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Biochemistry

प्रजाति निर्धारण और मिश्रण में Quantitation मांस प्रमाणीकरण करने के लिए पेप्टाइड्स एप्लाइड के एमआरएम मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग

Published: September 20, 2016 doi: 10.3791/54420
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1,3, 1
1Analytical Sciences Unit, Institute of Food Research, 2Institute of Food Research, 3School of Chemistry, University of East Anglia

Protocol

1. प्रोटियोलिसिस और संदर्भ Myoglobins का विश्लेषण

  1. संदर्भ myoglobins की प्रोटियोलिसिस
    1. (- 0.5 मिलीग्राम / 25 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट में मिलीलीटर सीमा 0.2) 3 शुद्ध संदर्भ myoglobins का समाधान तैयार करें।
    2. स्थानांतरण 1 2 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लिए प्रत्येक नमूने की मिलीलीटर aliquots।
    3. Thermally 30 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म ब्लॉक में नमूना हीटिंग द्वारा निकाले प्रोटीन denature। लगभग 15 मिनट के लिए नमूना शांत जब तक यह कमरे के तापमान तक पहुँचता है। यूरिया (अंतिम एकाग्रता 0.5 एम) के 30 मिलीग्राम पाचन बढ़ाने के लिए, तो मिश्रण जोड़ें।
  2. tryptic प्रोटियोलिसिस
    1. 25 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट में trypsin के एक 1 मिलीग्राम / एमएल समाधान तैयार है और आवश्यकता के रूप में बर्फ पर दुकान। Trypsin के लिए पर्याप्त मात्रा में जोड़ें ऐसी है कि अंतिम एंजाइम गतिविधि 420 Baee है (एन benzoyl-एल arginine एथिल एस्टर हाइड्रोक्लोराइड) इकाइयों / निकाले प्रोटीन की मिलीग्राम, तो कोमल vortexing द्वारा मिश्रण और 3 में रात भर proteolyze करने की अनुमति7 डिग्री सेल्सियस।
    2. सोडियम सल्फेट dodecyl जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) 17 बाहर ले प्रोटियोलिसिस की पूर्णता का प्रदर्शन करने के लिए।
  3. पोस्ट-प्रोटियोलिसिस नमूने की Desalting
    1. 2 v: पानी के साथ वी नमूना 1 पतला।
    2. एक polymeric उलट चरण सक्रिय करें (आरपी) कारतूस मेथनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़कर 30 मिलीग्राम आरपी सामग्री से भरा है, तो 1 के 1 एमएल% फार्मिक एसिड जोड़कर कारतूस संतुलित करना।
    3. गुरुत्वाकर्षण के तहत कारतूस पर नमूना लोड।
    4. गुरुत्वाकर्षण के तहत 5% मेथनॉल / 1% फार्मिक एसिड के 1 मिलीलीटर के साथ धोएं।
    5. 2 मिलीलीटर microcentrifuge 5 μl dimethylsulphoxide (DMSO) के साथ प्रीफिल्ड ट्यूबों में गुरुत्वाकर्षण के तहत;: 1 acetonitrile / पानी की मिलीलीटर (0.1% फार्मिक एसिड वी वी 90:10) के साथ पेप्टाइड्स Elute।
    6. 50 डिग्री सेल्सियस पर वैक्यूम के अंतर्गत विलायक हटाये 120 मिनट के लिए एक केन्द्रापसारक बाष्पीकरण का उपयोग कर, तो 250 μl acetonitrile / पानी में छाछ redissolve (3:97 वी: वि; 0.1% फार्मिक एसिड)।
