Summary
L'administration de médicaments pour la récupération de la fonction rénale nécessite un contrôle de la localisation et la distribution du composé thérapeutique. Ici, nous décrivons en détail une technique simple pour la livraison intrarenal de médicaments chez les rats. Cette procédure peut être facilement réalisée sans la mortalité et une reproductibilité élevée.
Protocol
Les expériences ont été réalisées sur des rats Sprague-Dawley femelles, pesant 250 à 300 g. Toutes les procédures d'animaux conformes aux normes énoncées dans le Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire (Institut de laboratoire Ressources Animales, National Academy of Sciences, Bethesda, MD, USA) et ont été approuvés par la Mayo Clinic College of Medicine Institutional Animal Care et l'utilisation commission (IACUC).
1. Préparation
- Autoclave tous les instruments chirurgicaux avant la chirurgie. Si de multiples interventions chirurgicales sur différents rats sont prévus dans la même journée, rincer les instruments après chaque procédure d'animal, puis stériliser à l'aide d'un stérilisateur à billes chaud.
- Anesthetize le rat avec 4% d' isoflurane dans 1 L / min O 2.
- Transférez le rat à un coussin chauffant contrôlé pour préserver la température du corps à 37 ° C. Maintenir l' anesthésie avec 1-2% d' isoflurane dans 1 L / min O 2.
- Administrer le médicament analgésique (buprénorphine à libération prolongée de 0,6 mg / kg) subcutaneously.
- Appliquer une pommade pour les yeux pour éviter le dessèchement pendant la procédure.
- Afin de compenser la perte de fluides corporels dus à la laparotomie, il est important d'administrer 10 ml / kg de 0,9% de solution saline normale sous-cutanée préopératoire.
- Rasez la zone abdominale et nettoyer la peau avec des tampons d'éthanol povidone-iode et 70%.
2. Procédure chirurgicale
- Assurez-vous que la profondeur de la sédation est adéquate en contrôlant les réflexes physiques, telles que le retrait de pincement de l'orteil, réflexe palpébral, de la mâchoire ton, et la fréquence respiratoire / pattern.
- Effectuer une laparotomie à travers une petite incision médiane (2-2,5 cm de longueur) à l'aide d'une lame scalpel n ° 10.
- Tirez l'intestin et du côlon sur le côté droit de l'abdomen à l'aide de tampons de coton et les couvrir avec de la gaze stérile trempée dans 0,9% de solution saline normale pour maintenir les organes humide.
- rétracter doucement vers le haut de la rate, du foie, de l'estomac et du pancréas pour exposer le aorta et l'artère rénale gauche.
- Avec l'aide d'un microscope chirurgical, séparer soigneusement l'aorte abdominale au-dessus et en dessous du rein gauche et l'artère rénale gauche dans les veines, la graisse et le tissu conjonctif entourant de dissection courbe pince émoussée et des cotons-tiges stériles.
- Utilisez la pince avec un mouvement (dissection) d'ouverture-fermeture répétée le long de la longueur des navires pour enlever le tissu conjonctif et les tampons de coton avec un mouvement de roulis latéral pour enlever la graisse.
NOTE: La dissection de la région péri-aortique est une étape très délicate que les nerfs et les vaisseaux lymphatiques pourraient être endommagés. Assurez-vous de garder les artères humide avec une solution saline pendant la procédure de dissection.
- Utilisez la pince avec un mouvement (dissection) d'ouverture-fermeture répétée le long de la longueur des navires pour enlever le tissu conjonctif et les tampons de coton avec un mouvement de roulis latéral pour enlever la graisse.
- Placer une suture 4-0 en soie sous l'aorte.
- Au moyen de clips microvasculaires, serrer l'aorte au-dessus (juste en dessous de l'artère mésentérique supérieure) et au-dessous de la bifurcation de l'artère rénale.
- Piquer l'aorte au niveau de l'KIDN gauchebifurcation de l'artère ey avec un cathéter intraveineux G 24 et de faire avancer le cathéter dans l'artère rénale.
REMARQUE: ceci est une étape critique que la ponction à travers l'artère rénale peut se produire. - Connecter une seringue remplie de la solution médicamenteuse ou de sérum physiologique (jusqu'à 500 ul) au cathéter et perfuser le rein.
- Immédiatement après la perfusion, serrer la veine rénale gauche et l'uretère gauche avec un clip microvasculaire et retirer le cathéter. Ensuite, placez un morceau de absorbable hémostatique éponge de gélatine, avec une petite goutte de colle de tissu, sur la zone poinçonnée de l'aorte et appliquer doucement la pression avec un coton-tige.
- Dans le même temps, relâcher le serrage de l'aorte abdominale, au-dessous de la bifurcation de l'artère rénale gauche. Après 5 min, relâchez la pince de la veine rénale et de l'uretère.
- Relâcher doucement la pince de l'aorte, au-dessus de la bifurcation de l'artère rénale gauche, et permettre rénale reperfusion. L'ischémie rénale totale ne devrait pas durer plus de 7 min.
- Fermer l'incision abdominale en deux couches (muscles et de la peau), en utilisant 4-0 sutures absorbables et un motif continu pour prévenir l'infection. En plus de la technique continue motif de suture, une autre option serait d'utiliser une technique simple, interrompue, en particulier pour la paroi de fermeture du corps pour empêcher la déhiscence.
