Summary
Ett protokoll för att minska rumsliga heterogeniteter av jon signaler i MALDI masspektrometri genom att reglera substrattemperatur under provtorkningsprocesser visas.
Protocol
OBS: Detta protokoll har utvecklats för att minska den rumsliga heterogenitet maltotrios och bradykinin fragment (1-7) beredd med torkad droppmetoden. Protokollet består av tre huvudsteg, inklusive förberedelse och iordningställande prov nedfall och torkning och masspektrometrianalys data. Förfarandena beskrivs och beskrivs mer i detalj nedan:
1. Förberedelser och konditionering
- Rengöring av provplattan
- Bära nitrilhandskar och handtvätt provplattan försiktigt med rengöringsmedel och destillerat-avjoniserat vatten (DDW).
- Skölj provplattan med metanol (MeOH) och DDW.
- Sätt provplattan i en 600 ml bägare och fyll med DDW.
- Sonikera provplattan i DDW under 15 minuter i ett ultraljudsbad (200 W, 40 kHz).
- Ta DDW från bägaren och fylla bägaren med MeOH.
- Sonikera provplattan i MeOH under 15 min i ultraljudsbad (200 W, 40 kHz).
- Blåsa bort lösningsmedlet droppar på plattan med kvävgas och hålla provplattan torr innan provdeposition.
- Reglera torkningskammaren Temperatur
OBS:. Torkkammaren är en 35 x 20 x 45 cm 3 (B x D x H) akryl kammare Figur 1 visar bilden av denna torksystem. Kammaren fylls sedan med rumstemperatur kvävgas genom en gas flödesmätare med en konstant flödeshastighet för att bibehålla en låg relativ fuktighet tillstånd övervakas av en kalibrerad hygrometer installerad inuti torkkammaren. En koppar basblocket i torkkammaren utrustad med en programmerad konstant temperatur vatten cirkulator används för att rymma av rostfritt stålprov plattor. Koppar basblock är i stånd att reglera provplattan temperatur från 5 till 25 ° C. Temperaturerna hos luften, kopparbas blocket, och provplattan övervakas av K-typ termoelement.- Öppna dörren och snabbt sätta provplattan på kopparbasblocket stäng dörren.
- manuellt justera flödesmätare för att ställa in kväveflödeshastighet till 10 standard kubikfot per timme (scfh).
- Övervaka den relativa fuktigheten i torkkammaren med hygrometer och finjustera gas flödesmätare för att säkerställa den relativa luftfuktigheten är alltid under 25%.
- Övervakning av temperaturen i provplattan av K-typ termoelement och justera vatten cirkulator temperaturen manuellt tills provplattan når 5 ° C under experimentet eller rumstemperatur (25 ° C) under kontroll.
NOTERA: För att stabilisera provplattan vid en design temperatur, vattnet cirkulator temperaturen sätts typiskt 0-5 ° C lägre än den utformade provet. Till exempel, för att upprätthålla 5 ° C vid provplattan, är inställningen temperaturen på vattnet cirkulator i intervallet av 0 till 2 ° C; för att bibehålla provplattan vid 25 ° C, är temperaturinställningen för vattnet cirkulator i intervallet 23 till 25 ° C. - Se till att de temperaturer och den relativa luftfuktigheten uppnås (tabell 1) före prov nedfall.
NOTERA: Alla parametrar samt deras inställningsvärden för de torkprocesser med olika provplatt temperaturer visas i tabell 1.
OBS: Vid låg provplatta temperatur kan vattenkondensering på provplattan inträffa om kammardörren är öppen under en längre tid. Om kondens uppstår, stänga dörren och inte sätta in några prov på det tills kondens torkas ut.
- Framställning av Matrix och analytlösningar
- Framställning av matrislösningar
- Förbereda 0,1 M Thap lösning med 50% acetonitril (ACN): 50% DDW vattenlösning.
- Framställning av analyter
- Förbered 10 -4 M maltotrios lösningen med DDW.
- Förbered 10 -5 M bradykinin-fragmentet (7/1) -lösning i 50% acetonitril(ACN): 50% DDW vattenlösning.