    7. हस्तांतरणएक कम मात्रा ऑटो नमूना शीशी का हल।
      नोट: नमूने तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा / एमएस) के विश्लेषण के लिए तैयार है जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  4. एमआरएम के लिए संक्रमण सूचियों का सृजन
    1. UniProt डेटाबेस से अलग मीट के लिए मायोग्लोबिन दृश्यों का पता लगा।
    2. पेप्टाइड और संक्रमण भविष्यवाणी सॉफ्टवेयर की 'लक्ष्य' बॉक्स (जैसे, क्षितिज) में मायोग्लोबिन दृश्यों दर्ज करें। यदि आवश्यक हो, अपने टुकड़ा सूची प्रकट करने के लिए एक पेप्टाइड पर होवर करें।
    3. पर 'सेटिंग' पर क्लिक करें और 'पेप्टाइड सेटिंग' का चयन करें। इनपुट पाचन के लिए प्राथमिकताएँ (यानी, trypsin) और चूक चोली की संख्या (0)। अतिरिक्त पैरामीटर के लिए आवश्यक चयन दर्ज करें, विशेष रूप से, पेप्टाइड लंबाई (6 - 25), एन टर्मिनल बहिष्करण (0) और ग्रहण एमिनो एसिड संशोधनों (कोई नहीं)।
    4. 'सेटिंग' पर क्लिक करें और 'संक्रमण सेटिंग' का चयन करें। के लिए प्राथमिकताओं का चयन करेंसाधन नियंत्रण रेखा / एमएस विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया प्रकार।
    5. 'निर्यात' पर क्लिक करें और एक स्प्रेडशीट उत्पन्न एमआरएम संक्रमण और मापदंडों युक्त बनाने के लिए 'संक्रमण' की सूची का चयन करें।
  5. नियंत्रण रेखा / एमएस द्वारा विश्लेषण
    1. उच्च प्रदर्शन तरल chromatograph (एचपीएलसी) ऑटो पारखी, C18 कोर खोल एचपीएलसी स्तंभ के साथ (10 सेमी x 2.1 मिमी: बाइनरी ढाल की एक प्रणाली (v पानी (ए) और acetonitrile (बी), 0.1% फार्मिक एसिड वी के साथ प्रत्येक) को सेट करें 2.6 माइक्रोन कण आकार) एम आर एम पता लगाने के साथ सकारात्मक electrospray मोड में संचालित एक ट्रिपल quadrupole मास स्पेक्ट्रोमीटर से जुड़ा है।
    2. डेटा संग्रह सॉफ्टवेयर (जैसे, विश्लेषक) में, 'फ़ाइल' और 'नई' का चयन करें और पॉप-अप बॉक्स में 'अधिग्रहण विधि' पर क्लिक करें फिर 'ठीक' पर क्लिक करें।
      नोट: यह साधन विधि संपादक, जो जुड़े उपकरणों है कि एक नया नियंत्रण रेखा / एमएस विधि की स्थापना के लिए सक्षम हो जाएगा की एक सूची है खोलता है।
    3. पर 'बाइनरी पम्प' और मैं क्लिक करेंNput प्रवाह की दर मूल्य (300 μl / मिनट) और 22 मिनट से अधिक तालिका में ढाल टाइम्स, 30% बी 3% बी के एक द्विआधारी ढाल प्रोफ़ाइल स्थापना, एक 5 मिनट के लिए 23 मिनट पर 100% बी करने के लिए बढ़ती बाहर धोने एक और 6 मिनट के लिए प्रारंभिक स्थितियों और पुन: संतुलन पर लौटने से पहले।
    4. 'Autosampler' पर क्लिक करें और इंजेक्शन की मात्रा (5 μl) डालें। 'सुई धोने चक्र' सक्षम 'और' धो टाइम '(30 सेकंड) दर्ज करें और' फ्लश पोर्ट '।
    5. 'Thermostatted कॉलम नियंत्रक' पर और 'कॉलम ओवन गुण' 'वाम तापमान' की स्थापना की और 'सही तापमान' (40 डिग्री सेल्सियस) पर क्लिक करें।
