Summary
Administrationen af lægemidler til inddrivelse af nyrefunktionen kræver kontrol af lokalisering og distribution af den terapeutiske forbindelse. Her beskriver vi i detaljer en simpel teknik til intrarenal afgivelse af lægemidler hos rotter. Denne procedure kan let udføres uden dødelighed og høj reproducerbarhed.
Protocol
Eksperimenterne blev udført på Sprague-Dawley hanrotter, der vejer 250-300 g. Alle dyreforsøg overholdt de standarder, der er anført i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr (Institute of Laboratory Animal Resources, National Academy of Sciences, Bethesda, MD, USA) og blev godkendt af Mayo Clinic College of Medicine Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC).
1. Fremstilling
- Autoklavér alle kirurgiske instrumenter før operation. Hvis flere operationer på forskellige rotter er planlagt i den samme dag, skylles instrumenterne efter hvert dyr procedure, og derefter sterilisere ved hjælp af en varm perle sterilisator.
- Anesthetize rotte med 4% isofluran i 1 L / min O 2.
- Overfør rotte til en styret varmepude til at bevare kropstemperaturen ved 37 ° C. Vedligehold anæstesi med 1-2% isofluran i en L / min O 2.
- Administrere analgetiske lægemiddel (Buprenorphin langvarig frigivelse 0,6 mg / kg) subcutaneously.
- Påfør salve til øjnene for at forhindre udtørring under proceduren.
- For at kompensere for tab af kropsvæsker grund laparotomi, er det vigtigt at administrere 10 ml / kg 0,9% normal saltopløsning subcutant præoperativt.
- Barber maveregionen og rense huden med povidon-jod og 70% ethanol pads.
2. Kirurgisk procedure
- Sørg for, at dybden af sedation er tilstrækkelig ved at overvåge fysiske reflekser, såsom tilbagetrækning fra tå knivspids, øjenlågsreflekser, kæbe tone, og respiration sats / mønster.
- Udfør en laparotomi gennem et lille midtlinjeincision (2-2,5 cm i længden) med en kirurgisk skalpel No. 10.
- Træk tarmen og colon til højre side af underlivet ved hjælp vatpinde og dække dem med steril gaze gennemvædet med til 0,9% normal saltopløsning for at opretholde organerne fugtig.
- Forsigtigt trække opad milten, lever, mave og bugspytkirtel at blotlægge AORta og den venstre nyre arterie.
- Ved hjælp af et kirurgisk mikroskop, omhyggeligt adskille den abdominale aorta over og under venstre nyre og den venstre renale arterie fra venerne, fedt og det omgivende bindevæv med stumpe Dissecting buede pincet og sterile vatpinde.
- Brug pincet med en gentagen åben-lukke bevægelse (stump dissektion) langs længden af fartøjer for at fjerne bindevævet og vatpinde med en lateral rullende bevægelse for at fjerne fedt.
BEMÆRK: dissektion af peri-aorta region er en meget delikat skridt som nerver og lymfekar kan være beskadiget. Sørg for at holde arterierne fugtig med saltvand under dissektion procedure.
- Brug pincet med en gentagen åben-lukke bevægelse (stump dissektion) langs længden af fartøjer for at fjerne bindevævet og vatpinde med en lateral rullende bevægelse for at fjerne fedt.
- Placer en 4-0 silke sutur under aorta.
- Brug af mikrovaskulære klemmer, klemme aorta ovenfor (lige under øvre mesenteriske arterie) og under den renale arterie bifurkation.
- Punktere aorta på niveau med den venstre kidney arterie bifurkation med en 24 G intravenøst kateter og fremføre kateteret i den renale arterie.
BEMÆRK: Dette er et afgørende skridt som punktering gennem renal arterie kan forekomme. - Tilslut en sprøjte fyldt med lægemiddelopløsningen eller saltvand (op til 500 pi) til kateteret og perfundere nyrerne.
- Umiddelbart efter perfusion, klemme venstre renale vene og den venstre ureter med en mikrovaskulær clips og fjerne kateteret. Derefter placere et stykke af absorberbar hæmostat gelatine svamp, med en lille dråbe klæbemiddel til væv, i det punkterede areal af aorta og tryk forsigtigt med en vatpind.
- Samtidig, frigive klemmen fra den abdominale aorta, under venstre nyrearterie bifurkation. Efter 5 min, frigøre klemmen fra renal vene og ureter.
