | ||
| Synchronized dual-polarity time-of-flight imaging mass spectrometer (DP-TOF IMS) | this lab | ||
| MALDI-TOF stainless steel sample target | this lab |
References
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