    6. पर 'मास स्पेक्ट्रोमीटर' पर क्लिक करें और फिर 'संपादन मापदंडों' पर क्लिक स्रोत गैस की स्थिति में प्रवेश करने के लिए। के रूप में 'सकारात्मक' 'एम आर एम (एमआरएम)' और 'Polarity' के रूप में 'स्कैन प्रकार' का चयन करें। नियंत्रण रेखा विश्लेषण एक के लिए 'काल सारांश' पर जाएं और 'अवधि समय' में प्रवेश, कुल समयडी संतुलन (35 मिनट)।
    7. तालिका में ठीक क्लिक करें और तालिका में ये कॉलम जोड़ने के लिए 'Declustering संभावित (डीपी)' और 'टक्कर ऊर्जा (सीपी)' का चयन करें। एक भी मांस प्रजातियों, संक्रमण सूची (कदम 1.4.5 देखें) में बनाया के लिए, संक्रमण के सभी के लिए Q1, Q3, समय (मिसे), आईडी, डी पी और सीई मान दर्ज करें।
      नोट: समय (मिसे), समय ध्यान केन्द्रित करने के लिए संदर्भित समय मास स्पेक्ट्रोमीटर प्रत्येक संक्रमण स्कैनिंग खर्च करता है, योग जिनमें से 3 सेकंड से अधिक नहीं होनी चाहिए।
    8. अधिग्रहण विधि फ़ाइल (फ़ाइल एक्सटेंशन .dam) को बचाओ।
      नोट: कदम 1.5.2 - 1.5.8 प्रत्येक मांस प्रजातियों के लिए बार-बार जाने की जरूरत है। यह नीचे दिए गए विश्लेषण के लिए तैयार करने में स्क्रीन मोड में प्रत्येक मांस प्रजातियों के लिए एक एकल विधि फ़ाइल बनाएगा।
    9. डेटा संग्रह सॉफ्टवेयर में, 'मोल' पर क्लिक करें और 'संतुलित' का चयन करें। खुलने वाले बॉक्स में, आवश्यक अधिग्रहण विधि का चयन साधन संतुलन शुरू करने के लिए।
    10. गिरफ्तारी में नमूना शीशियों रखोऑटो पारखी में ack।
    11. 'फ़ाइल' पर क्लिक करें और 'नई' फिर 'अधिग्रहण बैच'। 'नमूना' टैब में 'नमूने जोड़ें' 'सेट' का चयन करें तो। डालें नमूनों की संख्या का विश्लेषण किया जा रहा है और 'ठीक' पर क्लिक करें। 'अधिग्रहण' बॉक्स में है कि ड्रॉप डाउन मेनू से विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा विधि फ़ाइल का चयन करें।
    12. तालिका में, का चयन 'थाली कोड' और ड्रॉप डाउन मेनू से उचित ट्रे विन्यास का चयन करें। में ठीक क्लिक करें 'थाली कोड' तो स्तंभ शीर्ष लेख और चुनें 'नीचे भरें' वाम क्लिक करें। 'शीशी में स्थिति' में पंक्तियों में ऑटो पारखी में प्रत्येक नमूने की स्थिति दर्ज करें।
    13. 'डेटा फ़ाइल' में अधिग्रहण के लिए फ़ाइल नाम दर्ज करें, स्तंभ शीर्षक में फिर छोड़ दिया क्लिक राइट क्लिक करके पीछा किया और 'नीचे भरें' का चयन करें। में 'नमूना नाम' डालने के नमूनों में से प्रत्येक की पहचान विश्लेषण किया जा सके। एक अधिग्रहण बैच फ़ाइल के रूप में सहेजें (फाइल ईXTension .dab)।
    14. 'सबमिट' टैब पर क्लिक करें, फिर नमूने नियंत्रण रेखा / एमएस पर विश्लेषण करने की आवश्यकता है कि प्रकाश डाला। पर 'सबमिट' पर क्लिक करें। विश्लेषण शुरू करने के लिए 'मोल' और 'नमूना शुरू करें' पर क्लिक करें।
      नोट: प्रत्येक अधिग्रहण विधि एक भी मांस प्रजातियों के लिए chromatograph की पूरी लंबाई भर में एमआरएम बदलाव के लिए स्कैन करेगा। एक एमआरएम अधिग्रहण के लिए मास स्पेक्ट्रोमीटर सेटिंग्स साधन प्रकार और पेप्टाइड के अनुसार बदलती हैं।
