Summary
En protokol til at reducere rumlige heterogeniteter af ion signaler i MALDI massespektrometri ved at regulere substrat temperatur under prøven tørringsprocesser demonstreres.
Protocol
BEMÆRK: Denne protokol er udviklet til at reducere den rumlige heterogenitet maltotriose og bradykinin fragment (1-7) udarbejdet med tørrede-dråbe metoden. Protokollen består af tre trin, herunder forberedelse og forkonditionering prøve deposition og tørring, og massespektrometri dataanalyse. Procedurerne er beskrevet og beskrevet mere detaljeret nedenfor:
1. Forberedelse og Forkonditionering
- Rengøring af Sample Plate
- Bær nitrilhandsker og hånd-vaske prøven pladen forsigtigt med rengøringsmiddel og destilleret-demineraliseret vand (DDW).
- Det skylles derefter pladen med methanol (MeOH) og DDW.
- Sæt prøve plade i en 600 ml bægerglas og fyld med DDW.
- Sonikeres prøvepladen i DDW i 15 minutter i et ultralydsbad (200 W, 40 kHz).
- Fjern DDW fra bægeret og fylde bægeret med MeOH.
- Sonikeres prøvepladen i MeOH i 15 minutter i ultralydsbad (200 W, 40 kHz).
- Blæse opløsningsmidlet dråber på pladen med nitrogengas og holde prøven plade tørre, før prøven deposition.
- Regulering tørrekammerets Temperatur
BEMÆRK:. Tørrekammeret er en 35 x 20 x 45 cm 3 (B x D x H) acrylsyre kammer Figur 1 viser billedet af denne tørring system. Kammeret renses med stuetemperatur nitrogengas gennem en gas flowmeter ved en konstant strømningshastighed for at opretholde en lav relativ fugtighed tilstand overvåges af en kalibreret hygrometer installeret inde i tørrekammeret. En kobber basen blokeret tørrekammeret udstyret med en programmeret konstant temperatur vandcirkulator bruges til at rumme rustfrit stål prøveplader. Kobberet basen blok er i stand til at regulere prøvens plade temperatur fra 5 til 25 ° C. Temperaturerne af luft, kobber basen blok, og prøven plade overvåges af K-termoelementer.- Åbne døren og hurtigt sætte prøven plade på kobberbasen blok luk derefter døren.
- Juster manuelt gas flowmeter for at indstille nitrogenstrømningshastighed til 10 standard cubic feet pr time (SCFH).
- Overvåg den relative fugtighed i tørrekammeret ved hygrometer og finjustere gas flowmeter for at sikre den relative fugtighed er altid under 25%.
- Overvåge temperaturen af prøven plade af K-termoelementer og juster vandcirkulator temperatur manuelt indtil prøven plade når 5 ° C i forsøg eller stuetemperatur (25 ° C) til kontrol.
BEMÆRK: For at stabilisere prøven plade ved en konstrueret temperatur, vandcirkulator temperatur indstilles typisk fra 0 til 5 ° C lavere end den designede prøve. For eksempel, for at opretholde 5 ° C ved prøven plade, skal temperaturen af vandet cirkulationspumpen er i området fra 0 til 2 ° C; at opretholde prøven plade ved 25 ° C, skal temperaturen af vandet cirkulationspumpen er i området på 23 til 25 ° C. - Sørg de nødvendige temperatur- og den relative fugtighed er nået (tabel 1), før prøven deposition.
BEMÆRK: Alle parametre samt deres indstillingsværdier for tørringsprocesser med forskellige prøveplade temperaturer er vist i tabel 1.
BEMÆRK: Ved en lav prøveplade temperatur, kan vand kondens på prøvepladen forekomme, hvis kammeret døren er åben i lang tid. Hvis der opstår kondensvand, lukke døren og IKKE deponere nogen prøve på det, indtil vand kondens er tørret ud.
- Fremstilling af Matrix og analyt, Solutions
- Fremstilling af matrix løsninger
- Forbered 0,1 M Thap løsning med 50% acetonitril (ACN): 50% DDW vandig opløsning.
- Fremstilling af analytter
- Forbered 10 -4 M maltotriose løsning med DDW.
- Forbered 10 -5 M bradykinin fragment (1-7) opløsning i 50% acetonitril(ACN): 50% DDW vandig opløsning.
