Summary
Administrering av läkemedel för återvinning av njurfunktionen kräver kontroll av lokalisering och distribution av den terapeutiska föreningen. Här beskriver vi i detalj en enkel teknik för intrarenala leverans av läkemedel hos råttor. Detta förfarande kan lätt utföras utan dödlighet och hög reproducerbarhet.
Protocol
Experimenten utfördes på Sprague-Dawley-råttor, som vägde 250-300 g. Alla djurförsök uppfyllde de normer som anges i handledningen för vård och användning av försöksdjur (Institute of Laboratory Animal Resources, National Academy of Sciences, Bethesda, MD, USA) och godkändes av Mayo Clinic College of Medicine Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC).
1. Beredning
- Autoklav alla kirurgiska instrument före operationen. Om flera operationer på olika råttor planeras i samma dag, skölj instrument efter varje djur förfarande och sedan sterilisera med hjälp av en varm pärla autoklav.
- Söva råtta med 4% isofluran i ett L / min O 2.
- Överföra råtta till en styrd värmedyna för att bevara kroppstemperaturen vid 37 ° C. Upprätthålla anestesi med 1-2% isofluran i ett L / min O 2.
- Administrera det analgetiska läkemedlet (Buprenorfin Sustained Release 0,6 mg / kg) subcutaneously.
- Applicera salva till ögonen för att förhindra uttorkning under förfarandet.
- För att kompensera för förlust av kroppsvätskor på grund av laparotomi, är det viktigt att administrera 10 ml / kg av 0,9% normal saltlösning subkutant preoperativt.
- Raka buken och rengör huden med povidon-jod och 70% etanol dynor.
2. Kirurgisk procedur
- Se till att sedationsdjupet är tillräcklig genom att övervaka fysiska reflexer, såsom tillbakadragande från tå nypa, ögonlocksreflexer, käke ton, och andningsfrekvens / mönster.
- Utför en laparotomi genom ett litet mittlinjen snitt (2-2,5 cm i längd) med en kirurgisk skalpell blad nr 10.
- Dra i tarmen och kolon till den högra sidan av buken med hjälp av bomullspinnar och täcka dem med steril gasbinda indränkt i till 0,9% normal saltlösning för att bibehålla organ fuktig.
- dra försiktigt uppåt mjälten, levern, magen och bukspottkörteln att exponera AORTA och den vänstra njurartärerna.
- Med hjälp av ett operationsmikroskop, noggrant separera den abdominala aortan ovanför och nedanför vänster njure och vänster njurartären från venerna, fettet och den omgivande bindväven med trubbiga dissekera böjda pincett och sterila bomullspinnar.
- Använd pincett med en upprepad öppna-stäng rörelse (trubbig dissektion) längs längden av kärlen för avlägsnande av bindväv och de bomullspinnar med en lateral rullande rörelse för att avlägsna fettet.
OBS! Dissektion av peri-aorta regionen är en mycket känslig steg som nerver och lymfkärl kan skadas. Se till att hålla artärerna fuktig med saltlösning under dissekering förfarandet.
- Använd pincett med en upprepad öppna-stäng rörelse (trubbig dissektion) längs längden av kärlen för avlägsnande av bindväv och de bomullspinnar med en lateral rullande rörelse för att avlägsna fettet.
- Placera en 4-0 silkesutur under aorta.
- Med hjälp av mikrovaskulära klipp, klämma aorta ovan (strax under den överlägsna mesenterica) och under njurartären förgreningen.
- Punktera aortan i nivå med den vänstra kidney artär bifurkation med en 24 G intravenös kateter och föra fram katetern in i njurartären.
OBS: Detta är ett kritiskt steg som punktering genom njurartären kan förekomma. - Anslut en spruta fylld med läkemedelslösning eller koksaltlösning (upp till 500 | j, l) till katetem och perfundera njuren.
- Omedelbart efter perfusion, klämma vänster renal ven och den vänstra urinledaren med en mikrovaskulär klämma och ta bort katetern. Sedan placera en bit absorber hemostat gelatinsvamp, med en liten droppe av vävnadslim, över den punkterade delen av aorta och tryck försiktigt med en bomullspinne.
- Samtidigt släpper klämman från bukaorta, under den vänstra njurartären bifurkation. Efter 5 minuter, släpp klämman från njurvenen och urinledaren.