    15. डेटा देखने सॉफ्टवेयर का उपयोग कर उत्पन्न डेटा फ़ाइलों को देखें। XIC (निकाले आयनों) पर और ड्रॉप डाउन सूची एक भी अग्रदूत (क्यू 1) के लिए सभी टुकड़े (Q3 मान) को उजागर में क्लिक करें। एक नया फलक कि केवल पता चलता चुने हुए बदलाव खुल जाएगा।
    16. समवर्ती संक्रमण के समूहों के लिए अवधारण समय (आर टी) रिकॉर्ड के बाद से इन एक भी पेप्टाइड के अनुरूप हैं।
    17. आदेश में प्रत्येक के लिए उनके संबंधित पेप्टाइड्स चोटियों आवंटित करने में संक्रमण के प्रत्येक सेट के लिए पिछले दो चरणों को दोहराएँमांस प्रजातियों की।
    18. रिकॉर्ड मार्कर पेप्टाइड्स जो प्रजातियों की पहचान प्रदान करने के लिए उपयुक्त हैं (जैसे, पेप्टाइड HPGDFGADAQGAMTK, अग्रदूत मी / z = 752, आर टी = 12.0 मिनट, घोड़े के लिए), उनके प्रतिधारण समय के साथ एक साथ, और ध्यान दें जो रिश्तेदार quantitation के लिए उपयुक्त जोड़े के लिए इसी फार्म ।
      नोट: उदाहरण के लिए, घोड़े मार्कर पेप्टाइड (अग्रदूत मी / z = 752) एक इसी गोमांस पेप्टाइड, HPSDFGADAQAAMSK (अग्रदूत मी / z = 767, आर टी = 13.2 मिनट) है।
    19. आदेश, बारी में एक मांस प्रजातियों के लिए, एक गतिशील विधि मांस प्रजातियों में से सभी को गले लगाते बनाने के लिए डेटा देखने सॉफ्टवेयर में, प्रत्येक अग्रदूत (1.5.8 में एक विशेष पेप्टाइड को सौंपा) के लिए XIC संक्रमण डेटा खोलने में।
    20. बाएँ क्लिक करके चुना अवधारण समय में चोटी क्लस्टर पर ज़ूम और क्लस्टर के नीचे कर्सर को खींच। (पीक लेबल पर राइट क्लिक करके) सबसे तीव्र संक्रमण को पहचानें।
    21. मैन्युअल बदलाव रिकॉर्डऔर एक स्प्रेडशीट में प्रतिधारण बार।
    22. नियंत्रण रेखा / एमएस सॉफ्टवेयर पर एक नया गतिशील विधि के रूप में मानकों में प्रवेश करने के लिए, 'मास स्पेक्ट्रोमीटर' पर क्लिक करें और फिर 'पैरामीटर संपादित करें' पर क्लिक करें स्रोत गैस की स्थिति में प्रवेश करने के लिए। के रूप में 'सकारात्मक' 'एम आर एम (एमआरएम)' और 'Polarity' के रूप में 'स्कैन प्रकार' का चयन करें।
    23. 'काल सारांश' पर जाएं और अवधि समय (नियंत्रण रेखा विश्लेषण और संतुलन के लिए कुल समय के रूप में सेट) दर्ज करें। तालिका में ठीक क्लिक करें और तालिका में ये कॉलम जोड़ने के लिए 'Declustering संभावित (डीपी)' और 'टक्कर ऊर्जा (सीपी)' का चयन करें।
      नोट: 'टाइम' कॉलम अब प्रत्येक संक्रमण के लिए उम्मीद की अवधारण समय (न्यूनतम) को दर्शाता है।
    24. नियंत्रण रेखा / एमएस डेटा संग्रह सॉफ्टवेयर की 'पैरामीटर्स संपादित करें' अनुभाग में, 'अनुसूचित एमआरएम' बॉक्स की जाँच करें। इनपुट Q1, Q3, समय (मिनट), आईडी, स्प्रेडशीट (1.5.21) में बनाया बदलाव के लिए डी पी और सीई मूल्यों और अधिग्रहण विधि बचाने के लिए (filई विस्तार .dam)।
      नोट: यह प्रक्रिया आम तौर एमआरएम की संख्या प्रत्येक पेप्टाइड के लिए 4 सबसे तीव्र करने के लिए संक्रमण और केवल एक पेप्टाइड शिखर के लिए अवधारण समय खिड़की के पार स्कैन करता है, बेहतर संवेदनशीलता और डेटा की गुणवत्ता दे रही है कम कर देता है। ए 'गतिशील' विधि एक 'निर्देशित अवधारण समय गवाक्षन' विधि, निर्धारण कभी कभी कहा जाता है।

