Summary
إدارة المخدرات لاستعادة وظيفة الكلى تتطلب السيطرة على توطين وتوزيع مركب العلاجي. هنا، نحن تصف بالتفصيل تقنية بسيطة للتسليم ضمن الكلية المخدرات في الفئران. هذا الإجراء يمكن أداؤها بسهولة مع أي وفيات واستنساخ عالية.
Protocol
وأجريت التجارب على الفئران الإناث سبراغ داولي، وزنها 250-300 غرام. وقد وافق جميع الإجراءات الحيوانية تمتثل للمعايير المنصوص عليها في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (معهد الثروة الحيوانية مختبر، والأكاديمية الوطنية للعلوم في بيثيسدا، MD، الولايات المتحدة الأمريكية) والتي بمستشفى مايو كلينيك بكلية الطب المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC).
1. إعداد
- الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية قبل الجراحة. إذا تم التخطيط جراحات متعددة على الفئران مختلفة في نفس اليوم، وشطف الأدوات بعد كل إجراء الحيوان ومن ثم تعقيم باستخدام معقم حبة ساخنة.
- تخدير الفئران مع 4٪ الأيزوفلورين في 1 لتر / دقيقة O 2.
- نقل الفئران على وسادة التدفئة التي تسيطر عليها للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية. الحفاظ على التخدير مع 1-2٪ الأيزوفلورين في 1 لتر / دقيقة O 2.
- إدارة المخدرات مسكن (البوبرينورفين المستدام الإصدار 0.6 ملغ / كلغ) سوbcutaneously.
- تطبيق مرهم للعين لمنع جفاف أثناء العملية.
- من أجل التعويض عن فقدان سوائل الجسم بسبب البطن، فمن المهم لإدارة 10 مل / كغ من 0.9٪ محلول ملحي تحت الجلد قبل الجراحة.
- حلق منطقة البطن وتنظيف البشرة مع منصات الإيثانول اليود بوفيدون و 70٪.
2. إجراء العمليات الجراحية
- تأكد من أن عمق التخدير كاف من خلال مراقبة ردود الفعل الجسدية، مثل الانسحاب من قرصة اصبع القدم، منعكس الجفن، لهجة الفك، والتنفس معدل / النمط.
- إجراء عملية فتح البطن من خلال شق خط الوسط صغيرة (2-2.5 سم في الطول) باستخدام شفرة المشرط الجراحي رقم 10.
- سحب الأمعاء والقولون إلى الجانب الأيمن من البطن باستخدام قطعة قطن وتغطيتها بشاش معقم غارقة في لمحلول ملحي 0.9٪ للحفاظ على أجهزة رطبة.
- سحب بلطف صعودا والطحال والكبد والمعدة والبنكرياس لفضح منطقة المسؤوليةتا والشريان الكلوي الأيسر.
- بمساعدة الميكروسكوب الجراحي، بعناية فصل الشريان الأورطي البطني فوق وتحت الكلية اليسرى والشريان الكلوي الأيسر من الأوردة، والدهون والأنسجة المحيطة الضام مع تشريح منحني الملقط حادة وقطعة قطن معقمة.
- استخدام ملقط مع حركة (تشريح حادة) المتكررة مفتوحة قريبة على طول الأوعية لإزالة الأنسجة الضامة ومسحات القطن مع تحريك المتداول الجانبية لإزالة الدهون.
ملاحظة: تشريح المنطقة شبه الأبهري هي خطوة حساسة جدا كما الأعصاب والأوعية اللمفاوية قد يكون معطوبا. تأكد من أن تبقي الشرايين رطبة مع المياه المالحة أثناء إجراء تشريح.
- استخدام ملقط مع حركة (تشريح حادة) المتكررة مفتوحة قريبة على طول الأوعية لإزالة الأنسجة الضامة ومسحات القطن مع تحريك المتداول الجانبية لإزالة الدهون.
- وضع خياطة 4-0 الحرير تحت الشريان الأورطي.
- باستخدام لقطات الاوعية الدموية الدقيقة، المشبك الأبهر فوق (أقل بقليل من الشريان المساريقي العلوي) ودون التشعب الشريان الكلوي.
- ثقب الشريان الأورطي في مستوى kidn الأيسرالتشعب الشريان EY مع 24 G قسطرة وريدية وتقدم قسطرة في الشريان الكلوي.
ملاحظة: هذا هو خطوة حاسمة كما ثقب من خلال الشريان الكلوي قد يحدث. - توصيل حقنة مليئة محلول الدواء أو المالحة (ما يصل الى 500 ميكرولتر) إلى القسطرة ويروي الكلى.
- مباشرة بعد نضح، المشبك الوريد الكلوي الأيسر والحالب الأيسر مع مقطع الاوعية الدموية الدقيقة وإزالة القسطرة. ثم، ضع قطعة من امتصاص الاسفنجة مرقئ الجيلاتين، مع انخفاض طفيف لاصقة الأنسجة، وعلى المنطقة مثقوب يحتوى من الشريان الأورطي وتطبيق الضغط بلطف مع مسحة القطن.
