Summary
בנוסף, לשימוש בתרופות עבור התאוששות של תפקוד כליות מחייב שליטה של הלוקליזציה וההפצה של המתחם הטיפולי. כאן אנו מתארים בפרוטרוט טכניקה פשוטה למסירת intrarenal של סמים בחולדות. הליך זה עשוי להתבצע בקלות ללא תמותת שחזור גבוה.
Protocol
הניסויים בוצעו על חולדות נקבות ספראג-Dawley, במשקל 250-300 גרם. הנהלים כל חיה בסטנדרטים הנקוב מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (המכון משאבים בחיות מעבדה, האקדמיה הלאומית למדעים, Bethesda, MD, USA) ואושרו על ידי הקולג 'מרפאת מאיו של טיפול בבעלי חיים מוסדיים לרפואה ועדת שימוש (IACUC).
1. הכנה
- חיטוי את כל מכשירי הניתוח לפני הניתוח. אם מספר ניתוחים על חולדות שונות מתוכננים באותו היום, לשטוף כלים אחרי כל הליך חיה ואז לעקר באמצעות מעקר חרוז חם.
- להרדים חולדה עם isoflurane 4% ב 1 L / min O 2.
- מעבירים את החולדה כרית חימום מבוקר לשמר את טמפרטורת הגוף על 37 מעלות צלזיוס. לשמור על הרדמה עם isoflurane 1-2% ב 1 L / min O 2.
- את התרופה לשיכוך כאבים (עצירות מתמשכת שחרור 0.6 מ"ג / ק"ג) subcutaneously.
- החל משחה על העיניים כדי למנוע התייבשות במהלך ההליך.
- על מנת לפצות על אובדן של נוזלים בגוף עקב laparotomy, חשוב לנהל 10 מ"ל / ק"ג של תת-עורית מלח רגיל 0.9% לפני הניתוח.
- לגלח את אזור הבטן ולנקות את העור עם povidone- יוד 70% רפידות אתנול.
2. הליך כירורגי
- ודא שעומק ההרגעה הוא נאות על ידי ניטור רפלקסים פיזי, כגון נסיגת קמצוץ בוהן, רפלקס palpebral, טון לסת, ו / דפוס קצב נשימה.
- בצע פיום בטן דרך חתך קו האמצע קטן (2-2.5 ס"מ אורך) באמצעות מס 'להב סכין המנתחים כירורגית 10.
- משוך את המעי הגס לצד ימין של הבטן באמצעות צמר גפן ומכסים אותם עם גזה סטרילית ספוגה 0.9% מלח רגיל כדי לשמור על איברים לחים.
- בעדינות לחזור בו כלפי מעלה הטחול, הכבד, הקיבה והלבלב לחשוף את בזת"א ואת עורק הכליה השמאלית.
- בעזרת מיקרוסקופ כירורגי, בזהירות להפריד את אבי העורקים בבטן מעל ומתחת כליות עזב ואת עורק הכליה השמאלית מן הוורידים, השומן ורקמת חיבור המקיפה עם מלקחיים מעוקל לנתח בוטה צמר גפן סטרילי.
- השתמש מלקחיים עם תנועה פתוחה קרוב חזרתי (דיסקציה קהה) לאורכו של הכלי להסרת רקמת חיבור ואת צמר גפן עם תנועה סיבובית לרוחב כדי להסיר את השומן.
הערה: דיסקציה של האזור פרי-אב העורקים היא צעד מאוד עדין כמו עצבים וכלי הלימפה עלול להינזק. הקפד לשמור על העורקים לחים עם מי מלח במהלך ההליך לנתיחה.
- השתמש מלקחיים עם תנועה פתוחה קרוב חזרתי (דיסקציה קהה) לאורכו של הכלי להסרת רקמת חיבור ואת צמר גפן עם תנועה סיבובית לרוחב כדי להסיר את השומן.
- מניחים תפר משי 4-0 מתחת האאורטה.
- באמצעות קליפים כלי דם, מהדק את אב העורקים לעיל (ממש מתחת עורק mesenteric המעולה) ומתחת הסתעפות עורק הכליה.
- לנקב את אבי העורקים ברמה של kidn שמאלהסתעפות עורק EY עם קטטר 24 G תוך ורידים ולקדם קטטר לתוך עורק הכליה.
הערה: זהו צעד קריטי כמו לנקב דרך עורק הכליה עלולה להתרחש. - חבר מזרק מלא עם פתרון סמים או מלוחים (עד 500 μl) כדי קטטר perfuse הכליה.
- מיד לאחר זלוף, מהדק את עורק הכליה שמאלה השופכן השמאלי עם קליפ כלי הדם ולהסיר את הקטטר. ואז, במקום חתיכת ספוג הג'לטין hemostat נספג, עם טיפה קטנה של דבק רקמות, מעל האזור המנוקב של האאורטה בעדינה להפעיל לחץ עם מקלון צמר גפן.