2. तैयारी और कैलिब्रेशन नमूनों के विश्लेषण

  1. मांस के मिश्रण की निकासी
    1. पहले तो एक पाउडर में जमीन जमे हुए मांस का प्रयोग, संबंधित (लगभग 300 मिलीग्राम के कुल द्रव्यमान) 15 मिलीलीटर की प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूब में मांस की मात्रा वजन द्वारा मांस के मिश्रण की एक श्रृंखला तैयार करते हैं।
    2. निष्कर्षण बफर (पीएच 6.5 से 0.15 मीटर पोटेशियम क्लोराइड + 0.15 एम फॉस्फेट बफर) के 4 मिलीलीटर जोड़ें। 30 सेकंड के लिए भंवर। 250 चक्र / मिनट पर 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक प्रयोगशाला प्रकार के बरतन पर निकालें।
      नोट: साइकिल / मिनट एक oscillatory गति को दर्शाता है।
    3. के 2 मिलीलीटर स्थानांतरणएक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में निकाल सकते हैं। पर 17,000 एक्स जी 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    4. स्थानांतरण 2 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला के 200 μl aliquots (प्रोटीन परख के लिए एक छोटी राशि आरक्षित, 2.2 देखें) और एक केन्द्रापसारक बाष्पीकरण का उपयोग कर शुष्क (पूर्व निर्धारित कार्यक्रम: 50 डिग्री सेल्सियस, कोई निकाल और 120 मिनट की अवधि के साथ)।
  2. प्रोटीन परख
    1. स्थानांतरण एक 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं में सुरक्षित सतह पर तैरनेवाला के 7 μl aliquots (2.1.4 देखें) तीन प्रतियों में।
    2. स्थानांतरण तीन प्रतियों में प्रोटीन मानकों की एक श्रृंखला के 7 μl aliquots, रेंज 0 - 1.0 मिग्रा / मिली गोजातीय सीरम albumin (बीएसए), वही 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से Coomassie प्लस प्रोटीन परख अभिकर्मक के 200 μl जोड़ें।
    4. दिखने में प्रोटीन मानकों के साथ नमूना कुओं का रंग नमूने अंशांकन मानकों की रेंज में हैं जाँच करने के लिए की तुलना करें। यदि आवश्यक हो, पतला नमूने के साथ दोहराने तो यह रेंज में हो जाता है।
    5. सेंट करने के लिए थाली छोड़ दोऔर 3 मिनट के लिए।
    6. किसी भी बुलबुले कि एक चमड़े के नीचे सुई के साथ गठन किया है फट।
    7. 595 एनएम के तरंग दैर्ध्य में एक मानक समापन बिंदु प्रोटोकॉल का उपयोग प्लेट पाठक पर थाली का विश्लेषण।
    8. प्रोटीन मानकों से अंशांकन डेटा का उपयोग कर नमूने के प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण।
      नोट: यह tryptic पचाने में इस्तेमाल trypsin की राशि की गणना के लिए आवश्यक है।
  3. मांस मिश्रण के प्रोटियोलिसिस
    1. 25 मिमी अमोनियम बाइकार्बोनेट समाधान के 1 मिलीलीटर में कदम 2.1.4 से सूखे छाछ redissolve। एक rotamixer पर अच्छी तरह से मिलाएं।
    2. 1.3.7 करने के लिए कदम 1.1.3 से प्रोटोकॉल का पालन करें।
  4. नियंत्रण रेखा / एमएस द्वारा विश्लेषण