- في نفس الوقت، والإفراج عن المشبك من الشريان الأورطي البطني، دون التشعب الشريان الكلوي الأيسر. بعد 5 دقائق، والإفراج عن المشبك من الوريد الكلوي والحالب.
- بعناية الافراج عن المشبك من الشريان الأورطي، فوق التشعب الشريان الكلوي الأيسر، والسماح لضخه في الكلى. مجموع نقص تروية الكلى يجب أن يستمر لا تزيد عن 7 دقائق.
- إغلاق شق البطن في طبقتين (العضلات والجلد)، وذلك باستخدام 4-0 الغرز للامتصاص ونمط مستمر لمنع العدوى. بالإضافة إلى تقنية خياطة نمط مستمر، وثمة خيار آخر يتمثل في استخدام بسيطة، تقنية انقطاع، وخاصة بالنسبة للجسم إغلاق الجدار لمنع تفزر.
- تطبيق مرهم مضاد حيوي موضعي على منطقة شق لمنع العدوى.
- نقل الفئران في قفص المراقبة خالية من الفراش على وسادة دافئة حتى الشفاء الكامل مع درجة حرارة تتراوح ضعت في 35-37 درجة مئوية. يجب تغطية الفراش فضفاضة (على سبيل المثال مع ثنى أو منشفة ورقية) أو إزالتها من القفص حتى يتم استرداد الحيوانات بشكل كامل لمنع الاختناق أو طموح الفراش.
- بعد الجراحة، ومراقبة الحيوانات باستمرار حتى التنفس من تلقاء أنفسهم، ثم كل ساعة لبضع ساعات. إعادة جرعة مسكن البوبرينورفين ريال 72 ساعةفي وقت لاحق إذا لاحظت علامات الانزعاج، مثل الخمول، منحنية وضيع، كشر، عدم استئناف الأنشطة العادية.
- بعد الانتهاء من جميع الدراسات والموت ببطء الحيوانات مع استنشاق جرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون 2 وحصاد أنسجة الكلى للخارج الحي تحلل مثل الأنسجة والغربية التنشيف 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن حقن جرعتين مختلفة من عامل نمو بطانة الاوعية المؤتلف الفئران (rrVEGF، 0.17 ميكروغرام / كغ و 5 ميكروغرام / كغ) أو برنامج تلفزيوني. الموت الرحيم كانت الحيوانات 8 ساعات بعد عملية جراحية لدراسة تفعيل المسار VEGF. وقال إن العملية الجراحية لن يؤثر على التشكل من الكلى perfused (الشكل 1A) بالمقارنة مع التحكم (الشكل 1B)، كما يتضح من H & E تلطيخ. في حين سيريوس تلطيخ الأحمر لم تظهر أي زيادة في ترسب مصفوفة خارج الخلية ردا على الوقت الدماغية وضخ rrVEGF (الشكل 1C) بالمقارنة مع التحكم (1D الشكل). من خلال تحليل الغربية وصمة عار، لاحظنا زيادة صغيرة ولكنها كبيرة في التعبير عن البروتينات المشاركة في مسار VEGF، مثل عامل نمو بطانة الاوعية، FLK1، PAKT / AKT، رفع معنوياته / إرك (الشكل 2).
د / 54418 / 54418fig1.jpg "/>
الشكل 1: صور التمثيلية للالنسيجي تلون الكلوي الأنسجة Hematoxilin ويوزين (H & E) تلطيخ أقسام الكلى لا يظهر أي تغيرات تشريحية في الفئران التي تلقت VEGF (5 ميكروغرام / كغ، B) بالمقارنة مع الحيوانات الشام (A) عن طريق الحقن ضمن الكلية. في حين، سيريوس تلطيخ الأحمر يظهر أي اختلافات كبيرة في ترسب الكولاجين في الفئران التي تلقت VEGF (5 ميكروغرام / كغ، D) بالمقارنة مع الحيوانات الشام (C). يمثل مقياس شريط 1 مم وتمثل الصور المكبرة 400 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تفعيل عامل نمو بطانة الاوعية المسار تحليل لطخة غربية من VEGF، FLK1، phosphoAKT / AKT وphosphoERK / إرك تبين upregulation من مسار VEGF بعد rrVEGF ضخ في الكلى (ن = 4). وتعرض البيانات كما يعني ± SEM. * ف <0.05 مقابل برنامج تلفزيوني. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويؤيد هذا العمل جزئيا من خلال منحة بحثية من شركة أسترا زينيكا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Microscope | Leica | M125 | |
| Isoflurane 100 ml | Cardinal Healthcare | PI23238 | Anesthetic |
| Buprenorphine HCL SR LAB 1 mg/ml, 5 ml | ZooPharm Pharmacy | Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hr duration of activity). Liquid is viscous, warming to RT aids in drawing into syringe. Recommended dosage: 1 - 1.2 mg/kg SC. DO NOT DILUTE. | |
| Puralube Vet Ophthalmic Ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | Sterile ocular lubricant |
| Lactated Ringer's Injection, USP, 250 ml VIAFLEX Plastic Container | Baxter Healthcare Corp. | NDC0338-0117-02 | For body fluids replacement |
| Sol Povidone-Iodine Swabstick, 3' | Cardinal Heatlhcare | 23405-010B | |
