Summary
Böbrek fonksiyonu geri kazanımı için ilaçların uygulanması lokalizasyonu ve tedavi bileşiğinin dağılımının kontrolünü gerektirir. Burada, detaylı sıçanlarda ilaçların intrarenal teslimat için basit bir teknik açıklar. Bu prosedür kolayca hiçbir ölüm ve yüksek ölçüde tekrarlanabilirliği ile gerçekleştirilebilir.
Protocol
Deneyler 250-300 g ağırlığında erkek Sprague-Dawley fareleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım (Laboratuar Hayvan Kaynakları Enstitüsü, Ulusal Bilimler Akademisi, Bethesda, MD, ABD) ve için Kılavuzunda belirtilen standartlara uyup Bütün hayvan prosedürleri Tıp Kurumsal Hayvan Bakımı Mayo Clinic Koleji tarafından kabul edildi ve kullanımı Komitesi (IACUC).
1. Hazırlık
- Ameliyattan önce tüm cerrahi aletler otoklav. Farklı fareler üzerinde birden fazla ameliyatlar aynı gün içinde planlanan, her hayvan işleminden sonra durulama ve sonra sıcak bir boncuk sterilizatör kullanılarak sterilize edin.
- 1 L / dk O 2 izofluran% 4 ile sıçan anestezisi.
- 37 ° C 'de, vücut sıcaklığını muhafaza etmek için kontrollü ısıtma pedi sıçan aktarın. 1 L / dk O 2% 1-2 izofluran ile anestezi koruyun.
- analjezik ilaç (Buprenorfin Release 0.6 mg / kg Sürekli) su yönetmebcutaneously.
- İşlem sırasında kurumasını önlemek için gözlere merhem sürün.
- nedeniyle laparotomi vücut sıvılarının kaybını telafi etmek için, ameliyat öncesinde% 0.9 normal müsil, deri altından 10 ml / kg tatbik edilmesi önemlidir.
- Karın bölgesi tıraş ve povidon-iyot ve% 70 etanol yastıkları ile cildi temizleyin.
2. Cerrahi Prosedür
- sedasyon derinliği gibi ayak tutam çekilmesi, palpebral refleks, çene sesi ve solunum hızı / desen gibi fiziksel refleksleri, izleme yoluyla yeterli olduğundan emin olun.
- Bir cerrahi neşter bıçak No. 10 kullanarak küçük bir orta hat kesi yoluyla bir laparotomi (uzunluğu 2-2,5 cm) gerçekleştirin.
- pamuklu çubuklarla kullanarak karnın sağ tarafına bağırsak ve kolon çekin ve organları nemli tutmak için% 0.9 normal tuzlu için ıslatılmış steril gazlı bez ile bunları kapatın.
- Yavaşça AOR maruz yukarı dalak, karaciğer, mide ve pankreas gerita ve sol böbrek arter.
- Cerrahi mikroskop yardımıyla dikkatlice yukarıda ve sol böbrek ve damarları, yağ sol renal arter ve künt diseksiyon kavisli bir forseps ve steril pamuklu çevreleyen bağ dokusu altında abdominal aorta ayırın.
- yağ çıkarmak için bir yanal yuvarlanma hareketi ile bağ dokusu ve pamuk bezlerden kaldırmak için damarların uzunluğu boyunca tekrarlanan açma-kapama hareketi (künt diseksiyon) ile forseps kullanabilir.
NOT: peri-aort bölgenin diseksiyonu zarar görmüş olabilir sinirler ve lenf damarları olarak çok hassas bir adımdır. diseksiyon işlemi sırasında tuzlu su ile nemli arterler tutmak için emin olun.
- yağ çıkarmak için bir yanal yuvarlanma hareketi ile bağ dokusu ve pamuk bezlerden kaldırmak için damarların uzunluğu boyunca tekrarlanan açma-kapama hareketi (künt diseksiyon) ile forseps kullanabilir.
- aorta altında 4-0 ipek sütür yerleştirin.
- mikrovasküler klipleri kullanarak, (sadece superior mezenterik arterin altında) ve renal arter bifurkasyon altında yukarıda aort kelepçe.
- Sol kidn seviyesinde aort delikler24 G intravenöz kateter ile ey arter dallanma ve renal arter içine kateter ilerlemek.
NOT: Bu oluşabilir renal arter yoluyla delik olarak kritik bir adımdır. - kateter ilaç solüsyonu veya (500 ul kadar) tuzlu su ile dolu bir şırınga bağlayın ve böbrek serpmek.
- Hemen perfüzyon sonra, bir mikrovasküler klip ile sol renal ven ve sol üreter kelepçe ve kateter çıkarın. Ardından, aortun delinmiş alanı üzerinde, doku yapıştırıcı küçük bir damla ile, emilebilen hemostat jelatin sünger bir parça koyun ve yavaşça bir pamuklu çubukla basınç uygulayın.