- Appliquer une pommade antibiotique topique sur la zone d'incision pour prévenir les infections.
- Transférez le rat dans une cage d'observation libre de la literie sur un tampon chaud jusqu'à ce que la récupération complète avec une plage de température réglée à 35-37 ° C. Literie en vrac doivent être couverts (par exemple avec un drap ou une serviette en papier) ou retiré de la cage jusqu'à ce que les animaux sont complètement rétablis pour prévenir la suffocation ou l' aspiration de la literie.
- Après la chirurgie, observer les animaux en continu jusqu'à ce que la respiration spontanée, puis toutes les heures pendant quelques heures. Re-dose analgésique buprénorphine SR 72 hplus tard si des signes d'inconfort sont observés, tels que la léthargie, voûté et débraillé, grimace, ne pas reprendre ses activités normales.
- Après l' achèvement de toutes les études, euthanasier les animaux à l'inhalation d'une overdose de CO 2 et de récolter les tissus rénaux ex vivo pour des analyses telles que l' histologie et Western blot 5.
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Representative Results
Nous avons injecté deux doses différentes de VEGF recombinant de rat (rrVEGF, 0,17 pg / kg et 5 mg / kg) ou du PBS. Les animaux ont été euthanasiés à 8 heures après l'intervention chirurgicale pour examiner l'activation de la voie VEGF. La procédure chirurgicale n'a pas modifié la morphologie du rein perfusé (figure 1A) par rapport au contrôle (figure 1B), comme représenté par coloration H & E. Alors que Sirius coloration rouge n'a pas montré d'augmentation du dépôt de matrice extracellulaire en réponse à la période d' ischémie et de l'infusion de la rrVEGF (figure 1C) par rapport au contrôle (figure 1D). Par analyse Western Blot, on a observé une petite mais significative augmentation de l'expression de protéines impliquées dans la voie du VEGF, tels que le VEGF, Flk1, pAKT / AKT, pERK / ERK (figure 2).
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Figure 1:. Images représentatives anatomopathologique Staining of Renal tissu hématoxyline et de l' éosine (H & E) , la coloration des coupes de rein ne montre aucun changement anatomique chez les rats ayant reçu du VEGF (5 ug / kg, B) par rapport aux animaux fictifs (A) via une injection intra - rénal. Considérant que, sirius coloration rouge montre aucune différence significative dans le dépôt de collagène chez les rats qui ont reçu VEGF (5 ug / kg, D) par rapport aux animaux sham (C). La barre d'échelle représente 1 mm et images agrandies représentent 400 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. L' activation du VEGF Pathway analyse Western Blot de VEGF, Flk1, phosphoAKT / AKT et phosphoERK / ERK montrant la régulation positive de la voie du VEGF après la perfusion rrVEGF dans le rein (n = 4). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. * P <0,05 par rapport au PBS. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Disclosures
Ce travail est en partie financé par une subvention de Astra Zeneca de recherche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Microscope | Leica | M125 | |
| Isoflurane 100 ml | Cardinal Healthcare | PI23238 | Anesthetic |
| Buprenorphine HCL SR LAB 1 mg/ml, 5 ml | ZooPharm Pharmacy | Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hr duration of activity). Liquid is viscous, warming to RT aids in drawing into syringe. Recommended dosage: 1 - 1.2 mg/kg SC. DO NOT DILUTE. | |
| Puralube Vet Ophthalmic Ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | Sterile ocular lubricant |
| Lactated Ringer's Injection, USP, 250 ml VIAFLEX Plastic Container | Baxter Healthcare Corp. | NDC0338-0117-02 | For body fluids replacement |
| Sol Povidone-Iodine Swabstick, 3' | Cardinal Heatlhcare | 23405-010B | |
| Sterile cotton tipped applicators | Kendall | 8884541300 | |
| 4-0 silk suture (without needle) | Cardinal Heatlhcare | A183H | |
| Vessel Clip, Straight, 0.75 mm x 4 mm Jaw | World Precision Instruments | 501779-G | |
| I.V. Catheter, Straight Hub, Radiopaque, 24 g x 3/4", FEP Polymer | Jelco | 4053 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010023 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Cardinal Healthcare | 179082 | |
| 4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) VIOLET 27" RB-1 TAPER | Ethicon | VCP304H | For muscle layer suturing |
| 4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) UNDYED 18" PC-3 CUTTING | Ethicon | VCP845G | For skin layer suturing |
| Triple antibiotic ointment | Actavis | NDC0472-0179-56 | For topical use on the site of the incision |
| Recombinant Rat VEGF 164 Protein | R&D Sytems | 564-RV | |
| Rabbit monoclonal VEGFA | Abcam | ab46154 | |
| Rabbit monoclonal FLK1 | Cell Signaling | 9698 | |
| Rabbit monoclonal AKT | Cell Signaling | 4691 | |
| Rabbit monoclonal phosphoAKT (Ser 473) | Cell Signaling | 4060 | |
| Rabbit monoclonal p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell Signaling | 4695 | |
| Rabbit monoclonal phospho p44/42 MAPK (Thr202 and Tyr 204) | Cell Signaling | 4370 |
References
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