Summary
Administrering av medikamenter for gjenvinning av nyrefunksjon krever kontroll av lokalisering og fordeling av den terapeutiske forbindelse. Her beskriver vi i detalj en enkel teknikk for intrarenal levering av legemidler i rotter. Denne fremgangsmåten kan lett utføres uten noen dødelighet og høy reproduserbarhet.
Protocol
Forsøkene ble utført på hunnrotter Sprague-Dawley som veide 250-300 g. Alle dyr prosedyrer oppfylt standardene nevnt i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr (Institute of Laboratory Animal Resources, National Academy of Sciences, Bethesda, MD, USA) og ble godkjent av Mayo Clinic College of Medicine Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).
1. Forberedelse
- Autoklav alle kirurgiske instrumenter før operasjonen. Hvis flere operasjoner på ulike rotter er planlagt på samme dag, skyll instrumenter etter hvert dyr prosedyre og deretter sterilisere ved hjelp av en varm perle sterilisator.
- Anesthetize rotte med 4% isofluran i en L / min O 2.
- Overfør rotte til en regulert varmepute for å bevare kroppstemperaturen ved 37 ° C. Opprettholde anestesi med 1-2% isofluran i en L / min O 2.
- Administrere smertestillende medikament (Buprenorfin Vedvarende Slipp 0,6 mg / kg) subcutaneously.
- Påfør salve til øynene for å hindre uttørking under prosedyren.
- For å kompensere for tap av kroppsvæsker som følge av laparotomi, er det viktig å administrere 10 ml / kg av 0,9% normalt saltvann subkutant preoperativt.
- Barbere mageområdet og rens huden med povidonjodid og 70% etanol pads.
2. Kirurgisk prosedyre
- Sørg for at dybden av sedasjon er tilstrekkelig ved å overvåke fysiske reflekser, for eksempel tilbaketrekning fra tå klype, palpebrale refleks, kjeve tone, og respirasjonsfrekvens / mønster.
- Utføre en laparotomi ved en liten midtlinje innsnitt (2-2,5 cm i lengde) under anvendelse av en kirurgisk skalpell blad No. 10.
- Trekk tarmen og tykktarmen til høyre side av abdomen ved hjelp av bomullspinner og dekke dem med sterilt gasbind fuktet i 0,9% normal saltoppløsning for å opprettholde organene fuktig.
- Forsiktig trekke oppover milt, lever, mage og bukspyttkjertel å eksponere aorTA og den venstre nyre-arterien.
- Med hjelp av en kirurgisk mikroskop, forsiktig skille den abdominale aorta over og under den venstre nyre og den venstre nyrearterien fra venene, fett og det omgivende bindevev med butt dissecting buet pinsett og sterilt bomullspinner.
- Bruk tang med en gjentatt åpne-lukke bevegelse (stump disseksjon) langs lengden av fartøyene for å fjerne bindevevet og de bomullspinner med en lateral rullende bevegelse for å fjerne fettet.
MERK: disseksjon av peri-aorta-regionen er en svært delikat skritt som nerver og lymfekar kan være skadet. Sørg for å holde blodårene fuktig med saltvann under disseksjon prosedyren.
- Bruk tang med en gjentatt åpne-lukke bevegelse (stump disseksjon) langs lengden av fartøyene for å fjerne bindevevet og de bomullspinner med en lateral rullende bevegelse for å fjerne fettet.
- Plasser en 4-0 silke sutur under aorta.
- Ved hjelp av mikrovaskulære klipp, klemme aorta ovenfor (like under den overlegne mesenteric arterie) og under nyrearterien delinger.
- Punktere aorta ved nivået av den venstre kidney arterie delinger med en 24 G venekateter, og videre kateteret inn i nyrearterien.
MERK: Dette er et kritisk punkt som punktering gjennom nyrearterien kan forekomme. - Koble en sprøyte fylt med medikamentløsningen eller saltløsning (opp til 500 ul) til kateteret og perfuse nyrene.
- Umiddelbart etter perfusjon, klemme venstre nyrevene og venstre ureter med en mikrovaskulær klipp og fjerne kateteret. Deretter plasserer et stykke absorberbare pinsetten gelatin svamp, med en liten dråpe av vev lim, over punktert område av aorta og press forsiktig med en bomullspinne.