- Fremstilling af matrix løsninger
2. Prøve Deposition og Tørring
- Premix 0,25 pi 0,1 M thap opløsning og 0,25 pi 10 -4 M maltotriose eller 10 -5 M bradykinin fragment (1-7) opløsninger i et mikrocentrifugerør.
- Vortex blandede opløsning i 3 sek.
- Centrifugeres den blandede opløsning i 2 sek (2.000 xg) at indsamle opløsningen ved bunden af centrifugerøret.
- Åbn døren af tørrekammeret, omhyggeligt deponere 0,1 ul af løsningen på prøven plade med pipette og lukke døren med det samme.
- Vent på, at prøven dråben til at tørre ud.
. BEMÆRK: De typisk observerede tørretider med forskellige prøveplade temperaturer er anført i tabel 1 For prøveplade temperatur på 5 ° C, den gennemsnitlige tørretiden er 800 til 1.000 sek; for prøve plade temperatur på 25 ° C, den gennemsnitlige tørretid er 100 til 150 sec. - Efter tørring, åbner døren af tørrekammeret.
- Indstil vandcirkulator temperatur til stuetemperatur (25 ° C).
BEMÆRK: Spring dette trin, hvis prøven pladen holdes konstant ved stuetemperatur (25 ° C) under tørringsprocessen. - Efter at prøven plade temperaturen vender tilbage til stuetemperatur (25 ° C), fjern prøven pladen fra tørrekammeret.
- Undersøg prøven morfologi under en 5X stereomikroskop og tage et snapshot lysfeltsbillede.
BEMÆRK: Hvis der ikke er som forventet krystal morfologier, er det nødvendigt at udarbejde en ny prøve med den samme procedure. Typiske krystalmorfologier er vist i de øvre paneler af figur 2.
BEMÆRK: I de tilfælde med lave prøveplade temperaturer, såsom 5 ° C, er det vigtigt at opvarme pladen prøven til stuetemperatur før det tages ud af tørrekammeret. Ved deponering af prøverne, IKKE holde færdigblandede opklaringn i spidsen af pipetten over 10 sek. IKKE den færdigblandede opløsning bruge igen efter deponering prøverne. De øvre paneler af figur 2 viser lys-felt billeder af prøver fremstillet med forskellige prøveplade temperaturer.
Analyse 3. massespektrometri data
- Massespektrometri datafangst
BEMÆRK: Efter tilberedning kan prøven analyseres ved hjælp af billeddannelse massespektrometri. I den aktuelle undersøgelse, udføres de billeddannende MS eksperimenter under anvendelse af en laboratorie-bygget synkroniseret med dobbelt polaritet TOF (DP-TOF) afbildning massespektrometer. 15 Commercial MALDI-TOF massespektrometre med imaging kapacitet er også egnede til sådanne forsøg. Massespektrometret betjenes i lineær ekstraktion og positiv ion modus med optimerede udvinding forsinkelser. Den kinetiske energi af ioner er 20 kV. Laserstrålen størrelse er 35 um i diameter på prøveoverfladen, og spektret af hver plet er averaseri af 5 laser skud.- Sæt prøven plade ind i MALDI massespektrometer.
- Udfør billeddannelse massespektrometri analyse til prøven forberedt i trin 2.1-2.9.
- Vælg en karakteristisk massetop fra massen listen vist i resultatet, og klik "2D" at plotte et todimensionelt ion billede.
BEMÆRK: For maltotriose blandet med Thap er de karakteristiske toppe sodiated maltotriose, protoneret Thap, og sodiated Thap. For bradykinin fragment (1-7) blandet med Thap, omfatter de karakteristiske toppe protoneret bradykinin fragment (1-7), protoneret Thap, og sodiated Thap. - Klik på knapperne justering i pop-up-vinduet for at bestemme den øvre og nedre grænser for signalet intensiteten og klik på "gem et billede". Denne indstilling definerer kontrast ion billeder.
BEMÆRK: I hver enkelt datasæt, er krakket regioner og null pletter viser lav lysstyrke elimineret. - Observere og sammenligne ionenbillede med den lyse felt billede, der blev taget i trin 2.9.
BEMÆRK: Imaging massespektrometri og konstruktion af billeder af bestemte ioner kan opnås med kommercielle instrumenter. På grund af de mange forskellige dataindsamlings- og analysesoftware, bør brugerne følge software instruktionerne fra instrumentet sælgeren at få billeder af høj kvalitet.
