Summary
신장 기능의 회복을위한 약물의 투여는 현지화 및 치료 화합물의 분포 컨트롤이 필요합니다. 여기, 우리는 구체적으로 쥐에 약물의 신장 내 전달을위한 간단한 방법을 설명합니다. 이 절차는 쉽고없이 사망률과 높은 재현성으로 수행 될 수있다.
Protocol
실험은 250-300g 무게 암컷 흰쥐에서 수행 하였다. 실험실 동물의 관리 및 사용 (실험 동물 자원 연구소, 과학의 국립 아카데미, 베데스다, MD, USA)와 대한 설명서에 명시된 기준을 준수 모든 동물의 절차는 의학 기관 동물 관리의 메이요 클리닉 대학에 의해 승인되었다 및 사용위원회 (IACUC).
1. 준비
- 수술 전에 수술 도구를 압력솥. 다른 쥐의 여러 수술이 같은 날에 계획하는 경우, 각 동물 절차 후 악기를 세척하고 뜨거운 비드 살균기를 사용하여 소독.
- 1 L / 분 O 2에서 4 % 이소 플루 란과 쥐를 마취.
- 37 ° C의 체온을 유지하기 위해 조절 된 가열 패드로 쥐를 옮긴다. 1 L / 분 O 2에 1 ~ 2 %의 이소 플루 란으로 마취를 유지한다.
- 진통 약물 (부 프레 놀핀 릴리스 0.6 ㎎ / ㎏을 지속) 스와 관리bcutaneously.
- 절차를 수행하는 동안 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다.
- 개복에 의한 체액 손실을 보상하기 위해, 수술 전에 0.9 % 생리 식염수를 피하에 10 ㎖ / kg을 투여하는 것이 중요하다.
- 복부 영역을 면도하고 포비돈 - 요오드 및 70 % 에탄올 패드로 피부를 청소하십시오.
2. 수술
- 진정의 깊이는 발가락 핀치에서 철수, 눈꺼풀 반사, 턱 톤, 호흡 속도 / 패턴으로 물리적 반사 신경을 모니터링하여 적절한 지 확인합니다.
- 수술 용 메스 블레이드 10 호를 사용하여 작은 중간 선 절개를 통해 개복술 (길이 2-2.5 cm)를 수행합니다.
- 면봉을 사용하여 복부의 오른쪽에 소장과 대장을 당겨 기관 촉촉한 유지하기 위해 0.9 % 생리 식염수에 적신 멸균 거즈로 커버.
- 조심스럽게 AOR을 노출 위쪽으로 비장, 간, 위장과 췌장을 철회타 왼쪽 신장 동맥.
- 수술 현미경의 도움으로 조심스럽게 위 왼쪽 신장과 혈관, 지방에서 왼쪽 신장 동맥과 무딘 해부 곡선 집게와 멸균 면봉와 주변의 결합 조직 아래 복부 대동맥을 분리합니다.
- 지방을 제거하는 측면 회전 운동과 결합 조직과 면봉을 제거하기 위해 선박의 길이를 따라 반복 개폐 동작 (무딘 절개)와 집게를 사용합니다.
참고 : 요정 대동맥 영역의 절개가 손상 될 수 있습니다 신경과 림프관으로 매우 민감한 단계입니다. 해부 과정에서 식염수로 촉촉한 동맥을 유지해야합니다.
- 지방을 제거하는 측면 회전 운동과 결합 조직과 면봉을 제거하기 위해 선박의 길이를 따라 반복 개폐 동작 (무딘 절개)와 집게를 사용합니다.
- 대동맥 아래 4-0 실크 봉합사를 놓습니다.
- 미세 혈관 클립을 사용하여, (그냥 장간막 동맥 이하) 및 신장 동맥 분기 아래에 위의 대동맥 클램프.
- 왼쪽 kidn 수준에서 대동맥 천공24 G 정맥 카테터와 EY 동맥 분기 및 신장 동맥에 카테터를 진행합니다.
참고 :이 발생할 수 있습니다 신장 동맥을 통해 천자 등이 중요한 단계이다. - 카테터에 약액 또는 (500 μL까지) 식염수로 채워진 주사기를 연결하고 신장 관류.
- 즉시 관류 후, 미세 혈관 클립 왼쪽 신장 정맥 왼쪽 요관을 고정하고 카테터를 제거합니다. 이어서, 대동맥 천공 영역에, 조직 접착제의 작은 방울, 흡수성 지혈제 젤라틴 스폰지 조각을 넣고 부드럽게 면봉으로 압력을 적용한다.
- 동시에, 좌측 신장 동맥의 분기점 아래 복부 대동맥으로부터 클램프 해제. 5 분 후, 신장 혈관 및 요관에서 클램프를 놓습니다.
- 조심스럽게 왼쪽 신장 동맥 분기 이상, 대동맥에서 클램프를 분리 한 신장 재관류를 허용합니다. 총 신 허혈은 7 분보다 더 오래 지속 없습니다.
- 감염을 예방하기 위해 4-0 흡수성 봉합사 및 연속적인 패턴을 사용하여, 두 개의 층 (근육과 피부)의 복부 절개를 닫는다. 연속 패턴 봉합 기술에 더하여, 또 다른 옵션은 열개 않도록 특히 체벽 폐쇄위한 간단한 인터럽트 기술을 사용하는 것이다.