- Framställning av matrislösningar
2. Prov Deponering och Torkning
- Foder 0,25 pl 0,1 M Thap lösning och 0,25 pl 10 -4 M maltotrios eller 10 -5 M bradykinin fragment (1-7) lösningar i ett mikrocentrifugrör.
- Vortex den blandade lösningen i 3 sek.
- Centrifugera den blandade lösningen i 2 sek (2000 xg) för att samla upp lösningen i botten av centrifugröret.
- Öppna dörren till torkkammaren, noggrant sätta 0,1 ul av lösningen på provplattan med pipett och stänga dörren omedelbart.
- Vänta på att provet droppen torka ut.
. OBS: De typiskt observerade torktider med olika provplatttemperaturer är uppräknade i tabell 1 För provplattan temperatur av 5 ° C, är den genomsnittliga torktid 800 till 1000 sek; för provplattan temperatur av 25 ° C, är den genomsnittliga torktid 100 till 150 sec. - Efter torkning, öppna dörren till torkkammaren.
- Ställa in vatten cirkulatorn temperaturen till rumstemperatur (25 ° C).
OBS: Hoppa över detta steg om provplattan hålls konstant vid rumstemperatur (25 ° C) under torkningsprocessen. - Efter provplattan temperaturen återgår till rumstemperatur (25 ° C), ta bort provplattan från torkkammaren.
- Undersök prov morfologi under 5X stereo och ta en ögonblicksbild ljusfältsbild.
OBS: Om kristall morfologier inte som förväntat, är det nödvändigt att förbereda ett nytt prov med samma förfarande. Typiska kristall morfologier visas i de övre panelerna i figur 2.
OBS: I de fall med låga provplattan temperaturer, såsom 5 ° C, är det viktigt att värma upp provplattan till rumstemperatur innan du tar ut den ur torkkammaren. Vid deponeringen av proverna, inte håller den förblandade Solution i pipettspetsen över 10 sek. INTE använda den förblandade lösningen igen efter insättning proverna. De övre panelerna i figur 2 visar ljusfält bilder av prover framställda med olika provplattan temperaturer.
3. masspektrometri Data Analysis
- Masspektrometri Data Acquisition
OBS: Efter beredning kan provet analyseras med hjälp av bildbehandling masspektrometri. I den aktuella studien, är bild MS experiment med hjälp av en laboratoriebyggd synkroniserade dubbla polaritet TOF (DP-TOF) imaging masspektrometer. 15 Commercial MALDI-TOF masspektrometrar med avbildande förmåga är också lämpliga för sådana experiment. En masspektrometer drivs i linjär extraktion och positiva joner lägen med optimerade utvinnings förseningar. Den kinetiska energin hos jonerna är 20 kV. Laserstrålen storleken är 35 | im i diameter på provets yta, och det spektrum av varje plats är det averaseri av 5 laserskott.- Sätt i provplattan in i MALDI masspektrometer.
- Utför avbildning masspektrometrianalys till provet som beretts i steg 2.1-2.9.
- Välj en karakteristisk masstopp från masslistan som visas i resultatfönstret och klicka på "2D" att rita en tvådimensionell jon bild.
OBS: För maltotrios blandat med Thap är de karakteristiska topparna sodiated maltotrios, proton Thap och sodiated Thap. För bradykinin fragment (1-7) blandas med Thap, inkluderar de karakteristiska topparna proton bradykinin fragment (1-7), proton Thap och sodiated Thap. - Klicka på knapparna anpassning i popup-fönstret för att bestämma de övre och nedre gränserna för signalstyrka och klicka på "spara en bild". Denna inställning definierar kontrast jon bilder.
OBS: I varje enskild uppsättning data, de spruckna områdena och noll fläckar visar låg ljusstyrka elimineras. - Observera och jämföra jonbild med ljusa fält bild som togs i steg 2,9.
OBS: Bildåtergivning masspektrometri och konstruktion av bilder av särskilda joner kan uppnås med kommersiella instrument. På grund av den mångfald av datainsamling och analys, bör användarna följa programvaruinstruktioner som tillhandahålls av instrumentet säljaren att få högkvalitativa bilder.
