Summary
En protokoll for å redusere romlige hetrogeniteter av ion signaler i MALDI massespektrometri ved å regulere overflatetemperatur under prøvetørkeprosesser blir demonstrert.
Protocol
MERK: Denne protokoll er utviklet for å redusere den romlige heterogenitet av maltotriose og bradykinin-fragment (1-7) fremstilt med den tørkede-dråpe-metoden. Protokollen består av tre hovedtrinn, inkludert forberedelse og preconditioning, sample avsetning og tørking, og massespektrometri dataanalyse. Prosedyrene er skissert og beskrevet i mer detalj nedenfor:
1. Forberedelse og Forbehandling
- Rengjøring av Sample Plate
- Bruke nitrilhansker og hånd-vaske prøven plate forsiktig med vaskemiddel og destillert-deionisert vann (DDW).
- Skyll prøven plate med metanol (MeOH) og DDW.
- Sett prøven plate i et 600 ml begerglass og fyll med DDW.
- Sonicate prøven plate i DDW i 15 min i et ultralydbad (200 W, 40 kHz).
- Fjern DDW fra begeret og fylle begeret med MeOH.
- Sonikere prøveplaten i MeOH i 15 min i ultralydbad (200 V, 40 kHz).
- Blåse av oppløsningsmiddeldråper på plate med nitrogengass og hold prøveplaten tørr før prøven avsetning.
- Regulering Tørking kammer Temperatur
MERK:. Tørkekammeret er en 35 x 20 x 45 cm 3 (B x D x H) akryl kammeret Figur 1 viser bildet av denne tørkesystem. Kammeret ble spylt med værelsetemperatur nitrogengass gjennom en gass-strømningsmåler ved en konstant strømningshastighet for å opprettholde en lav relativ fuktighet tilstand overvåkes av en kalibrert hygrometer montert inne i tørkekammeret. En kobberbasert blokk i tørkekammeret er utstyrt med en programmert konstant temperatur vannsirkulasjonspumpe anvendes for å imøtekomme rustfritt stål prøveplater. Den kobberbase-blokken er i stand til å regulere prøveplaten temperatur på fra 5 til 25 ° C. Temperaturene for luft, kobber fundamentblokk, og prøven platen overvåkes av K-type termoelementer.- Åpne døren og raskt sette prøven plate på kobberbasen blokk og lukk døren.
- Manuelt justere gassmengdemåler for å stille nitrogenstrømningshastigheten til 10 standard kubikkfot per time (SCFH).
- Overvåk relativ fuktighet i tørkekammeret av hygrometer og finjustere gassmengdemåler for å sikre den relative luftfuktigheten er alltid under 25%.
- Overvåke temperaturen i prøveplaten av K-type termoelementer og justere vannsirkulasjonspumpen temperaturen manuelt inntil prøveplaten når 5 ° C i eksperiment eller ved romtemperatur (25 ° C) for kontroll.
NB: For å stabilisere prøven plate ved en temperatur utformet, vannsirkulasjonspumpe temperaturen innstilles typisk 0 til 5 ° C lavere enn det utformet prøven. For eksempel, for å opprettholde 5 ° C på prøveplaten, temperaturinnstillingen av vannet sirkulator er i området fra 0 til 2 ° C; for å opprettholde prøven plate ved 25 ° C, temperaturen innstillingen av vann sirkulator er i størrelsesorden av 23 til 25 ° C. - Sikre de nødvendige temperaturer og den relative luftfuktigheten er nådd (tabell 1) før prøven avsetning.
NOTE: Alle parametre så vel som deres innstillingsverdiene for de tørkeprosesser med forskjellige prøve-plate-temperaturer er vist i tabell 1.
MERK: På et lite utvalg plate temperatur, kan vannkondens på prøven plate oppstå hvis kammeret dør er åpen for lenge. Hvis vannet oppstår kondens, lukk døren og IKKE sette enhver prøve på det før vannkondens er tørket ut.
- Utarbeidelse av Matrix og analytt Solutions
- Utarbeidelse av matriseløsninger
- Forbered 0,1 M Thap løsning med 50% acetonitril (ACN): 50% DDW vandig løsning.
- Utarbeidelse av analytter
- Forbered 10 -4 M maltotriose løsning med DDW.
- Forbered 10 -5 M bradykinin fragment (1-7) løsning i 50% acetonitril(ACN): 50% DDW vandig oppløsning.