- Dataanalyse
BEMÆRK: heterogenitet af prøver er analyseret kvantitativt. I denne demonstration er hver prøve opdeles i flere koncentriske områder ved software udviklet in-house til at analysere den rumlige fordeling af ioner. Analysen kan også udføres under anvendelse enkeltstående dataanalyse software.- Klik på null pletter og krakket regioner i ion billedet vises i resultatet vinduet for at fjerne ubetydelige områder.
BEMÆRK: Denne procedure definerer de væsentlige område ion billede. - Klik på knappen "kant find" for at finde den yderste lag af ionen billedet.
- Klik "fratrække" for at gemme ion overflod informationer om den yderste lag i en database og fjerne dette lag fra ion billede samtidig. Et afkrydsningsfelt repræsenterer denne yderste lag vises i "output data" liste over resultatet vinduet.
- Gentag trin 3.2.2 og 3.2.3, indtil midten af ionen billedet defineres.
- Klik og vælge alle afkrydsningsfelterne i "output data" listen og klik på "eksport" at eksportere data.
- Åbn de eksporterede data ved hjælp af regneark til at beregne den gennemsnitlige ion overflod af hvert lag for at opnå den rumlige fordeling information af ioner.
- Klik på null pletter og krakket regioner i ion billedet vises i resultatet vinduet for at fjerne ubetydelige områder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De lyse-field billeder samt MS billeder af maltotriose og bradykinin-fragment (1-7) fremstillet med prøveplade temperatur på 5 og 25 ° C er vist i figur 1. For sodiated maltotriose, ion signal hovedsagelig udfylder ved periferien af prøven, da den er fremstillet med en prøveplade temperatur på 25 ° C. Ved at nedsætte prøvepladen temperaturen til 5 ° C, signalet udfylder homogent over hele prøven området. Den eneste mærkbare ulempe ved udarbejdelsen prøver under 5 ° C er, at der er flere revner end de prøver, udarbejdet i henhold til 25 ° C. Det ion billede af protoneret bradykinin fragment (1-7) viser en lignende tendens som for sodiated maltotriose. Resultaterne af billeddannelse MS tyder på, at forberede prøver under en lavere prøve plade temperatur kan i væsentlig grad omfordele molekylerne og reducere heterogenitet.
Figur 3 viser resultaterne af statistiske analyser for maltotriose og bradykinin fragment (1-7) udarbejdet i henhold prøveplade temperaturer på 5 og 25 ° C. For hver prøve er den gennemsnitlige intensitet normaliseres. I tilfælde af sodiated maltotriose med en prøveplade temperatur på 25 ° C, signalintensiteter på centrene er meget lavere end dem med prøven plade temperatur på 5 ° C. Resultatet af protoneret bradykinin fragment (1-7) viser også mindre variation, når faldende prøvepladen temperatur fra 25 til 5 ° C.
Figur 1: Billede af prøven tørring system.Tørrekammeret er fremstillet af akryl. Kammeret renses med stuetemperatur nitrogengas for at opretholde en lav relativ fugtighed tilstand. En kobber basisblok udstyret med en programmeret konstant temperatur vandcirkulator anvendes til at regulere temperaturen af rustfrit stål prøveplader. De termometre overvåger luft, kobber bund blok, og prøven plade. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Sænkning prøve plade temperatur resulterer i bedre signal homogenitet De lyse felt billeder (øverste billeder) samt de MALDI billeder (lavere billeder) af maltotriose (a) og bradykinin fragment (1-7) (b) tilberedt med Thap under forskellige prøveplade temperaturer. MALDI billeder blev opnået ved at ekstrahere sodiated maltotriose (m / z: 527) og protoneret bradykinin fragment (1-7) (m / z: 757) fra det samlede spektrum hhv. Pixel størrelse ion billederne er 35 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Signal variation reducerer som prøveplade temperaturen falder under tørring proces MALDI billeder opnås med maltotriose (a) og bradykinin-fragment (1-7) (b) fremstillet med Thap under forskellige prøveplade temperaturer.. Rød og blå data indikerer prøven forberedt på prøve plade temperaturer på 25 og 5 ° C.g "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