- Släpp försiktigt klämman från aorta, över den vänstra njurartären bifurkation, och göra det möjligt för njur reperfusion. Den totala njur ischemi bör pågå längre än 7 minuter.
- Stänga buksnitt i två skikt (muskel och hud), med användning av 4-0 absorberbara suturer och ett kontinuerligt mönster för att förhindra infektion. Förutom den kontinuerligt mönster sutur teknik, skulle ett annat alternativ vara att använda ett enkelt, avbryts teknik, särskilt för kroppsväggen stängning för att förhindra dehiscence.
- Applicera aktuell antibiotika salva över snittet området för att förhindra infektioner.
- Överför råtta i en sängkläder fritt observation bur på en varm pad tills fullständig återhämtning med ett temperaturområde inställd på 35-37 ° C. Lös strö skall täckas (t.ex. med en duk eller pappershandduk) eller tas bort från buren tills djuren återhämtat sig helt för att förhindra kvävning eller aspiration av strö.
- Efter operation, observera djuren kontinuerligt tills andas spontant, sedan varje timme under några timmar. Åter dos smärtstillande Buprenorfin SR 72 timmarsenare om tecken på obehag observeras, såsom slöhet, hopsjunken och Josh, grimas, inte återuppta normala aktiviteter.
- Efter slutförandet av alla undersökningar, avliva djur med inandning av en överdos av CO2 och skörda njurvävnader för ex vivo analyser såsom histologi och Western blotting 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi injicerade två olika doser av rekombinant rått-VEGF (rrVEGF, 0,17 ng / kg och 5 pg / kg) eller PBS. Djuren avlivades 8 h efter operation för att undersöka aktiveringen av VEGF-vägen. Den kirurgiska proceduren inte påverkade morfologin hos den perfunderade njuren (Figur 1A) jämfört med kontrollen (Figur 1B), såsom visas med H & E-färgning. Medan Sirius red färgning inte visade någon ökning av extracellulär matrixdeposition som svar på den ischemiska tiden och infusion av rrVEGF (Figur 1C) jämfört med kontrollen (figur 1D). Genom Western Blot-analys, observerade vi en liten men signifikant ökning i uttrycket av proteiner som är inblandade i VEGF väg, såsom VEGF, FLK1, Pakt / AKT, Perk / ERK (Figur 2).
d / 54.418 / 54418fig1.jpg "/>
Figur 1:. Representativa bilder av histologisk färgning av njurvävnad hematoxilin och eosin (H & E) färgning av njursnitt visar inga anatomiska förändringar i råttor som fick VEGF (5 mikrogram / kg, B) jämfört med sken djur (A) via intrarenala injektion. Medan, sirius röd färgning visar inga signifikanta skillnader i kollagendeponering i råttor som fick VEGF (5 ^ g / kg, D) jämfört med simulerade djur (C). Skala stapel representerar en mm och förstorade bilder representerar 400 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Aktivering av VEGF Pathway Western Blot analys av VEGF, FLK1, phosphoAKT / AKT och phosphoERK / ERK visar uppregleringen av VEGF-vägen efter rrVEGF infusion i njuren (n = 4). Data presenteras som medelvärde ± SEM. * P <0,05 jämfört med PBS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Detta arbete är delvis stöds av ett forskningsanslag från Astra Zeneca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Microscope | Leica | M125 | |
| Isoflurane 100 ml | Cardinal Healthcare | PI23238 | Anesthetic |
| Buprenorphine HCL SR LAB 1 mg/ml, 5 ml | ZooPharm Pharmacy | Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hr duration of activity). Liquid is viscous, warming to RT aids in drawing into syringe. Recommended dosage: 1 - 1.2 mg/kg SC. DO NOT DILUTE. | |
| Puralube Vet Ophthalmic Ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | Sterile ocular lubricant |
| Lactated Ringer's Injection, USP, 250 ml VIAFLEX Plastic Container | Baxter Healthcare Corp. | NDC0338-0117-02 | For body fluids replacement |