- Utarbeidelse av matriseløsninger
2. Prøve Nedfall og tørking
- Premix 0,25 ul 0,1 M thap oppløsning og 0,25 ul 10 -4 M maltotriose eller 10 -5 M bradykinin-fragment (1-7) oppløsninger i et mikrosentrifugerør.
- Vortex den blandede oppløsningen i 3 sek.
- Sentrifuger den blandede oppløsningen i 2 sek (2000 xg) for å samle opp løsningen på bunnen av sentrifugerøret.
- Åpne døren til tørkekammeret, nøye sette 0,1 mL av løsningen på prøven plate med pipette og lukk døren umiddelbart.
- Vent til prøven dråpen til å tørke ut.
. MERK: vanligvis observert tørketider med ulike sample plate temperaturer er oppført i tabell 1 For eksempel tallerken temperatur på 5 ° C, er den gjennomsnittlige tørketiden 800 til 1000 sekunder; for prøveplatetemperatur på 25 ° C, er den gjennomsnittlige tørketiden 100 til 150 sec. - Etter tørking åpne døren til tørkekammeret.
- Satt vann sirkulator temperaturen til romtemperatur (25 ° C).
MERK: Hopp over dette trinnet hvis prøven platen holdes konstant ved romtemperatur (25 ° C) i løpet av tørkeprosessen. - Etter at prøven plate temperaturen går tilbake til romtemperatur (25 ° C), ta prøven plate fra tørkekammeret.
- Undersøke prøven morfologi under en 5X stereomikroskop og ta et øyeblikksbilde lyse-feltet image.
MERK: Hvis det krystall morfologi ikke er som forventet, er det nødvendig å utarbeide en ny prøve med samme prosedyre. Typiske krystall morfologi er vist i de øvre paneler av figur 2.
NB: I tilfellene med lave prøve-plate-temperaturer, for eksempel 5 ° C, er det viktig å varme opp prøven plate til romtemperatur før den er tatt ut av tørkekammeret. Ved innskudd prøvene, ikke hold den ferdigblandet løsning;n i spissen av pipetten over 10 sek. IKKE bruk ferdigblandet løsning igjen etter innskudds prøvene. De øvre paneler av Figur 2 viser lyse-feltet bilder av prøver fremstilt med ulike sample plate temperaturer.
3. massespektrometri Data Analysis
- Massespektrometri Data Acquisition
MERK: Etter forberedelse, kan prøven analyseres ved hjelp av bildebehandling massespektrometri. I denne studien, er de bildedannende MS-eksperimenter utført ved bruk av en laboratorie-inne synkronisert dual-polaritet TOF (DP-TOF) avbildning massespektrometer. 15 Kommersiell MALDI-TOF massespektrometre med bildekapasitet er også egnet for slike eksperimenter. Den massespektrometer opereres i lineær utvinning og positive ion moduser med optimalisert utvinning forsinkelser. Den kinetiske energien av ioner som er 20 kV. Laserstrålen størrelse er 35 mikrometer i diameter på prøveoverflaten, og spekteret for hvert sted er det averaseri av 5 laser skudd.- Sett prøveplaten inn i MALDI massespektrometer.
- Utføre avbildning massespektrometrianalyse til prøven fremstilt i trinn 2.1-2.9.
- Velg en karakteristisk masse topp fra massen listen som vises i resultatvinduet og klikk "2D" å plotte et todimensjonalt ion bilde.
MERK: For maltotriose blandet med Thap, er de karakteristiske toppene sodiated maltotriose, protonert Thap, og sodiated Thap. For bradykinin fragment (1-7) blandet med Thap, inkluderer de karakteristiske toppene protonert bradykinin fragment (1-7), proton Thap, og sodiated Thap. - Klikk på justeringsknappene i vinduet for å bestemme øvre og nedre grense for signalintensitet og klikk "lagre et bilde". Denne innstillingen definerer kontrasten ion bilder.
MERK: I hver enkelt sett med data, er det sprakk regionene og null flekker som viser lav lysstyrke eliminert. - Observere og sammenligne ionbilde med lys-felt bilde som ble tatt ved trinn 2.9.
MERK: Imaging massespektrometri og konstruksjon av bilder av visse ioner kan oppnås med kommersielle instrumenter. På grunn av det mangfoldet av datainnsamling og analyse programvare, bør brukerne følge programvareinstruksjoner gitt av instrumentet leverandøren for å få bilder av høy kvalitet.