- Dataanalys
OBS! Heterogenitet prover analyseras kvantitativt. I denna demonstration är varje prov delas upp i flera koncentriska områden av programvara egenutvecklade för att analysera den geografiska fördelningen av jonerna. Analysen kan även utföras med användning av fristående dataanalys programvara.- Klicka noll fläckar och de spruckna regioner i jon bilden som visas i resultatfönstret för att ta bort oviktiga områden.
OBS: Detta förfarande definierar viktigt område av jon bild. - Klicka på "hitta kant" för att hitta den yttersta lagret av jon bilden.
- Klicka på "dra av" för att spara jon överflöd informationen av yttersta skiktet i en databas och ta bort detta skikt från jon bilden samtidigt. En kryssruta som representerar denna yttersta skikt visas i "utdata" lista över resultatfönstret.
- Upprepa steg 3.2.2 och 3.2.3 tills mitten av jon bilden definieras.
- Klicka och välj alla kryssrutor i "utdata" listan och klicka på "export" för att exportera data.
- Öppna exporterade data med hjälp av kalkylprogram för att beräkna den genomsnittliga jon överflöd av varje skikt för att erhålla den rumsliga informationsspridning av joner.
- Klicka noll fläckar och de spruckna regioner i jon bilden som visas i resultatfönstret för att ta bort oviktiga områden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De ljusa fält bilder samt MS bilder av maltotrios och bradykinin fragment (1-7) framställd med provplattan temperatur 5 och 25 ° C visas i figur 1. När det gäller sodiated maltotrios, främst jon signal fylls vid periferin av provområdet när den är beredd med en provplatta temperatur av 25 ° C. Genom minskning av provplattan temperaturen till 5 ° C, fylls signalen homogent över hela provarean. Den enda märkbara nackdelen vid framställning av prov under 5 ° C är att det finns fler sprickor än de prover framställda under 25 ° C. Jon bild av proton bradykinin fragment (1-7) visar en liknande trend som de sodiated maltotrios. Resultaten av avbildning MS tyder på att förbereda prov under en lägre provplatta temperatur kan avsevärt omfördela molekylerna och minska heterogeniteten.
Figur 3 visar resultaten av statistiska analyser för maltotrios och bradykinin-fragment (1-7), som framställts i enlighet med provplattan temperaturer på 5 och 25 ° C. För varje prov, är den genomsnittliga intensiteten normaliserades. I fallet med sodiated maltotrios med en provplatta temperatur av 25 ° C, signalintensiteterna vid de centra är mycket lägre än de med provplattan temperatur av 5 ° C. Resultatet av protonerad bradykinin fragment (1-7) visar också mindre variation vid minskning provplattan temperatur 25-5 ° C.
Figur 1: Bild på provtorksystem.Torkkammaren är tillverkad av akryl. Kammaren fylls sedan med rumstemperatur kvävgas för att bibehålla en låg relativ luftfuktighet. En koppar basblock utrustad med en programmerad konstant temperatur vatten cirkulator används för att reglera temperaturen på provplattor av rostfritt stål. Termometrarna övervakar luft, kopparbas blocket och provplattan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Sänkning provplatta temperatur resulterar i bättre signal homogenitet De ljusa fält bilder (övre bilder) samt MALDI bilder (lägre bilder) av maltotrios (a) och bradykinin fragment (1-7) (b) framställd med Thap under olika provplattan temperaturer. MALDI bilder erhölls genom att extrahera sodiated maltotrios (m / z: 527) och protonerad bradykinin fragmentet (7/1) (m / z: 757) från den totala spektret, respektive. Pixel storlek jon bilderna är 35 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Signal variation minskar som provplattan temperaturen sjunker under torkningen MALDI bilder erhålls med maltotrios (a) och bradykinin fragment (1-7) (b) framställd med Thap under olika provplattan temperaturer.. Röd och blå data indikerar det prov som beretts vid provplattan temperaturer på 25 och 5 ° C, respektive.g "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Provplattan Temperatur (° C) | Prov | Lufttemperatur (° C) | Relativ fuktighet (RH%) | Torkningstid (sek) |
| 5 | maltotrios med Thap | 20 ± 3 | <25 | 800 - 1000 |
| bradykinin-fragment (1-7) med Thap | ||||
| 25 | maltotrios med Thap | 25 ± 3 | 100-150 | |
| bradykinin-fragment (1-7) med Thap |
Tabell 1: Experimentella parametrar och torkningsbetingelser under olika provplattan temperaturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Baserat på tidigare teoretiska förutsägelser, kan temperatur inducerade hydrodynamiska flöden inom droppar vinna utåt kapillära flöden induceras genom lösningsmedelsindunstning. Verkningsgraden för en sådan intern återcirkulation av molekyler ökar när den temperaturgradienter inom en dropp ökning. Enligt de förutspådda resultaten, när hålla provplattan temperatur under 5 ° C under upprätthållande av dess omgivning vid omgivningstemperatur, är den genomsnittliga hastigheten för återcirkulationsflöden inom droppen ca fyra gånger snabbare än den för de yttre kapillära flödena. Om provet plattemperaturen är densamma som omgivningen, är den genomsnittliga hastigheten för cirkulationsflödena 1.800 gånger långsammare än den utåt kapillärflöde. Resultaten av denna beräkning indikerar att minskande provplatta temperatur under provberedningen är fördelaktig. De experimentella observationer överensstämmer med denna förutsägelse.