| Sol Povidone-Iodine Swabstick, 3' | Cardinal Heatlhcare | 23405-010B | |
| Sterile cotton tipped applicators | Kendall | 8884541300 | |
| 4-0 silk suture (without needle) | Cardinal Heatlhcare | A183H | |
| Vessel Clip, Straight, 0.75 mm x 4 mm Jaw | World Precision Instruments | 501779-G | |
| I.V. Catheter, Straight Hub, Radiopaque, 24 g x 3/4", FEP Polymer | Jelco | 4053 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010023 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Cardinal Healthcare | 179082 | |
| 4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) VIOLET 27" RB-1 TAPER | Ethicon | VCP304H | For muscle layer suturing |
| 4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) UNDYED 18" PC-3 CUTTING | Ethicon | VCP845G | For skin layer suturing |
| Triple antibiotic ointment | Actavis | NDC0472-0179-56 | For topical use on the site of the incision |
| Recombinant Rat VEGF 164 Protein | R&D Sytems | 564-RV | |
| Rabbit monoclonal VEGFA | Abcam | ab46154 | |
| Rabbit monoclonal FLK1 | Cell Signaling | 9698 | |
| Rabbit monoclonal AKT | Cell Signaling | 4691 | |
| Rabbit monoclonal phosphoAKT (Ser 473) | Cell Signaling | 4060 | |
| Rabbit monoclonal p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell Signaling | 4695 | |
| Rabbit monoclonal phospho p44/42 MAPK (Thr202 and Tyr 204) | Cell Signaling | 4370 |
References
- Dejani, H., Eisen, T. D., Finkelstein, F. O. Revascularization of renal artery stenosis in patients with renal insufficiency. Am. J. Kidney Dis. 36 (4), 752-758 (2000).
- Kang, D. H., et al. Impaired angiogenesis in the remnant kidney model: I. Potential role of vascular endothelial growth factor and thrombospondin-1. J. Am. Soc. Nephrol. 12 (7), 1434-1447 (2001).
- Kang, D. H., Hughes, J., Mazzali, M., Schreiner, G. F., Johnson, R. J. Impaired angiogenesis in the remnant kidney model: II. Vascular endothelial growth factor administration reduces renal fibrosis and stabilizes renal function. J. Am. Soc. Nephrol. 12 (7), 1448-1457 (2001).
- Kang, D. H., et al. Role of the microvascular endothelium in progressive renal disease. J. Am. Soc. Nephrol. 13 (3), 806-816 (2002).
- Chade, A. R., Kelsen, S. Reversal of renal dysfunction by targeted administration of VEGF into the stenotic kidney: a novel potential therapeutic approach. Am. J. Physiol.- Renal Physiol. 302 (10), F1342-F1350 (2012).
- Eirin, A., et al. Changes in Glomerular Filtration Rate After Renal Revascularization Correlate With Microvascular Hemodynamics and Inflammation in Swine Renal Artery Stenosis. Circ.-Cardiovasc. Interv. 5 (5), 720-728 (2012).
- Chade, A. R. Distinct Renal Injury in Early Atherosclerosis and Renovascular Disease. Circulation. 106 (9), 1165-1171 (2002).
- Seddon, M., Saw, J. Atherosclerotic renal artery stenosis: review of pathophysiology, clinical trial evidence, and management strategies. Can. J. Cardiol. 27 (4), 468-480 (2011).
- Lao, D., Parasher, P. S., Cho, K. C., Yeghiazarians, Y. Atherosclerotic renal artery stenosis--diagnosis and treatment. Mayo Clin Proc. 86 (7), 649-657 (2011).
- Sharfuddin, A. A., Molitoris, B. A. Pathophysiology of ischemic acute kidney injury. Nat. Rev. Nephrol. 7, 189-200 (2011).
- Noiri, E., et al. Oxidative and nitrosative stress in acute renal ischemia. Am. J. Physiol.- Renal Physiol. 281 (5), F948-F957 (2001).
- Koesters, R., et al. Tubular Overexpression of Transforming Growth Factor-Î1 Induces Autophagy and Fibrosis but Not Mesenchymal Transition of Renal Epithelial Cells. Am. J. Pathol. 177 (2), 632-643 (2010).
- Shanley, P. F., Rosen, M. D., Brezis, M., Silva, P., Epstein, F. H., Rosen, S. Topography of focal proximal tubular necrosis after ischemia with reflow in the rat kidney. Am. J. Pathol. 122 (3), 462-468 (1986).