- Dataanalyse
MERK: heterogenitet av prøvene er analysert kvantitativt. I denne demonstrasjonen, er hvert sample delt inn i flere konsentriske områder av programvare utviklet internt for å analysere den romlige fordelingen av ioner. Analysen kan også utføres ved bruk av frittstående dataanalyse-programvare.- Klikk på null flekker og sprakk regionene i ion bildet som vises i resultatvinduet for å fjerne uviktige områder.
MERK: Denne prosedyren definerer den essensielle delen av ion bilde. - Klikk "finne edge" for å finne den ytterste laget av ion bildet.
- Klikk på "trekke fra" for å lagre informasjonen ion overflod av det ytterste lag i en database, og fjerne dette lag fra den ion-bilde samtidig. En sjekk boksen som representerer dette ytterste laget vil vises i "utgangsdata" liste over resultatvinduet.
- Gjenta trinn 3.2.2 og 3.2.3 til midten av ion bildet er definert.
- Klikk og velg alle boksene i "utgangsdata" -listen, og klikk "eksport" for å eksportere dataene.
- Åpne den eksporterte data ved hjelp av regneark programvare for å beregne gjennomsnittlig ion overflod av hvert lag for å oppnå den romlige fordelingen informasjon av ioner.
- Klikk på null flekker og sprakk regionene i ion bildet som vises i resultatvinduet for å fjerne uviktige områder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den lyse-feltet bilder så vel som de MS bilder av maltotriose og bradykinin-fragment (1-7) fremstilt med prøve platetemperatur på 5 og 25 ° C er vist i figur 1. I tilfelle av sodiated maltotriose, ione-signal hovedsakelig fylles ved periferien av prøveområdet når det fremstilles med et utvalg platetemperatur på 25 ° C. Ved å redusere prøveplatetemperatur på 5 ° C, det signal fylles homogent over hele prøveområdet. Den eneste merkbare ulempen ved utarbeidelse av prøvene under 5 ° C er at det er flere sprekker enn prøvene utarbeidet under 25 ° C. Ion bilde av protonert bradykinin-fragment (1-7) viser en lignende tendens som de av sodiated maltotriose. Resultatene av tenkelig MS tyder på at å forberede prøver under et lavere prøveplatetemperatur i betydelig grad kan redistribuere molekylene og redusere heterogenitet.
Figur 3 viser resultatene av statistiske analyser for maltotriose og bradykinin-fragment (1-7) fremstilt i henhold til prøveplatetemperaturer på 5 og 25 ° C. For hver prøve, er den gjennomsnittlige intensitet normalisert. I tilfelle av sodiated maltotriose med en prøveplatetemperatur på 25 ° C, signalintensitetene ved sentrene er mye lavere enn de med prøveplatetemperatur på 5 ° C. Resultatet av protonert bradykinin-fragment (1-7) også viser mindre variasjon når avtagende prøveplatetemperatur 25-5 ° C.
Figur 1: Bilde av prøven tørkesystem.Tørkekammeret er laget av akryl. Kammeret ble spylt med nitrogengass værelsetemperatur for å opprettholde en lav relativ fuktighet. En kobberbasert blokk er utstyrt med en programmert konstant temperatur vannsirkulasjonspumpe anvendes for å regulere temperaturen av rustfritt stålprøveplater. Termometrene overvåke luft, kobber basen blokk, og prøven plate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Senke prøveplate temperatur fører til bedre signal homogenitet De lyse felt bilder (øverste bilde) samt MALDI bilder (lavere bilder) av maltotriose (a) og bradykinin fragment (1-7) (b) tilberedt med Thap under ulike sample plate temperaturer. den MALDI bilder ble oppnådd ved å ekstrahere den sodiated maltotriose (m / z: 527) og protonert bradykinin fragment (1-7) (m / z: 757) fra det totale spektrum, henholdsvis. Den pikselstørrelse på ion bildene er 35 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Signal variasjon reduseres når prøveplaten temperaturen synker under tørkeprosessen MALDI bilder er oppnådd med maltotriose (a) og bradykinin-fragment (1-7) (b) fremstilt med thap under forskjellige prøveplater temperaturer.. Rød og blå data tyder på at prøve fremstilt ved prøve-plate-temperaturer på 25 og 5 ° C, respektivt.g "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Eksempel Plate Temperatur (° C) | Prøve | Lufttemperatur (° C) | Relativ luftfuktighet (RH%) | Tørketid (sek) |