- Slip forsigtigt klemmen fra aorta, over den venstre nyrearterie bifurkation, og giver mulighed for nyre reperfusion. Den samlede renal iskæmi bør ikke vare længere end 7 min.
- Luk abdominalt indsnit i to lag (muskel og hud), ved anvendelse af 4-0 absorberbare suturer og en kontinuerligt mønster for at forhindre infektion. Ud over den kontinuerligt mønster sutur teknik, ville en anden mulighed være at bruge en enkel, afbrudt teknik, især for kropsvæggen lukning for at forhindre opspringning.
- Påfør topisk antibiotisk salve over incisionen område for at forhindre infektioner.
- Overfør rotten i en strøelse-fri observation bur på en varm pude, indtil fuldstændig helbredelse med et temperaturområde indstillet til 35-37 ° C. Løs strøelse bør dækkes (f.eks med en drapere eller køkkenrulle) eller fjernes fra buret, indtil dyrene er fuldt tilbagebetalt at forhindre kvælning eller aspiration af strøelse.
- Efter operationen observere dyrene kontinuerligt, indtil vejrtrækning spontant, derefter hver time i et par timer. Re-dosere analgetiske Buprenorphin SR 72 timersenere, hvis der observeres tegn på ubehag, såsom sløvhed, krum og scruffy, grimasse, ikke genoptage normale aktiviteter.
- Efter afslutningen af alle undersøgelser, aflive dyr med inhalation af en overdosis af CO 2 og høste de renale væv til ex vivo analyser såsom histologi og vestlige Blotting fem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi injicerede to forskellige doser af rekombinant rotte-VEGF (rrVEGF, 0,17 ug / kg og 5 ug / kg) eller PBS. Dyrene blev aflivet 8 timer efter kirurgi for at undersøge aktiveringen af VEGF-vejen. Den kirurgiske procedure påvirkede ikke morfologien af den perfunderede nyre (figur 1A) sammenlignet med kontrol (figur 1B), som vist ved H & E farvning. Mens Sirius red farvning ikke viste nogen stigning i ekstracellulær matrix deposition som reaktion på den iskæmiske tid og infusionen af rrVEGF (figur 1C) sammenlignet med kontrol (figur 1D). Ved Western Blot-analyse, observerede vi en lille, men signifikant stigning i ekspressionen af proteiner involveret i VEGF-vejen, såsom VEGF, Flk1, Pakt / AKT, pERK / ERK (figur 2).
d / 54.418 / 54418fig1.jpg "/>
Figur 1:. Repræsentative Billeder af Histologisk Farvning af nyrevæv Hematoxilin og eosin (H & E) farvning af nyre sektioner viser ingen anatomiske forandringer hos rotter, der modtog VEGF (5 ug / kg, B) sammenlignet med sham dyr (A) via intrarenal injektion. Henviser, siriusrødt farvning viser ingen signifikante forskelle i kollagenaflejring i rotter, der modtog VEGF (5 ug / kg, D) sammenlignet med sham dyr (C). Skala søjle repræsenterer 1 mm og forstørrede billeder repræsenterer 400 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Aktivering af VEGF Pathway Western blot-analyse af VEGF, Flk1, phosphoAKT / AKT og phosphoERK / ERK viser opregulering af VEGF pathway efter rrVEGF infusion i nyren (n = 4). Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM. * P <0,05 vs. PBS. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette arbejde er delvist støttet af en forskningsbevilling fra Astra Zeneca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Microscope | Leica | M125 | |
| Isoflurane 100 ml | Cardinal Healthcare | PI23238 | Anesthetic |
| Buprenorphine HCL SR LAB 1 mg/ml, 5 ml | ZooPharm Pharmacy | Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hr duration of activity). Liquid is viscous, warming to RT aids in drawing into syringe. Recommended dosage: 1 - 1.2 mg/kg SC. DO NOT DILUTE. | |
| Puralube Vet Ophthalmic Ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | Sterile ocular lubricant |
| Lactated Ringer's Injection, USP, 250 ml VIAFLEX Plastic Container | Baxter Healthcare Corp. | NDC0338-0117-02 | For body fluids replacement |