- במקביל, שחרר את המהדק מ אב העורקים בבטן, מתחת הסתעפות עורק הכליה השמאלית. לאחר 5 דקות, לשחרר את מהדק מ עורק הכליה ו שופכן.
- בזהירות לשחרר את המהדק מן האאורטה, מעל הסתעפות עורק הכליה השמאלית, ולאפשר reperfusion כליות. איסכמיה כלייתית בסך הכל צריכה להימשך לא יותר מ -7 דקות.
- סגירת החתך בבטן בשתי שכבות (שרירים ועור), באמצעות 4-0 תפרים נספגים ו דפוס מתמשך כדי למנוע הידבקות. בנוסף לטכניקת התפר המתמשכת דפוס, אפשרות נוספת תהיה להשתמש בטכניקה פשוטה, קטע, במיוחד לסגירת קיר גוף כדי למנוע בקיעה.
- החל משחה אנטיביוטית מקומית על אזור החתך כדי למנוע זיהומים.
- מעביר את החולדה לכלוב תצפית מצעים נטולים על כרית חמה עד להחלמה מלאה עם טווח טמפרטורות נקבע על 35-37 מעלות צלזיוס. מצעי Loose צריכים להיות מכוסים (למשל במגבת וילון או נייר) או יוסרו הכלוב עד חיות הם התאוששו באופן מלא כדי למנוע חנק או שאיפה של מצעים.
- לאחר הניתוח, יש למלא אחר החיות ברציפות עד נושם באופן ספונטני, אז לפי שעה במשך כמה שעות. Re-מינון hr SR 72 עצירות כאביםמאוחר יותר, אם סימני הסבל הם נצפו, כגון עייפות, שפופה, מוזנחת, עווית, לא חידוש לפעילות רגילה.
- לאחר השלמת כל המחקרים, להרדים חיות עם שאיפה של מנת יתר של CO 2 ולאסוף את רקמות הכליה עבור vivo לשעבר ניתוחים כגון היסטולוגיה ומערב סופג 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הזרקנו שני מינונים שונים של VEGF עכברוש רקומביננטי (rrVEGF, 0.17 מיקרוגרם / ק"ג ו 5 מיקרוגרם / ק"ג) או PBS. החיות היו מורדמים 8 שעות שלאחר הניתוח לבחון את שפעול מסלול VEGF. הליך כירורגי לא השפיע על המורפולוגיה של הכליה perfused (איור 1A) בהשוואה לשליטה (איור 1B), כפי שמוצג על ידי צביעת H & E. בעוד מכתים אדום סיריוס לא הראה שום גידול בתצהיר מטריקס בתגובה בפעם איסכמית העירוי של rrVEGF (תרשים 1C) בהשוואה לשליטה (האיור 1D). על ידי ניתוח כתם המערבי, צפינו עלייה קטנה אך משמעותית את הביטוי של חלבונים המעורבים מסלול VEGF, כגון VEGF, FLK1, PAKT / AKT, הטבה / ERK (איור 2).
ד / 54,418 / 54418fig1.jpg "/>
איור 1:. נציג תמונות של היסטולוגית הכתמה של רקמות כליה Hematoxilin ו Eosin (H & E) מכתים סעיפים כליות מראה שום שינויים אנטומיים בחולדות שקיבלו VEGF (5 מיקרוגרם / ק"ג, B) לעומת בעלי חיים דמה (א) באמצעות זריקה intrarenal. בעוד, סיריוס מכתים האדום מראה הבדלים משמעותיים בתצהיר קולגן בחולדות שקיבלו VEGF (5 מיקרוגרם / ק"ג, ד) לעומת בעלי חיים דמה (C). סרגל קנה מידה מייצג 1 מ"מ ותמונות מוגדלות מייצגי 400 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. הפעלת נתיב VEGF ניתוח כתם המערבי של VEGF, FLK1, phosphoAKT / AKT ו phosphoERK / ERK מראה את הגברת הביטוי של מסלול VEGF לאחר עירוי rrVEGF בכליות (n = 4). הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. * P <0.05 לעומת PBS. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
עבודה זו נתמכת בחלקה על ידי מענק מחקר Zeneca אסטרה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Microscope | Leica | M125 | |
| Isoflurane 100 ml | Cardinal Healthcare | PI23238 | Anesthetic |
| Buprenorphine HCL SR LAB 1 mg/ml, 5 ml | ZooPharm Pharmacy | Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hr duration of activity). Liquid is viscous, warming to RT aids in drawing into syringe. Recommended dosage: 1 - 1.2 mg/kg SC. DO NOT DILUTE. | |
| Puralube Vet Ophthalmic Ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | Sterile ocular lubricant |
| Lactated Ringer's Injection, USP, 250 ml VIAFLEX Plastic Container | Baxter Healthcare Corp. | NDC0338-0117-02 | For body fluids replacement |
| Sol Povidone-Iodine Swabstick, 3' | Cardinal Heatlhcare | 23405-010B | |
| Sterile cotton tipped applicators | Kendall | 8884541300 | |
| 4-0 silk suture (without needle) | Cardinal Heatlhcare | A183H | |