| 5 | maltotriose med Thap | 20 ± 3 | <25 | 800 - 1000 |
| bradykinin fragment (1-7) med Thap | ||||
| 25 | maltotriose med Thap | 25 ± 3 | 100-150 | |
| bradykinin fragment (1-7) med Thap |
Tabell 1: Eksperimentelle parametere og tørkeforhold under forskjellige sample plate temperaturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Basert på tidligere teoretiske forutsigelser, kan temperaturinduserte hydrodynamiske strømmer innenfor dråper vinne utover kapillære strømmer indusert av løsemiddel fordampning. Effektiviteten av en slik intern resirkulasjon av molekyler som er forbedret når det temperaturgradienter innenfor et dråpeøkning. I henhold til de forutsagte resultater, når man holder prøveplaten temperatur under 5 ° C under opprettholdelse av dens omgivelser ved omgivelsestemperatur, er den gjennomsnittlige hastigheten til resirkuleringsstrømmer innenfor dråpe er omtrent fire ganger raskere enn den ytre kapillære strømmer. Hvis prøven platetemperatur er den samme som omgivelsene, er den gjennomsnittlige hastigheten til resirkuleringsstrømmer er 1,800 ganger langsommere enn den ytre kapillær strømning. Resultatet av denne beregningen viser at avtagende prøveplatetemperatur under tillagingen er fordelaktig. De eksperimentelle observasjonene er enig med denne spådommen.
Prøven plate temperamentperaturen bør styres nøyaktig gjennom hele prøvefremstillingsprosessen. Tabell 1 viser typiske dråpetørketiden med 0,1 ul prøve under forskjellige prøveplater temperaturer. Før avsetning av prøveløsningen på tallerkenen, er det viktig å sikre at prøveplaten overflaten er tørr. Hvis vann kondens oppstår når forberede prøver ved lave temperaturer, er deponering av prøveløsningen anbefales ikke fordi kondensert vann utvider prøveområdene og utvanner løsninger. Derfor er det viktig å holde den relative fuktighet i tørkekammeret under 25%. I tillegg, ved fremstilling av prøvene under lave temperaturer, bør prøveplaten være varme opp til romtemperatur før den er tatt ut av tørkekammeret. Selv om mindre vann kondensering etter avslutningen av prøven krystallisering ikke endrer prøvepopulasjon, bør vesentlig kondensering unngås.
Bruken av fersk ferdigblandet løsninger er anbereparert. Når forhåndsblandede løsninger er utsatt for luft, pre-krystallisering av prøveløsninger oppstår og den endelige krystallstørrelse og morfologi kan endre seg. Derfor bør den pipettering prosedyre utføres med rimelig effektivitet, typisk innen 10 sekunder, for å forhindre at prøven dråpe fra pre-krystalliseringen i pipettespissen. Det anbefales å observere eksempel morfologi under et mikroskop for å sikre egnede krystall morfologi er produsert før massespektrometrianalyse. Hvis krystall morfologi er ikke så god som forventet, gjenta avsetningsprosessen som er nødvendig.
Ifølge våre teoretiske og eksperimentelle studier, fremstilling av prøver med en lav temperatur prøveplate installert under omgivelsesbetingelser forbedrer data reproduserbarhet og kvalitet i MALDI-MS. Senere forsøk viser også betydelig forsterkning av signalintensiteten med dette prøveopparbeidelse metode. De forsøksdata som oppnås ved thans metode vesentlig forbedre påliteligheten av MALDI massespektra for kvantitative analyser. I sammenligning med andre metoder som involverer løsning sammensetning eller overflateegenskapsforandringer, er 8,16-18 endring tørking tilstand enklere og mer generelt gjelder for konvensjonelle prøver. Dermed kan de fleste massespektrometri brukere dra nytte av det i vanlige applikasjoner.