Provplattan humörratur bör kontrolleras noggrant under hela provberedningsprocessen. Tabell 1 visar den typiska dropptorktiden med 0,1 pl prov under olika provplattan temperaturer. Innan avsättning av provlösningen på plattan, är det viktigt att se till att provplattan ytan är torr. Om kondens uppstår vid framställning av prover under låga temperaturer, är avsättning av provlösningen rekommenderas inte eftersom kondenserat vatten förstorar provområden och späder lösningar. Således är det viktigt att hålla den relativa fuktigheten i torkkammaren under 25%. Dessutom, när de förbereder prov under låga temperaturer, bör provplattan vara varm upp till rumstemperatur innan du tar ut den ur torkkammaren. Även mindre kondens efter avslutad provkristallisering inte förändrar provpopulationen, bör betydande kondensation undvikas.
Användningen av nyligen förblandade lösningar är rekommenderas. När förblandade lösningarna utsätts för luft, pre-kristallisa av provlösningar förekommer och den slutliga kristallstorlek och morfologi kan ändras. Därför bör pipetteringsförfarandet utföras med rimlig effektivitet, typiskt inom 10 sekunder, för att förhindra provdroppen från pre-kristallisation inuti pipettspetsen. Det rekommenderas att iaktta prov morfologier under ett mikroskop för att säkerställa lämpliga kristall morfologier produceras innan masspektrometrianalys. Om kristall morfologier är inte lika bra som förväntat, upprepa avsättningsprocessen vid behov.
Enligt våra teoretiska och experimentella studier, förbereda prover med låg temperatur provplatta installeras under omgivningsförhållanden avsevärt förbättrar reproducerbarhet och datakvalitet i MALDI-MS. Efterföljande experiment visar också signifikant förbättring av signalintensiteten med denna provberedningsmetod. De experimentella data som erhållits genom thans metod avsevärt förbättra tillförlitligheten MALDI-spektra för kvantitativa analyser. I jämförelse med andra metoder som involverar lösning sammansättning eller yta egenskap ändras, är 8,16-18 föränderliga tork tillstånd enklare och mer generellt gäller för konventionella prover. Således kan de flesta masspektrometri användare dra nytta av den i vanliga applikationer.