| Sol Povidone-Iodine Swabstick, 3' | Cardinal Heatlhcare | 23405-010B | |
| Sterile cotton tipped applicators | Kendall | 8884541300 | |
| 4-0 silk suture (without needle) | Cardinal Heatlhcare | A183H | |
| Vessel Clip, Straight, 0.75 mm x 4 mm Jaw | World Precision Instruments | 501779-G | |
| I.V. Catheter, Straight Hub, Radiopaque, 24 g x 3/4", FEP Polymer | Jelco | 4053 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010023 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Cardinal Healthcare | 179082 | |
| 4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) VIOLET 27" RB-1 TAPER | Ethicon | VCP304H | For muscle layer suturing |
| 4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) UNDYED 18" PC-3 CUTTING | Ethicon | VCP845G | For skin layer suturing |
| Triple antibiotic ointment | Actavis | NDC0472-0179-56 | For topical use on the site of the incision |
| Recombinant Rat VEGF 164 Protein | R&D Sytems | 564-RV | |
| Rabbit monoclonal VEGFA | Abcam | ab46154 | |
| Rabbit monoclonal FLK1 | Cell Signaling | 9698 | |
| Rabbit monoclonal AKT | Cell Signaling | 4691 | |
| Rabbit monoclonal phosphoAKT (Ser 473) | Cell Signaling | 4060 | |
| Rabbit monoclonal p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell Signaling | 4695 | |
| Rabbit monoclonal phospho p44/42 MAPK (Thr202 and Tyr 204) | Cell Signaling | 4370 |
References
- Dejani, H., Eisen, T. D., Finkelstein, F. O. Revascularization of renal artery stenosis in patients with renal insufficiency. Am. J. Kidney Dis. 36 (4), 752-758 (2000).
- Kang, D. H., et al. Impaired angiogenesis in the remnant kidney model: I. Potential role of vascular endothelial growth factor and thrombospondin-1. J. Am. Soc. Nephrol. 12 (7), 1434-1447 (2001).
- Kang, D. H., Hughes, J., Mazzali, M., Schreiner, G. F., Johnson, R. J. Impaired angiogenesis in the remnant kidney model: II. Vascular endothelial growth factor administration reduces renal fibrosis and stabilizes renal function. J. Am. Soc. Nephrol. 12 (7), 1448-1457 (2001).
- Kang, D. H., et al. Role of the microvascular endothelium in progressive renal disease. J. Am. Soc. Nephrol. 13 (3), 806-816 (2002).
- Chade, A. R., Kelsen, S. Reversal of renal dysfunction by targeted administration of VEGF into the stenotic kidney: a novel potential therapeutic approach. Am. J. Physiol.- Renal Physiol. 302 (10), F1342-F1350 (2012).
- Eirin, A., et al. Changes in Glomerular Filtration Rate After Renal Revascularization Correlate With Microvascular Hemodynamics and Inflammation in Swine Renal Artery Stenosis. Circ.-Cardiovasc. Interv. 5 (5), 720-728 (2012).
- Chade, A. R. Distinct Renal Injury in Early Atherosclerosis and Renovascular Disease. Circulation. 106 (9), 1165-1171 (2002).
- Seddon, M., Saw, J. Atherosclerotic renal artery stenosis: review of pathophysiology, clinical trial evidence, and management strategies. Can. J. Cardiol. 27 (4), 468-480 (2011).
- Lao, D., Parasher, P. S., Cho, K. C., Yeghiazarians, Y. Atherosclerotic renal artery stenosis--diagnosis and treatment. Mayo Clin Proc. 86 (7), 649-657 (2011).
- Sharfuddin, A. A., Molitoris, B. A. Pathophysiology of ischemic acute kidney injury. Nat. Rev. Nephrol. 7, 189-200 (2011).
- Noiri, E., et al. Oxidative and nitrosative stress in acute renal ischemia. Am. J. Physiol.- Renal Physiol. 281 (5), F948-F957 (2001).
- Koesters, R., et al. Tubular Overexpression of Transforming Growth Factor-Î1 Induces Autophagy and Fibrosis but Not Mesenchymal Transition of Renal Epithelial Cells. Am. J. Pathol. 177 (2), 632-643 (2010).
- Shanley, P. F., Rosen, M. D., Brezis, M., Silva, P., Epstein, F. H., Rosen, S. Topography of focal proximal tubular necrosis after ischemia with reflow in the rat kidney. Am. J. Pathol. 122 (3), 462-468 (1986).