Forbedring av MALDI signal homogenitet med avtagende prøveplatetemperatur er også effektiv for noen andre populære matriser. For eksempel, forbedret α-cyklodekstrin (α-CD) signal homogenitet med thap og α-cyano-4-hydroxycinnamic syre (CHCA) som matrise under lave temperaturer prøven tørkebetingelser er blitt rapportert nylig. 14 Ulempen med skiftende prøveplaten temperaturen er at fremgangsmåten er for tiden uegnet for high-throughput-analyse på grunn av den lange tørketid prøven ved lave temperaturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Detergent powder | Alconox | 242985 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Acetonitrile | Merck | 100003 | |
| 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) | Sigma-Aldrich | T64602 | |
| Bradykinin fragment (1-7) | Sigma-Aldrich | B1651 | |
| Maltotriose | Sigma-Aldrich | 47884 | |
| Pipette tips | Mettler Toledo | 17005091 | |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| Equipment | |||
| Milli-Q water purification system | Millipore | ZMQS6VFT1 | |
| Powder-free nitrile gloves | Microflex | SU-690 | |
| 600 ml beaker | Duran | 2110648 | |
| Ultrasonic cleaner | Delta | DC300H | |
| Hygrometer | Wisewind | 5330 | |
| Nitrogen gas flowmeter | Dwyer | RMA-6-SSV | |
| K-type thermocouples | Digitron | 311-1670 | |
| Centrifuge | Select BioProducts | Force Mini | |
| Pipette | Rainin | pipet-lite XLS | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Temperature controllable drying chamber | this lab | ||
| Synchronized dual-polarity time-of-flight imaging mass spectrometer (DP-TOF IMS) | this lab | ||
| MALDI-TOF stainless steel sample target | this lab |
References
- Karas, M., Hillenkamp, F. Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10000 Daltons. Anal. Chem. 60, 2299-2301 (1988).
- Beavis, R. C., Chait, B. T. Velocity Distributions of Intact High Mass Polypeptide Molecule Ions Produced by Matrix Assisted Laser Desorption. Chem. Phys. Lett. 181, 479-484 (1991).
- Beavis, R. C., Chaudhary, T., Chait, B. T. Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-Assisted Laser Desorption Mass-Spectrometry. Org. Mass Spectrom. 27, 156-158 (1992).
- Ehring, H., Karas, M., Hillenkamp, F. Role of Photoionization and Photochemistry in Ionization Processes of Organic-Molecules and Relevance for Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry. Org. Mass Spectrom. 27, 472-480 (1992).
- Strupat, K., Karas, M., Hillenkamp, F. 2,5-Dihydroxybenzoic Acid - a New Matrix for Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. Ion Process. 111, 89-102 (1991).
- Hu, H., Larson, R. G. Evaporation of a Sessile Droplet on a Substrate. J. Phys. Chem. B. 106, 1334-1344 (2002).
- Deegan, R. D., et al. Capillary Flow as the Cause of Ring Stains from Dried Liquid Drops. Nature. 389, 827-829 (1997).
- Hu, J. -B., Chen, Y. -C., Urban, P. L. Coffee-Ring Effects in Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chim. Acta. 766, 77-82 (2013).
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct Tissue Analysis Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry: Practical Aspects of Sample Preparation. J. Mass Spectrom. 38, 699-708 (2003).
- Hu, H., Larson, R. G. Marangoni Effect Reverses Coffee-Ring Depositions. J. Phys. Chem. B. 110, 7090-7094 (2006).
- Bhardwaj, R., Fang, X., Attinger, D. Pattern Formation During the Evaporation of a Colloidal Nanoliter Drop: A Numerical and Experimental Study. New J. Phys. 11, 075020 (2009).
- Savino, R., Paterna, D., Favaloro, N. Buoyancy and Marangoni Effects in an Evaporating Drop. J Thermophys Heat Tr. 16, 562-574 (2002).
- Probstein, R. F. Surface Tension. in Physicochemical Hydrodynamics : An Introduction. , John Wiley & Sons. Ch. 10 305-361 (1994).
- Lai, Y. -H., et al. Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27, 1314-1321 (2016).
- Hsiao, C. -H., et al. Comprehensive Molecular Imaging of Photolabile Surface Samples with Synchronized Dual-Polarity Time-of-Flight Mass Spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 25, 834-842 (2011).
- Vorm, O., Roepstorff, P., Mann, M. Improved Resolution and Very High-Sensitivity in MALDI TOF of Matrix Surfaces Made by Fast Evaporation. Anal. Chem. 66, 3281-3287 (1994).
- Gabriel, S. J., Schwarzinger, C., Schwarzinger, B., Panne, U., Weidner, S. M. Matrix Segregation as the Major Cause for Sample Inhomogeneity in MALDI Dried Droplet Spots. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25, 1356-1363 (2014).
- Mampallil, D., Eral, H. B., van den Ende, D., Mugele, F. Control of Evaporating Complex Fluids through Electrowetting. Soft Matter. 8, 10614-10617 (2012).