- Aynı zamanda, sol renal arter bifurkasyon altında, abdominal aort kelepçeyi serbest bırakın. 5 dakika sonra, renal ven ve üreter kelepçeyi serbest bırakın.
- Dikkatle sol renal arter bifürkasyonun üzerinde, aorta kelepçe bırakın ve böbrek reperfüzyon için izin verir. toplam renal iskemi, 7 dakika daha uzun sürmelidir.
- enfeksiyonu önlemek için 4-0 emilebilir sütürler ve sürekli bir kalıbı kullanarak, iki kat (kas ve deri) karın kesisi kapatın. sürekli bir modeli dikiş tekniğine ilave olarak, başka bir seçenek yarılması önlemek için, özellikle vücut duvarı kapatılması için, basit bir kesintiye tekniği kullanmaktır.
- enfeksiyonları önlemek için kesi alanı üzerinde topikal antibiyotik merhem sürün.
- 35-37 ° C'de ayarlanmış bir sıcaklık aralığında tam iyileşme kadar sıcak bir pad üzerinde bir yatak ücretsiz gözlem kafesin içine sıçan aktarın. Gevşek yatak kaplı (örneğin drape veya kağıt havlu ile) ya da hayvanların tamamen boğulma ya da yatak aspirasyonu önlemek için iyileşene kadar kafes çıkarılmalıdır.
- Ameliyattan sonra birkaç saat için saatlik, daha sonra kendiliğinden nefes kadar sürekli hayvanları gözlemlemek. analjezik Buprenorfin SR 72 saat yeniden dozDaha sonra rahatsızlık belirtileri gibi eğilmiş ve pasaklı uyuşukluk, face, normal aktivitelerini sürdürme değil, görülmesi halinde.
- Tüm çalışmalar tamamlandıktan sonra, CO 2 aşırı dozda inhalasyon ile hayvanların ötenazi ve ex vivo böbrek dokular gibi histoloji ve Western Blot 5 olarak analiz hasat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rekombinant fare VEGF (rrVEGF, 0.17 ug / kg ve 5 mg / kg) ya da PBS iki farklı dozda enjekte edildi. hayvanlar VEGF yolunun aktivasyonunu incelemek için 8 saat sonrası ameliyat ötenazi uygulandı. H & E boyama ile gösterildiği gibi, kontrol (Şekil 1B) göre cerrahi işlem perfüze böbrek (Şekil 1A) morfolojisini etkilememiştir. Kontrol (Şekil 1D) ile karşılaştırıldığında Sirius kırmızısı boyama iskemik zaman ve rrVEGF (Şekil 1C) infüzyonu yanıt olarak, hücre dışı matris birikimi herhangi bir artış göstermedi bulunuyor. Western blot analizi ile, bu tür VEGF, flk1, pakt / AKT, pERK / ERK (Şekil 2) gibi VEGF yoluna katılan proteinlerin ekspresyonunda küçük ama önemli bir artış gözlenmiştir.
d / 54418 / 54418fig1.jpg "/>
Şekil 1:. Histolojik renal doku Hematoksilen lekelenmesi ve Eosin temsili görüntülerinin böbrek bölümlerinin (H & E) boyama böbrek içi enjeksiyon yoluyla, SHAM hayvanlarına (A) göre (5 ug / kg, B), VEGF alınan sıçanlarda anatomik değişiklikleri gösterir. , Sirius kırmızısı boyama sahte hayvanlar (C) ile karşılaştırıldığında (5 mg / kg, D) VEGF alınan sıçanlarda kollajen birikimi anlamlı farklılıklar gösteriyor oysa. Ölçek çubuğu 1 mm temsil eder ve büyütülmüş görüntüler 400 mikron temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. VEGF yolağının aktivasyonu VEGF Western Blot analizi, flk1, phosphoAKböbrek rrVEGF infüzyondan sonra VEGF yolunun upregülasyonunu gösteren T / Akt ve phosphoERK / ERK (n = 4). Veri ortalama ± SEM olarak sunulmaktadır. * P <PBS vs 0.05. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu çalışma kısmen Astra Zeneca bir araştırma bursu ile desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Microscope | Leica | M125 | |
| Isoflurane 100 ml | Cardinal Healthcare | PI23238 | Anesthetic |
| Buprenorphine HCL SR LAB 1 mg/ml, 5 ml | ZooPharm Pharmacy | Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hr duration of activity). Liquid is viscous, warming to RT aids in drawing into syringe. Recommended dosage: 1 - 1.2 mg/kg SC. DO NOT DILUTE. | |
| Puralube Vet Ophthalmic Ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | Sterile ocular lubricant |
| Lactated Ringer's Injection, USP, 250 ml VIAFLEX Plastic Container | Baxter Healthcare Corp. | NDC0338-0117-02 | For body fluids replacement |