    1. पहले (कदम 1.5.1) के रूप में नियंत्रण रेखा / एमएस सेट करें।
    2. एक नए अधिग्रहण बैच के रूप में पहले से उल्लिखित बनाएँ (1.5.9 कदम - 1.5.14), एक गतिशील नियंत्रण रेखा / एमएस मांस प्रजातियों के सभी संयोजन विधि का उपयोग करता है कि 1.5.24 पर कदम पर बनाया अधिग्रहण विधि का चयन, और के लिए डेटा प्राप्त digesटेड मांस के नमूने।
    3. डेटा देखने सॉफ्टवेयर में पूर्ण वर्णलेख प्रदर्शित करें। प्रत्येक संक्रमण बदले में सेट के लिए XIC प्रदर्शित करें। दिखने में इस बात की पुष्टि प्रत्येक क्लस्टर जिससे चुने गए पेप्टाइड के अस्तित्व की पुष्टि की उम्मीद अवधारण समय पर घंटी के आकार चोटियों की अपेक्षित संख्या में शामिल हैं।
    4. डेटा शिखर क्षेत्रों नेविगेशन पट्टी में 'का निर्माण Quantitation विधि' पर डबल क्लिक करके ब्याज की संक्रमण से प्रत्येक के लिए एकीकृत करने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग कर देखने quantitation प्रदर्शन करना।
    5. 'नमूना चुनें' फलक में 'डेटा फ़ाइल' और 'नमूना' का चयन एक 'analytes' तालिका उत्पन्न करने के लिए विश्लेषण किया जा सके।
    6. संक्रमण (analytes) के पहले एकीकृत किया जा करने के लिए प्रदर्शित करने के लिए 'एकता' टैब पर क्लिक करें।
    7. संक्रमण के ड्रॉप डाउन सूची प्रदर्शित करने के लिए 'analyte' बॉक्स पर क्लिक करें। यह प्रदर्शित करने के लिए और नेत्रहीन इस बात की पुष्टि सही चोटी एकीकरण के लिए चयनित किया गया है बदले में प्रत्येक संक्रमण का चयन करें। एम के लिएodify या एकीकरण, क्लिक करें छोड़ दिया बल और लक्ष्य चोटी पर कर्सर (इस हरे रंग में प्रकाश डाला जाएगा) खींचें। 'शिखर चुनें' बटन पर क्लिक करें और 'लागू करें' पर क्लिक करें।
    8. एक विधि फ़ाइल (.qmf) के रूप में कार्यक्षेत्र को बचाने।
      नोट: यह नमूना शिखर क्षेत्रों के बाद गणना के लिए एक Quantitation विधि फ़ाइल बनाता है।
    9. नेविगेशन पट्टी में डबल क्लिक 'Quantitation जादूगर'। 'नमूने का चयन' विंडो में बना 'Quantitation सेट' एक 'डेटा फ़ाइल' एक या अधिक 'नमूने उपलब्ध' का चयन, तब तक। 'अगला' 'का चयन सेटिंग और क्वेरी' बॉक्स प्रदर्शित करने के लिए चयन करें। चूक के साथ छोड़ दें, चयन 'अगला' प्रदर्शित करने के लिए 'चयन विधि'। ड्रॉप डाउन 'विधि' बॉक्स कदम 2.4.8 में बनाई गई 'एकीकरण विधि' फ़ाइल का चयन से, फिर 'समाप्त' का चयन करें।
      नोट: यह एक 'परिणाम तालिका', मांस के मिश्रण से उत्पन्न होने वाले संक्रमण शिखर क्षेत्रों सहित बनाता है।
      10. <li> 'परिणाम तालिका' (फाइल एक्सटेंशन .rdb), एक पाठ फ़ाइल के रूप में निर्यात (.txt) को बचाने और डेटा की समीक्षा करने के लिए स्प्रेडशीट में खोलें।
    10. इसी पेप्टाइड्स, उन मामलों में जहां दो टुकड़े होते हैं पर ध्यान केंद्रित से दूसरे में एक मांस का प्रतिशत (संक्रमण शिखर क्षेत्र द्वारा) बनाम मापा प्रतिशत का प्लॉट रेखांकन (डब्ल्यू / डब्ल्यू) चयनित बदलाव के लिए चयनित किया एमआरएम के लिए दो मीट की एमिनो एसिड की एक ही नंबर सी टर्मिनल अंत से गिना जाता है।