| Sterile cotton tipped applicators | Kendall | 8884541300 | |
| 4-0 silk suture (without needle) | Cardinal Heatlhcare | A183H | |
| Vessel Clip, Straight, 0.75 mm x 4 mm Jaw | World Precision Instruments | 501779-G | |
| I.V. Catheter, Straight Hub, Radiopaque, 24 g x 3/4", FEP Polymer | Jelco | 4053 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010023 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Cardinal Healthcare | 179082 | |
| 4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) VIOLET 27" RB-1 TAPER | Ethicon | VCP304H | For muscle layer suturing |
| 4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) UNDYED 18" PC-3 CUTTING | Ethicon | VCP845G | For skin layer suturing |
| Triple antibiotic ointment | Actavis | NDC0472-0179-56 | For topical use on the site of the incision |
| Recombinant Rat VEGF 164 Protein | R&D Sytems | 564-RV | |
| Rabbit monoclonal VEGFA | Abcam | ab46154 | |
| Rabbit monoclonal FLK1 | Cell Signaling | 9698 | |
| Rabbit monoclonal AKT | Cell Signaling | 4691 | |
| Rabbit monoclonal phosphoAKT (Ser 473) | Cell Signaling | 4060 | |
| Rabbit monoclonal p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell Signaling | 4695 | |
| Rabbit monoclonal phospho p44/42 MAPK (Thr202 and Tyr 204) | Cell Signaling | 4370 |
References
- Dejani, H., Eisen, T. D., Finkelstein, F. O. Revascularization of renal artery stenosis in patients with renal insufficiency. Am. J. Kidney Dis. 36 (4), 752-758 (2000).
- Kang, D. H., et al. Impaired angiogenesis in the remnant kidney model: I. Potential role of vascular endothelial growth factor and thrombospondin-1. J. Am. Soc. Nephrol. 12 (7), 1434-1447 (2001).
- Kang, D. H., Hughes, J., Mazzali, M., Schreiner, G. F., Johnson, R. J. Impaired angiogenesis in the remnant kidney model: II. Vascular endothelial growth factor administration reduces renal fibrosis and stabilizes renal function. J. Am. Soc. Nephrol. 12 (7), 1448-1457 (2001).
- Kang, D. H., et al. Role of the microvascular endothelium in progressive renal disease. J. Am. Soc. Nephrol. 13 (3), 806-816 (2002).
- Chade, A. R., Kelsen, S. Reversal of renal dysfunction by targeted administration of VEGF into the stenotic kidney: a novel potential therapeutic approach. Am. J. Physiol.- Renal Physiol. 302 (10), F1342-F1350 (2012).
- Eirin, A., et al. Changes in Glomerular Filtration Rate After Renal Revascularization Correlate With Microvascular Hemodynamics and Inflammation in Swine Renal Artery Stenosis. Circ.-Cardiovasc. Interv. 5 (5), 720-728 (2012).
- Chade, A. R. Distinct Renal Injury in Early Atherosclerosis and Renovascular Disease. Circulation. 106 (9), 1165-1171 (2002).
- Seddon, M., Saw, J. Atherosclerotic renal artery stenosis: review of pathophysiology, clinical trial evidence, and management strategies. Can. J. Cardiol. 27 (4), 468-480 (2011).
- Lao, D., Parasher, P. S., Cho, K. C., Yeghiazarians, Y. Atherosclerotic renal artery stenosis--diagnosis and treatment. Mayo Clin Proc. 86 (7), 649-657 (2011).
- Sharfuddin, A. A., Molitoris, B. A. Pathophysiology of ischemic acute kidney injury. Nat. Rev. Nephrol. 7, 189-200 (2011).
- Noiri, E., et al. Oxidative and nitrosative stress in acute renal ischemia. Am. J. Physiol.- Renal Physiol. 281 (5), F948-F957 (2001).
- Koesters, R., et al. Tubular Overexpression of Transforming Growth Factor-Î1 Induces Autophagy and Fibrosis but Not Mesenchymal Transition of Renal Epithelial Cells. Am. J. Pathol. 177 (2), 632-643 (2010).
- Shanley, P. F., Rosen, M. D., Brezis, M., Silva, P., Epstein, F. H., Rosen, S. Topography of focal proximal tubular necrosis after ischemia with reflow in the rat kidney. Am. J. Pathol. 122 (3), 462-468 (1986).