- På samme tid, løsne klemmen fra den abdominale aorta, under den venstre nyrearterien bifurkasjon. Etter 5 min, slipper klemmen fra nyrevenen og ureter.
- slipper forsiktig klemmen fra aorta, over venstre nyrearterien delinger, og gir mulighet for nyre reperfusjon. Den totale nedsatt iskemi bør vare lenger enn 7 min.
- Lukker abdominal innsnitt i to lag (muskel og hud), ved hjelp av 4-0 absorberbare suturer og et kontinuerlig mønster for å forhindre infeksjon. I tillegg til den løpende mønster sutur teknikk, ville et annet alternativ være å bruke en enkel, avbrutt teknikk, spesielt for kroppsveggen lukking for å forhindre dehiscence.
- Påfør aktuell antibiotika salve over snittet området for å hindre infeksjoner.
- Overfør rotte i ei seng fritt observasjon bur på en varm pad til fullstendig gjenoppretting med et temperaturområde innstilt på 35-37 ° C. Loose sengetøy bør være dekket (for eksempel med en drapere eller papir håndkle) eller fjernes fra buret til dyr er helt frisk for å hindre kvelning eller aspirasjon av sengetøy.
- Etter operasjonen, observere dyrene kontinuerlig til å puste spontant, deretter hver time i noen timer. Re-dose smertestillende Buprenorfin SR 72 timersenere hvis tegn på ubehag er observert, slik som apati, krum og scruffy, grimase, ikke gjenoppta normale aktiviteter.
- Etter ferdigstillelse av alle studier, avlive dyr med inhalasjon av en overdose av CO 2 og høste nyrevevet, for ex vivo analyser som histologi og Western blotting fem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi injisert to forskjellige doser av rekombinant rotte-VEGF (rrVEGF, 0,17 ug / kg og 5 ug / kg) eller PBS. Dyrene ble avlivet 8 timer etter kirurgi for å undersøke aktivering av VEGF pathway. Den kirurgiske prosedyren ikke påvirke morfologien til perfusert nyre (figur 1 A) sammenlignet med kontroll (figur 1B), som vist ved H & E farging. Mens Sirius rød farging ikke viser noen økning i ekstracellulær matriks deponering i respons til den iskemiske og tid infusjonen av det rrVEGF (figur 1C) sammenlignet med kontroll (figur 1D). Ved Western blot-analyse, ble det observert en liten, men signifikant økning i ekspresjonen av proteiner involvert i den VEGF-reaksjonsveien, slik som VEGF, FLK1, pakt / AKT, Perk / ERK (figur 2).
d / 54418 / 54418fig1.jpg "/>
Figur 1:. Representative Bilder av Histologisk Farging av nyrevev hematoksylin og eosin (H & E) farging av nyre seksjoner viser ingen anatomiske forandringer hos rotter som fikk VEGF (5 mikrogram / kg, B) sammenlignet med narre dyr (A) via intrarenal injeksjon. Mens sirius røde flekker viser ingen signifikante forskjeller i kollagen deponering i rotter som fikk VEGF (5 mikrogram / kg, D) sammenlignet med narre dyr (C). Scale bar representerer en mm og forstørret bildene representerer 400 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 2: Aktivering av VEGF hovedbane Western Blot analyse av VEGF, FLK1, phosphoAKT / AKT og phosphoERK / ERK viser oppregulering av VEGF veien etter rrVEGF infusjon i nyrene (n = 4). Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. * P <0,05 vs. PBS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette arbeidet er delvis støttet av en forskningsstipend fra Astra Zeneca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Microscope | Leica | M125 | |
| Isoflurane 100 ml | Cardinal Healthcare | PI23238 | Anesthetic |
| Buprenorphine HCL SR LAB 1 mg/ml, 5 ml | ZooPharm Pharmacy | Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hr duration of activity). Liquid is viscous, warming to RT aids in drawing into syringe. Recommended dosage: 1 - 1.2 mg/kg SC. DO NOT DILUTE. | |
| Puralube Vet Ophthalmic Ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | Sterile ocular lubricant |
| Lactated Ringer's Injection, USP, 250 ml VIAFLEX Plastic Container | Baxter Healthcare Corp. | NDC0338-0117-02 | For body fluids replacement |