- 감염을 방지하기 위해 절개 영역에 국소 항생제 연고를 적용합니다.
- 35-37 ° C에서 설정된 온도 범위 전체 복구 될 때까지 따뜻한 패드에 침구없는 관찰 케이지에 쥐를 전송합니다. 느슨한 침구 커버 (예 : 드레이프 또는 종이 수건)이나 동물이 완전히 질식 또는 침구의 구토물이기도를 막는 것을 방지하기 위해 복구 될 때까지 케이지에서 제거해야합니다.
- 수술 후 몇 시간 동안 매 시간 후, 자발적으로 호흡 할 때까지 지속적으로 동물을 관찰한다. 진통 부 프레 놀핀 SR 72 시간을 다시 투여 량나중에 불편의 흔적은 같은 웅크 리고 앉게하고 초라한 혼수, 얼굴을 찡 그리기, 정상적인 활동을 재개하지으로 관찰하는 경우.
- 모든 연구 종료 후, CO 2의 과다 복용의 흡입과 동물을 안락사와 생체의 신장 조직은 조직 학적 및 웨스턴 블로 팅 (5)로 분석 수확.
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Representative Results
우리는 재조합 쥐 VEGF (rrVEGF, 0.17 μg의 / kg, 5 μg의 / kg) 또는 PBS의 두 가지 용량을 주입. 동물은 VEGF 경로의 활성을 검사 8 시간 포스트 수술을 안락사시켰다. H & E 염색으로 도시 된 바와 같이, 제어부 (도 1b)에 비해 수술은 관류 신장 (도 1a)의 형태에 영향을 미치지 않았다. 제어 (그림 1D)에 비해 시리우스 레드 염색은 허혈 시간과 rrVEGF (그림 1C)의 주입에 응답하여 세포 외 기질 침착의 증가를 보여주지 않았지만. 웨스턴 블롯 분석에 의해, 우리는 VEGF, FLK1, PAKT / AKT, 특권 / ERK (그림 2)와 VEGF 경로에 관여하는 단백질의 발현에 작지만 의미있는 증가를 관찰했다.
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그림 1 :. 조직 학적 신장 조직 Hematoxilin의 염색 및 에오신의 대표 이미지는 신장 섹션 (H & E) 염색은 신장 내 주입을 통해 가짜 동물 (A)에 비해 (5 μg의 / kg, B) VEGF를받은 쥐에서 더 해부학 적 변화를 보여줍니다. 시리우스 붉은 얼룩은 가짜 동물 (C)에 비해 (5 μg의 / kg, D) VEGF를받은 쥐에서 콜라겐 침착에 유의 한 차이를 보여줍니다 반면. 스케일 바는 1mm를 나타내고 확대 이미지는 400 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. VEGF 통로의 활성화 VEGF의 웨스턴 블롯 분석, FLK1, phosphoAK신장에서 rrVEGF 주입 후 VEGF 경로의 상향 조절을 나타내는 T / AKT 및 phosphoERK / ERK (N = 4). 데이터는 SEM ± 평균으로 표시하고 있습니다. * P <PBS 대 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Disclosures
이 작품은 부분적으로 아스트라 제네카로부터 연구비에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Microscope | Leica | M125 | |
| Isoflurane 100 ml | Cardinal Healthcare | PI23238 | Anesthetic |
| Buprenorphine HCL SR LAB 1 mg/ml, 5 ml | ZooPharm Pharmacy | Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hr duration of activity). Liquid is viscous, warming to RT aids in drawing into syringe. Recommended dosage: 1 - 1.2 mg/kg SC. DO NOT DILUTE. | |
| Puralube Vet Ophthalmic Ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | Sterile ocular lubricant |
| Lactated Ringer's Injection, USP, 250 ml VIAFLEX Plastic Container | Baxter Healthcare Corp. | NDC0338-0117-02 | For body fluids replacement |
| Sol Povidone-Iodine Swabstick, 3' | Cardinal Heatlhcare | 23405-010B | |
| Sterile cotton tipped applicators | Kendall | 8884541300 | |
| 4-0 silk suture (without needle) | Cardinal Heatlhcare | A183H | |
| Vessel Clip, Straight, 0.75 mm x 4 mm Jaw | World Precision Instruments | 501779-G | |
| I.V. Catheter, Straight Hub, Radiopaque, 24 g x 3/4", FEP Polymer | Jelco | 4053 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010023 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Cardinal Healthcare | 179082 | |
| 4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) VIOLET 27" RB-1 TAPER | Ethicon | VCP304H | For muscle layer suturing |
| 4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) UNDYED 18" PC-3 CUTTING | Ethicon | VCP845G | For skin layer suturing |
| Triple antibiotic ointment | Actavis | NDC0472-0179-56 | For topical use on the site of the incision |
| Recombinant Rat VEGF 164 Protein | R&D Sytems | 564-RV | |
| Rabbit monoclonal VEGFA | Abcam | ab46154 | |
| Rabbit monoclonal FLK1 | Cell Signaling | 9698 | |
| Rabbit monoclonal AKT | Cell Signaling | 4691 | |
| Rabbit monoclonal phosphoAKT (Ser 473) | Cell Signaling | 4060 | |
| Rabbit monoclonal p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell Signaling | 4695 | |
| Rabbit monoclonal phospho p44/42 MAPK (Thr202 and Tyr 204) | Cell Signaling | 4370 |
References
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