| Sol Povidone-Iodine Swabstick, 3' | Cardinal Heatlhcare | 23405-010B | |
| Sterile cotton tipped applicators | Kendall | 8884541300 | |
| 4-0 silk suture (without needle) | Cardinal Heatlhcare | A183H | |
| Vessel Clip, Straight, 0.75 mm x 4 mm Jaw | World Precision Instruments | 501779-G | |
| I.V. Catheter, Straight Hub, Radiopaque, 24 g x 3/4", FEP Polymer | Jelco | 4053 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010023 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Cardinal Healthcare | 179082 | |
| 4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) VIOLET 27" RB-1 TAPER | Ethicon | VCP304H | For muscle layer suturing |
| 4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) UNDYED 18" PC-3 CUTTING | Ethicon | VCP845G | For skin layer suturing |
| Triple antibiotic ointment | Actavis | NDC0472-0179-56 | For topical use on the site of the incision |
| Recombinant Rat VEGF 164 Protein | R&D Sytems | 564-RV | |
| Rabbit monoclonal VEGFA | Abcam | ab46154 | |
| Rabbit monoclonal FLK1 | Cell Signaling | 9698 | |
| Rabbit monoclonal AKT | Cell Signaling | 4691 | |
| Rabbit monoclonal phosphoAKT (Ser 473) | Cell Signaling | 4060 | |
| Rabbit monoclonal p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell Signaling | 4695 | |
| Rabbit monoclonal phospho p44/42 MAPK (Thr202 and Tyr 204) | Cell Signaling | 4370 |
References
- Dejani, H., Eisen, T. D., Finkelstein, F. O. Revascularization of renal artery stenosis in patients with renal insufficiency. Am. J. Kidney Dis. 36 (4), 752-758 (2000).
- Kang, D. H., et al. Impaired angiogenesis in the remnant kidney model: I. Potential role of vascular endothelial growth factor and thrombospondin-1. J. Am. Soc. Nephrol. 12 (7), 1434-1447 (2001).
- Kang, D. H., Hughes, J., Mazzali, M., Schreiner, G. F., Johnson, R. J. Impaired angiogenesis in the remnant kidney model: II. Vascular endothelial growth factor administration reduces renal fibrosis and stabilizes renal function. J. Am. Soc. Nephrol. 12 (7), 1448-1457 (2001).
- Kang, D. H., et al. Role of the microvascular endothelium in progressive renal disease. J. Am. Soc. Nephrol. 13 (3), 806-816 (2002).
- Chade, A. R., Kelsen, S. Reversal of renal dysfunction by targeted administration of VEGF into the stenotic kidney: a novel potential therapeutic approach. Am. J. Physiol.- Renal Physiol. 302 (10), F1342-F1350 (2012).
- Eirin, A., et al. Changes in Glomerular Filtration Rate After Renal Revascularization Correlate With Microvascular Hemodynamics and Inflammation in Swine Renal Artery Stenosis. Circ.-Cardiovasc. Interv. 5 (5), 720-728 (2012).
- Chade, A. R. Distinct Renal Injury in Early Atherosclerosis and Renovascular Disease. Circulation. 106 (9), 1165-1171 (2002).
- Seddon, M., Saw, J. Atherosclerotic renal artery stenosis: review of pathophysiology, clinical trial evidence, and management strategies. Can. J. Cardiol. 27 (4), 468-480 (2011).
- Lao, D., Parasher, P. S., Cho, K. C., Yeghiazarians, Y. Atherosclerotic renal artery stenosis--diagnosis and treatment. Mayo Clin Proc. 86 (7), 649-657 (2011).
- Sharfuddin, A. A., Molitoris, B. A. Pathophysiology of ischemic acute kidney injury. Nat. Rev. Nephrol. 7, 189-200 (2011).
- Noiri, E., et al. Oxidative and nitrosative stress in acute renal ischemia. Am. J. Physiol.- Renal Physiol. 281 (5), F948-F957 (2001).
- Koesters, R., et al. Tubular Overexpression of Transforming Growth Factor-Î1 Induces Autophagy and Fibrosis but Not Mesenchymal Transition of Renal Epithelial Cells. Am. J. Pathol. 177 (2), 632-643 (2010).
- Shanley, P. F., Rosen, M. D., Brezis, M., Silva, P., Epstein, F. H., Rosen, S. Topography of focal proximal tubular necrosis after ischemia with reflow in the rat kidney. Am. J. Pathol. 122 (3), 462-468 (1986).