| Sol Povidone-Iodine Swabstick, 3' | Cardinal Heatlhcare | 23405-010B | |
| Sterile cotton tipped applicators | Kendall | 8884541300 | |
| 4-0 silk suture (without needle) | Cardinal Heatlhcare | A183H | |
| Vessel Clip, Straight, 0.75 mm x 4 mm Jaw | World Precision Instruments | 501779-G | |
| I.V. Catheter, Straight Hub, Radiopaque, 24 g x 3/4", FEP Polymer | Jelco | 4053 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010023 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Cardinal Healthcare | 179082 | |
| 4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) VIOLET 27" RB-1 TAPER | Ethicon | VCP304H | For muscle layer suturing |
| 4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) UNDYED 18" PC-3 CUTTING | Ethicon | VCP845G | For skin layer suturing |
| Triple antibiotic ointment | Actavis | NDC0472-0179-56 | For topical use on the site of the incision |
| Recombinant Rat VEGF 164 Protein | R&D Sytems | 564-RV | |
| Rabbit monoclonal VEGFA | Abcam | ab46154 | |
| Rabbit monoclonal FLK1 | Cell Signaling | 9698 | |
| Rabbit monoclonal AKT | Cell Signaling | 4691 | |
| Rabbit monoclonal phosphoAKT (Ser 473) | Cell Signaling | 4060 | |
| Rabbit monoclonal p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell Signaling | 4695 | |
| Rabbit monoclonal phospho p44/42 MAPK (Thr202 and Tyr 204) | Cell Signaling | 4370 |
References
- Dejani, H., Eisen, T. D., Finkelstein, F. O. Revascularization of renal artery stenosis in patients with renal insufficiency. Am. J. Kidney Dis. 36 (4), 752-758 (2000).
- Kang, D. H., et al. Impaired angiogenesis in the remnant kidney model: I. Potential role of vascular endothelial growth factor and thrombospondin-1. J. Am. Soc. Nephrol. 12 (7), 1434-1447 (2001).
- Kang, D. H., Hughes, J., Mazzali, M., Schreiner, G. F., Johnson, R. J. Impaired angiogenesis in the remnant kidney model: II. Vascular endothelial growth factor administration reduces renal fibrosis and stabilizes renal function. J. Am. Soc. Nephrol. 12 (7), 1448-1457 (2001).
- Kang, D. H., et al. Role of the microvascular endothelium in progressive renal disease. J. Am. Soc. Nephrol. 13 (3), 806-816 (2002).
- Chade, A. R., Kelsen, S. Reversal of renal dysfunction by targeted administration of VEGF into the stenotic kidney: a novel potential therapeutic approach. Am. J. Physiol.- Renal Physiol. 302 (10), F1342-F1350 (2012).
- Eirin, A., et al. Changes in Glomerular Filtration Rate After Renal Revascularization Correlate With Microvascular Hemodynamics and Inflammation in Swine Renal Artery Stenosis. Circ.-Cardiovasc. Interv. 5 (5), 720-728 (2012).
- Chade, A. R. Distinct Renal Injury in Early Atherosclerosis and Renovascular Disease. Circulation. 106 (9), 1165-1171 (2002).
- Seddon, M., Saw, J. Atherosclerotic renal artery stenosis: review of pathophysiology, clinical trial evidence, and management strategies. Can. J. Cardiol. 27 (4), 468-480 (2011).
- Lao, D., Parasher, P. S., Cho, K. C., Yeghiazarians, Y. Atherosclerotic renal artery stenosis--diagnosis and treatment. Mayo Clin Proc. 86 (7), 649-657 (2011).
- Sharfuddin, A. A., Molitoris, B. A. Pathophysiology of ischemic acute kidney injury. Nat. Rev. Nephrol. 7, 189-200 (2011).
- Noiri, E., et al. Oxidative and nitrosative stress in acute renal ischemia. Am. J. Physiol.- Renal Physiol. 281 (5), F948-F957 (2001).
- Koesters, R., et al. Tubular Overexpression of Transforming Growth Factor-Î1 Induces Autophagy and Fibrosis but Not Mesenchymal Transition of Renal Epithelial Cells. Am. J. Pathol. 177 (2), 632-643 (2010).
- Shanley, P. F., Rosen, M. D., Brezis, M., Silva, P., Epstein, F. H., Rosen, S. Topography of focal proximal tubular necrosis after ischemia with reflow in the rat kidney. Am. J. Pathol. 122 (3), 462-468 (1986).