| Prøveplade Temperatur (° C) | Prøve | Air Temperatur (° C) | Relativ fugtighed (RH%) | Tørretid (sek) |
| 5 | maltotriose med Thap | 20 ± 3 | <25 | 800 - 1.000 |
| bradykinin fragment (1-7) med Thap | ||||
| 25 | maltotriose med Thap | 25 ± 3 | 100-150 | |
| bradykinin fragment (1-7) med Thap |
Tabel 1: Eksperimentelle parametre og tørring betingelser under forskellige prøve plade temperaturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Baseret på tidligere teoretiske forudsigelser, kan temperatur-induceret hydrodynamiske strømme inden dråberne overvindes udad kapillære strømme induceret af opløsningsmiddelafdampning. Effektiviteten af en sådan intern recirkulation af molekyler forøges, når temperaturen gradienter inden en stigning dråbe. Ifølge de forudsagte resultater, når holde prøven plade temperatur under 5 ° C under opretholdelse dens omgivelser ved omgivelsestemperatur, den gennemsnitlige hastighed af recirkuleringsanlæg strømme inden dråben er omkring 4 gange hurtigere end for passiv kapillære strømme. Hvis prøven plade temperatur er den samme som omgivelserne, den gennemsnitlige hastighed af recirkuleringsanlæg strømme er 1.800 gange langsommere end den udadgående kapillær flow. Resultaterne af denne beregning viser, faldende prøveplade temperatur under prøvefremstilling er fordelagtig. De eksperimentelle observationer er enige i denne forudsigelse.
Prøven plade temperamentperaturen bør styres præcist under hele prøven forberedelsesprocessen. Tabel 1 viser den typiske tørretid dråber tid med 0,1 ul prøve under forskellige prøve plade temperaturer. Før deponering prøveopløsning på pladen, er det vigtigt at sikre, at prøven plade overfladen er tør. Hvis vandet kondens opstår, når forbereder prøver under lave temperaturer, er aflejring af prøveopløsningen ikke anbefales, da kondenseret vand forstørrer prøve områder og fortynder løsninger. Således er det vigtigt at holde den relative fugtighed af tørrekammeret under 25%. Hertil kommer, når forbereder prøver under lave temperaturer, bør prøven plade være varm op til stuetemperatur før det tages ud af tørrekammeret. Selv mindre kondensvand efter afslutning af prøven krystallisering ikke ændrer prøven befolkning, bør undgås betydelig kondens.
Anvendelsen af frisk forblandede løsninger er anbebødet. Når forblandede løsninger er udsat for luft, pre-krystallisationer af prøveopløsningerne forekomme, og den endelige krystalstørrelse og morfologi kan ændre sig. Derfor bør proceduren pipettering udføres med rimelig effektivitet, typisk inden for 10 sekunder, for at forhindre prøven dråbe fra præ-krystallisation inden pipettespidsen. Det anbefales at observere prøve morfologier under et mikroskop for at sikre passende krystalmorfologier produceres før massespektrometrianalyse. Hvis krystalmorfologier er ikke så god som forventet, gentage afsætningsprocessen som nødvendigt.
Ifølge vores teoretiske og eksperimentelle undersøgelser, forberedelse prøver med en lav temperatur prøve plade installeret under omgivende forhold i høj grad forbedrer data reproducerbarhed og kvalitet i MALDI-MS. Efterfølgende forsøg viser også betydelig forøgelse af signal intensitet med denne prøveforberedelse metode. De eksperimentelle data opnået ved thans metode væsentligt forbedre pålideligheden af MALDI massespektre til kvantitative analyser. I sammenligning med andre metoder, der involverer løsning sammensætning eller overfladevand ejendom ændringer, 8,16-18 skiftende tørring betingelse er enklere og mere generelt anvendelig for konventionelle prøver. Således kan de fleste massespektrometri brugere drage fordel af det i regelmæssige applikationer.