| Vessel Clip, Straight, 0.75 mm x 4 mm Jaw | World Precision Instruments | 501779-G | |
| I.V. Catheter, Straight Hub, Radiopaque, 24 g x 3/4", FEP Polymer | Jelco | 4053 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010023 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Cardinal Healthcare | 179082 | |
| 4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) VIOLET 27" RB-1 TAPER | Ethicon | VCP304H | For muscle layer suturing |
| 4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) UNDYED 18" PC-3 CUTTING | Ethicon | VCP845G | For skin layer suturing |
| Triple antibiotic ointment | Actavis | NDC0472-0179-56 | For topical use on the site of the incision |
| Recombinant Rat VEGF 164 Protein | R&D Sytems | 564-RV | |
| Rabbit monoclonal VEGFA | Abcam | ab46154 | |
| Rabbit monoclonal FLK1 | Cell Signaling | 9698 | |
| Rabbit monoclonal AKT | Cell Signaling | 4691 | |
| Rabbit monoclonal phosphoAKT (Ser 473) | Cell Signaling | 4060 | |
| Rabbit monoclonal p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell Signaling | 4695 | |
| Rabbit monoclonal phospho p44/42 MAPK (Thr202 and Tyr 204) | Cell Signaling | 4370 |
References
- Dejani, H., Eisen, T. D., Finkelstein, F. O. Revascularization of renal artery stenosis in patients with renal insufficiency. Am. J. Kidney Dis. 36 (4), 752-758 (2000).
- Kang, D. H., et al. Impaired angiogenesis in the remnant kidney model: I. Potential role of vascular endothelial growth factor and thrombospondin-1. J. Am. Soc. Nephrol. 12 (7), 1434-1447 (2001).
- Kang, D. H., Hughes, J., Mazzali, M., Schreiner, G. F., Johnson, R. J. Impaired angiogenesis in the remnant kidney model: II. Vascular endothelial growth factor administration reduces renal fibrosis and stabilizes renal function. J. Am. Soc. Nephrol. 12 (7), 1448-1457 (2001).
- Kang, D. H., et al. Role of the microvascular endothelium in progressive renal disease. J. Am. Soc. Nephrol. 13 (3), 806-816 (2002).
- Chade, A. R., Kelsen, S. Reversal of renal dysfunction by targeted administration of VEGF into the stenotic kidney: a novel potential therapeutic approach. Am. J. Physiol.- Renal Physiol. 302 (10), F1342-F1350 (2012).
- Eirin, A., et al. Changes in Glomerular Filtration Rate After Renal Revascularization Correlate With Microvascular Hemodynamics and Inflammation in Swine Renal Artery Stenosis. Circ.-Cardiovasc. Interv. 5 (5), 720-728 (2012).
- Chade, A. R. Distinct Renal Injury in Early Atherosclerosis and Renovascular Disease. Circulation. 106 (9), 1165-1171 (2002).
- Seddon, M., Saw, J. Atherosclerotic renal artery stenosis: review of pathophysiology, clinical trial evidence, and management strategies. Can. J. Cardiol. 27 (4), 468-480 (2011).
- Lao, D., Parasher, P. S., Cho, K. C., Yeghiazarians, Y. Atherosclerotic renal artery stenosis--diagnosis and treatment. Mayo Clin Proc. 86 (7), 649-657 (2011).
- Sharfuddin, A. A., Molitoris, B. A. Pathophysiology of ischemic acute kidney injury. Nat. Rev. Nephrol. 7, 189-200 (2011).
- Noiri, E., et al. Oxidative and nitrosative stress in acute renal ischemia. Am. J. Physiol.- Renal Physiol. 281 (5), F948-F957 (2001).
- Koesters, R., et al. Tubular Overexpression of Transforming Growth Factor-Î1 Induces Autophagy and Fibrosis but Not Mesenchymal Transition of Renal Epithelial Cells. Am. J. Pathol. 177 (2), 632-643 (2010).
- Shanley, P. F., Rosen, M. D., Brezis, M., Silva, P., Epstein, F. H., Rosen, S. Topography of focal proximal tubular necrosis after ischemia with reflow in the rat kidney. Am. J. Pathol. 122 (3), 462-468 (1986).
