Entrega intravascular de Biologics para o rim de rato

Summary

A administração de drogas para a recuperação da função renal requer controlo da localização e distribuição do composto terapêutico. Aqui, descrevemos em detalhe uma técnica simples para entrega intra-renal de drogas em ratos. Este procedimento pode ser facilmente realizada sem mortalidade e alta reprodutibilidade.

Protocol

As experiências foram realizadas em ratos fêmea Sprague-Dawley, pesando 250-300 g. Todos os procedimentos com animais conformidade com as normas estabelecidas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Institute of Laboratory Animal Resources, National Academy of Sciences, Bethesda, MD, EUA) e foram aprovadas pela Mayo Clinic College of Medicine Animal Care Institucional e Use Committee (IACUC).

1. Preparação

1. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia. Se múltiplas cirurgias em diferentes ratos estão previstas no mesmo dia, lavar instrumentos após cada procedimento de animais e, em seguida esterilizar usando um esterilizador quente talão.
2. Anestesiar ratos com 4% de isoflurano em 1 L / min _{de O2.}
3. Transferir o rato para uma almofada de aquecimento controlada para manter a temperatura corporal a 37 ° C. Manter a anestesia com 1-2% de isoflurano em 1 L / min _{de O2.}
4. Administrar o fármaco analgésico (Buprenorfina de Libertação 0,6 mg / kg) subcutaneously.
5. Aplicar unguento para os olhos para evitar a secagem durante o procedimento.
6. A fim de compensar a perda de fluidos corporais devido a laparotomia, é importante administrar 10 ml / kg de 0,9% de soro fisiológico por via subcutânea no pré-operatório.
7. Raspar a área abdominal e limpar a pele com as almofadas de etanol iodopovidona e 70%.

2. Procedimento Cirúrgico

1. Certifique-se de que a profundidade da sedação é adequada, monitorando reflexos físicos, como a retirada do pitada dedo do pé, reflexo palpebral, o tom de mandíbula, e respiração taxa / padrão.
2. Realizar uma laparotomia através de uma pequena incisão na linha média (2-2,5 cm de comprimento), usando uma lâmina de bisturi cirúrgico No. 10.
3. Puxar o intestino e cólon para o lado direito do abdómen, utilizando cotonetes e cobri-los com uma gaze estéril embebido em solução salina normal a 0,9% para manter os órgãos húmido.
4. Suavemente retrai para cima do baço, fígado, estômago e pâncreas para expor o aorta e a artéria renal esquerda.
5. Com a ajuda de um microscópio cirúrgico, separar cuidadosamente a aorta abdominal superior e inferior do rim esquerdo e a artéria renal esquerda a partir das veias, a gordura e o tecido conjuntivo circundante, com uma pinça de dissecação curvado sem corte e cotonetes estéreis.
   1. Use a pinça com um movimento (dissecção romba) abrir-fechar repetido ao longo do comprimento dos navios para remover o tecido conjuntivo e os cotonetes com um movimento de rolamento lateral, para remover a gordura.
      NOTA: A dissecção da região peri-aórtico é um passo muito delicado como nervos e vasos linfáticos pode estar danificado. Certifique-se de manter as artérias úmido com soro fisiológico durante o procedimento de dissecção.
6. Colocar uma sutura de seda 4-0 sob a aorta.
7. Usando clipes microvasculares, prender a aorta acima (apenas abaixo da artéria mesentérica superior) e abaixo da bifurcação da artéria renal.
8. Perfurar a aorta ao nível da kidn esquerdaEY bifurcação da artéria com um cateter intravenoso L 24 e avançar o cateter para a artéria renal.
   NOTA: Este é um passo crítico como punção através da artéria renal pode ocorrer.
9. Ligar uma seringa cheia com a solução de droga ou soro fisiológico (até 500 pL) para o cateter e a perfusão do rim.
10. Imediatamente após a perfusão, prender a veia renal esquerda e para a esquerda do ureter com um grampo microvascular e remover o cateter. Em seguida, colocar um pedaço de esponja de gelatina absorvível hemostática, com uma pequena gota de adesivo de tecido, sobre a área perfurada da aorta e aplicar pressão suavemente com um cotonete.
11. Ao mesmo tempo, libertar a braçadeira a partir da aorta abdominal, abaixo da bifurcação da artéria renal esquerda. Após 5 min, libertar a braçadeira a partir da veia renal e ureter.
12. Cuidadosamente libertar a braçadeira a partir da aorta, acima da bifurcação da artéria renal esquerda, e permitir a reperfusão do rim. A isquemia renal total não deve durar mais de 7 min.
13. Fechar a incisão abdominal em duas camadas (músculo e pele), utilizando 4-0 suturas absorvíveis e um padrão contínuo, para prevenir a infecção. Em adição à técnica padrão de sutura contínua, outra opção seria a utilização de uma técnica simples, interrompida, especialmente para o fechamento da parede do corpo para evitar deiscência.
14. Aplicar pomada antibiótica tópica sobre a área da incisão para evitar infecções.
15. Transferir o rato em uma gaiola de observação free-cama em uma almofada quente até a recuperação completa com uma faixa de temperatura fixado em 35-37 ° C. Cama solta deve ser coberta (por exemplo, com uma cortina ou toalha de papel) ou retirado da gaiola, até os animais são completamente recolhidas para evitar asfixia ou aspiração da roupa de cama.
16. Após a cirurgia, os animais observar continuamente até que a respiração espontânea, em seguida hora a hora durante algumas horas. Re-dosear o analgésico Buprenorfina SR 72 hrmais tarde, se forem observados sinais de desconforto, tais como letargia, curvado e desalinhado, careta, não retomar as suas actividades normais.
17. Após a conclusão de todos os estudos, a eutanásia de animais com a inalação de uma dose excessiva de CO ₂ e colher os tecidos renais para ex vivo análises como histologia e Western Blotting ^5.