Förbättra MALDI signal homogenitet med minskande provplattemperaturen är också effektiva för vissa andra populära matriser. Exempelvis förbättrad α-cyklodextrin (α-CD) signal homogenitet med Thap och α-cyano-4-hydroxikanelsyra (CHCA) som matris under låg-temperaturprovtorkningsförhållanden har rapporterats nyligen. 14 Nackdelen med förändrade provplatta temperatur är att metoden är för närvarande olämpliga för high-throughput-analys på grund av den långa prov torktid i låga temperaturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Detergent powder | Alconox | 242985 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Acetonitrile | Merck | 100003 | |
| 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) | Sigma-Aldrich | T64602 | |
| Bradykinin fragment (1-7) | Sigma-Aldrich | B1651 | |
| Maltotriose | Sigma-Aldrich | 47884 | |
| Pipette tips | Mettler Toledo | 17005091 | |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| Equipment | |||
| Milli-Q water purification system | Millipore | ZMQS6VFT1 | |
| Powder-free nitrile gloves | Microflex | SU-690 | |
| 600 ml beaker | Duran | 2110648 | |
| Ultrasonic cleaner | Delta | DC300H | |
| Hygrometer | Wisewind | 5330 | |
| Nitrogen gas flowmeter | Dwyer | RMA-6-SSV | |
| K-type thermocouples | Digitron | 311-1670 | |
| Centrifuge | Select BioProducts | Force Mini | |
| Pipette | Rainin | pipet-lite XLS | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Temperature controllable drying chamber | this lab | ||
| Synchronized dual-polarity time-of-flight imaging mass spectrometer (DP-TOF IMS) | this lab | ||
| MALDI-TOF stainless steel sample target | this lab |
References
- Karas, M., Hillenkamp, F. Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10000 Daltons. Anal. Chem. 60, 2299-2301 (1988).
- Beavis, R. C., Chait, B. T. Velocity Distributions of Intact High Mass Polypeptide Molecule Ions Produced by Matrix Assisted Laser Desorption. Chem. Phys. Lett. 181, 479-484 (1991).
- Beavis, R. C., Chaudhary, T., Chait, B. T. Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-Assisted Laser Desorption Mass-Spectrometry. Org. Mass Spectrom. 27, 156-158 (1992).
- Ehring, H., Karas, M., Hillenkamp, F. Role of Photoionization and Photochemistry in Ionization Processes of Organic-Molecules and Relevance for Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry. Org. Mass Spectrom. 27, 472-480 (1992).
- Strupat, K., Karas, M., Hillenkamp, F. 2,5-Dihydroxybenzoic Acid - a New Matrix for Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. Ion Process. 111, 89-102 (1991).
- Hu, H., Larson, R. G. Evaporation of a Sessile Droplet on a Substrate. J. Phys. Chem. B. 106, 1334-1344 (2002).
- Deegan, R. D., et al. Capillary Flow as the Cause of Ring Stains from Dried Liquid Drops. Nature. 389, 827-829 (1997).
- Hu, J. -B., Chen, Y. -C., Urban, P. L. Coffee-Ring Effects in Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chim. Acta. 766, 77-82 (2013).
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct Tissue Analysis Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry: Practical Aspects of Sample Preparation. J. Mass Spectrom. 38, 699-708 (2003).
- Hu, H., Larson, R. G. Marangoni Effect Reverses Coffee-Ring Depositions. J. Phys. Chem. B. 110, 7090-7094 (2006).
- Bhardwaj, R., Fang, X., Attinger, D. Pattern Formation During the Evaporation of a Colloidal Nanoliter Drop: A Numerical and Experimental Study. New J. Phys. 11, 075020 (2009).
- Savino, R., Paterna, D., Favaloro, N. Buoyancy and Marangoni Effects in an Evaporating Drop. J Thermophys Heat Tr. 16, 562-574 (2002).
- Probstein, R. F. Surface Tension. in Physicochemical Hydrodynamics : An Introduction. , John Wiley & Sons. Ch. 10 305-361 (1994).
- Lai, Y. -H., et al. Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27, 1314-1321 (2016).
- Hsiao, C. -H., et al. Comprehensive Molecular Imaging of Photolabile Surface Samples with Synchronized Dual-Polarity Time-of-Flight Mass Spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 25, 834-842 (2011).
- Vorm, O., Roepstorff, P., Mann, M. Improved Resolution and Very High-Sensitivity in MALDI TOF of Matrix Surfaces Made by Fast Evaporation. Anal. Chem. 66, 3281-3287 (1994).
- Gabriel, S. J., Schwarzinger, C., Schwarzinger, B., Panne, U., Weidner, S. M. Matrix Segregation as the Major Cause for Sample Inhomogeneity in MALDI Dried Droplet Spots. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25, 1356-1363 (2014).
- Mampallil, D., Eral, H. B., van den Ende, D., Mugele, F. Control of Evaporating Complex Fluids through Electrowetting. Soft Matter. 8, 10614-10617 (2012).