Forbedring MALDI signal homogenitet med faldende prøve plade temperatur er også effektiv for nogle andre populære matricer. For eksempel forbedrede α-cyclodextrin (α-CD) signal homogenitet med Thap og α-cyano-4-hydroxykanelsyre (CHCA) som matrix under lav temperatur prøve tørringsbetingelser er blevet rapporteret for nylig. 14 Ulempen med skiftende prøveplade temperatur er, at metoden er i øjeblikket uegnede til high-throughput analyse grund af den lange prøve tørretiden i lave temperaturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Detergent powder | Alconox | 242985 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Acetonitrile | Merck | 100003 | |
| 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) | Sigma-Aldrich | T64602 | |
| Bradykinin fragment (1-7) | Sigma-Aldrich | B1651 | |
| Maltotriose | Sigma-Aldrich | 47884 | |
| Pipette tips | Mettler Toledo | 17005091 | |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| Equipment | |||
| Milli-Q water purification system | Millipore | ZMQS6VFT1 | |
| Powder-free nitrile gloves | Microflex | SU-690 | |
| 600 ml beaker | Duran | 2110648 | |
| Ultrasonic cleaner | Delta | DC300H | |
| Hygrometer | Wisewind | 5330 | |
| Nitrogen gas flowmeter | Dwyer | RMA-6-SSV | |
| K-type thermocouples | Digitron | 311-1670 | |
| Centrifuge | Select BioProducts | Force Mini | |
| Pipette | Rainin | pipet-lite XLS | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Temperature controllable drying chamber | this lab | ||
| Synchronized dual-polarity time-of-flight imaging mass spectrometer (DP-TOF IMS) | this lab | ||
| MALDI-TOF stainless steel sample target | this lab |
References
- Karas, M., Hillenkamp, F. Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10000 Daltons. Anal. Chem. 60, 2299-2301 (1988).
- Beavis, R. C., Chait, B. T. Velocity Distributions of Intact High Mass Polypeptide Molecule Ions Produced by Matrix Assisted Laser Desorption. Chem. Phys. Lett. 181, 479-484 (1991).
- Beavis, R. C., Chaudhary, T., Chait, B. T. Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-Assisted Laser Desorption Mass-Spectrometry. Org. Mass Spectrom. 27, 156-158 (1992).
- Ehring, H., Karas, M., Hillenkamp, F. Role of Photoionization and Photochemistry in Ionization Processes of Organic-Molecules and Relevance for Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry. Org. Mass Spectrom. 27, 472-480 (1992).
- Strupat, K., Karas, M., Hillenkamp, F. 2,5-Dihydroxybenzoic Acid - a New Matrix for Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. Ion Process. 111, 89-102 (1991).
- Hu, H., Larson, R. G. Evaporation of a Sessile Droplet on a Substrate. J. Phys. Chem. B. 106, 1334-1344 (2002).
- Deegan, R. D., et al. Capillary Flow as the Cause of Ring Stains from Dried Liquid Drops. Nature. 389, 827-829 (1997).
- Hu, J. -B., Chen, Y. -C., Urban, P. L. Coffee-Ring Effects in Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chim. Acta. 766, 77-82 (2013).
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct Tissue Analysis Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry: Practical Aspects of Sample Preparation. J. Mass Spectrom. 38, 699-708 (2003).
- Hu, H., Larson, R. G. Marangoni Effect Reverses Coffee-Ring Depositions. J. Phys. Chem. B. 110, 7090-7094 (2006).
- Bhardwaj, R., Fang, X., Attinger, D. Pattern Formation During the Evaporation of a Colloidal Nanoliter Drop: A Numerical and Experimental Study. New J. Phys. 11, 075020 (2009).
- Savino, R., Paterna, D., Favaloro, N. Buoyancy and Marangoni Effects in an Evaporating Drop. J Thermophys Heat Tr. 16, 562-574 (2002).
- Probstein, R. F. Surface Tension. in Physicochemical Hydrodynamics : An Introduction. , John Wiley & Sons. Ch. 10 305-361 (1994).
- Lai, Y. -H., et al. Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27, 1314-1321 (2016).
- Hsiao, C. -H., et al. Comprehensive Molecular Imaging of Photolabile Surface Samples with Synchronized Dual-Polarity Time-of-Flight Mass Spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 25, 834-842 (2011).
- Vorm, O., Roepstorff, P., Mann, M. Improved Resolution and Very High-Sensitivity in MALDI TOF of Matrix Surfaces Made by Fast Evaporation. Anal. Chem. 66, 3281-3287 (1994).
- Gabriel, S. J., Schwarzinger, C., Schwarzinger, B., Panne, U., Weidner, S. M. Matrix Segregation as the Major Cause for Sample Inhomogeneity in MALDI Dried Droplet Spots. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25, 1356-1363 (2014).
- Mampallil, D., Eral, H. B., van den Ende, D., Mugele, F. Control of Evaporating Complex Fluids through Electrowetting. Soft Matter. 8, 10614-10617 (2012).