Representative Results

Nós injectados duas doses diferentes de VEGF recombinante de rato (rrVEGF, 0,17 ug / kg e 5 mg / kg) ou PBS. Os animais foram sacrificados 8 horas após a cirurgia para examinar a activação da via VEGF. O procedimento cirúrgico não afectou a morfologia do rim perfundido (Figura 1A), quando comparado com o controlo (Figura 1B), como mostrado por coloração com H & E. Embora a coloração com vermelho Sirius não mostram qualquer aumento na deposição da matriz extracelular em resposta ao tempo de isquemia e a infusão da rrVEGF (Figura 1C), quando comparado com o controlo (Figura 1D). Através de análise de transferência de Western, observou-se um pequeno mas significativo aumento na expressão de proteínas envolvidas na via de VEGF, tais como VEGF, Flk1, pAKT / AKT, pERK / ERK (Figura 2).

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Figura 1:. Imagens representativas de histológica Coloração de tecido renal Hematoxilina e Eosina (H & E) Coloração de secções de rim não mostra alterações anatómicas nos ratos que receberam VEGF (5 ug / kg, B) em comparação com os animais sham (A) através de injecção intra-renal. Considerando que, a coloração com vermelho Sirius não mostra diferenças significativas na deposição de colagénio em ratos que receberam VEGF (5 ug / kg, D) em comparação com os animais sham (C). Barra de escala representa 1 mm e imagens ampliadas representam 400 m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2:. A activação de VEGF Caminho análise por Western blot de VEGF, Flk1, phosphoAKT / AKT e phosphoERK / ERK mostrando a sobre-regulação da via VEGF após a infusão rrVEGF no rim (n = 4). Os dados são apresentados como média ± SEM. * P <0,05 vs. PBS. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Microscope	Leica	M125
Isoflurane 100 ml	Cardinal Healthcare	PI23238	Anesthetic
Buprenorphine HCL SR LAB 1 mg/ml, 5 ml	ZooPharm Pharmacy		Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hr duration of activity).                                                        Liquid is viscous, warming to RT aids in drawing into syringe.                                                           Recommended dosage: 1 - 1.2 mg/kg SC. DO NOT DILUTE.
Puralube Vet Ophthalmic Ointment	Dechra	NDC17033-211-38	Sterile ocular lubricant
Lactated Ringer's Injection, USP, 250 ml VIAFLEX Plastic Container	Baxter Healthcare Corp.	NDC0338-0117-02	For body fluids replacement
Sol Povidone-Iodine  Swabstick, 3'	Cardinal Heatlhcare	23405-010B
Sterile cotton tipped applicators	Kendall	8884541300
4-0 silk suture (without needle)	Cardinal Heatlhcare	A183H
Vessel Clip, Straight, 0.75 mm x 4 mm Jaw	World Precision Instruments	501779-G
I.V. Catheter, Straight Hub, Radiopaque, 24 g x 3/4", FEP Polymer	Jelco	4053
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010023
SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge	Cardinal Healthcare	179082
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) VIOLET 27" RB-1 TAPER	Ethicon	VCP304H	For muscle layer suturing
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) UNDYED 18" PC-3 CUTTING	Ethicon	VCP845G	For skin layer suturing
Triple antibiotic ointment	Actavis	NDC0472-0179-56	For topical use on the site of the incision
Recombinant Rat VEGF 164 Protein	R&D Sytems	564-RV
Rabbit monoclonal VEGFA	Abcam	ab46154
Rabbit monoclonal FLK1	Cell Signaling	9698
Rabbit monoclonal AKT	Cell Signaling	4691
Rabbit monoclonal phosphoAKT (Ser 473)	Cell Signaling	4060
Rabbit monoclonal p44/42 MAPK (ERK1/2)	Cell Signaling	4695
Rabbit monoclonal phospho p44/42 MAPK (Thr202 and Tyr 204)	Cell Signaling	4370