      नोट: समान विखंडन साइटों के साथ समान टुकड़े इष्टतम परिणाम देती है।
    11. ऊपर 2.4.11 से भूखंडों की जांच करना। किसी भी नेत्रहीन, या साजिश रचने पैकेज में एक प्रवृत्ति लाइन उपकरण का उपयोग कर, भूखंडों जो दोनों रैखिक और इसी तरह ढाल के हैं के एक समूह की पहचान। असली मांस के नमूनों में जांच के लिए किसी भी इनमें से एक या CPCP प्लस टुकड़ा संयोजन का अधिक प्रयोग करें।
      नोट: एक असामान्य ढाल दिखा एक साजिश या तो पेप्टाइड या संकेत stre में एक फलस्वरूप कमी के साथ टुकड़ा दमन का संकेत हो सकताngth। गैर रेखीय भूखंडों गरीब चोटी का पता लगाने या अन्य समस्याओं का संकेत हो सकता।

3. मांस के नमूने

  1. लक्ष्य मांस के नमूने से प्रोटीन की निकासी
    1. कहाँ नमूना एक रंग का उपयोग करने से लागू हो, आबकारी बाहरी गैर-मांस सामग्री। उदाहरण के लिए, एक ठंडा Lasagna से सॉस और पास्ता दूर परिमार्जन।
    2. एक धातु बीकर में मांस के 20 ग्राम वजन।
    3. पीएच 6.5 से 0.15 मीटर पोटेशियम क्लोराइड / 0.15 एम पोटेशियम मोनोफास्फेट बफर के 100 मिलीलीटर जोड़ें।
    4. 1 मिनट के लिए एक उच्च गति homogenizer में मांस सम्मिश्रण द्वारा प्रोटीन निकालें।
    5. 2.3.2 - कदम 2.1.4 से प्रोटोकॉल का पालन करें।
  2. नियंत्रण रेखा / एमएस द्वारा नमूनों के विश्लेषण
    1. दोहराएँ कदम 2.4.2 गतिशील नियंत्रण रेखा / एमएस पद्धति का उपयोग करके डेटा प्राप्त करने के लिए।
    2. के रूप में कदम 2.4.3 में प्रदर्शन प्रत्येक मांस मायोग्लोबिन से पेप्टाइड्स को पहचानें।
    3. quantitation के लिए, quantitation सॉफ्टवेयर का उपयोग ब्याज की प्रत्येक संक्रमण के लिए शिखर क्षेत्रों को एकीकृत करने के लिए,के रूप में कदम 2.4.9 में उल्लिखित।
    4. एक मिश्रण में प्रजातियों की पहचान के लिए, संक्रमण की संख्या के लिए सहमति मापदंड संतोषजनक उन मार्कर पेप्टाइड्स रिकॉर्ड और उन बदलाव के लिए शोर करने के लिए संकेत।
    5. quantitation के लिए, संक्रमण शिखर क्षेत्र द्वारा प्रतिशत का उपयोग कर एकीकृत संक्रमण शिखर क्षेत्रों कदम 2.4.12 से सहमति के रूप में उपयोग और, मिश्रण में दो प्रजातियों से मायोग्लोबिन के प्रतिशत की गणना।
    6. नमूने में मौजूद दो मीट के रिश्तेदार डब्ल्यू / डब्ल्यू मात्रा में अनुमान लगाने के लिए मीट में होने की संभावना मायोग्लोबिन स्तर के साहित्य 18 से पूर्व ज्ञान का प्रयोग करें।

Representative Results

एक भी गतिशील मोड एमआरएम प्रयोग में प्रत्येक प्रोग्राम किया संक्रमण अलग से दर्ज की गई है एक निर्दिष्ट अवधारण समय खिड़की पर (प्रति सेकंड डिटेक्टर मायने रखता है, सीपीएस के रूप में)। इसलिए, सभी डेटा से एक प्रयोग में एकत्र, प्रत्येक संक्रमण के लिए शिखर तीव्रता को व्यक्तिगत रूप से निकाला जा सकता है। तब केवल परिमित संकेत है कि संक्रमण के लिए निर्धारित अवधारण समय खिड़की के लिए है। खिड़की के बाहर, संकेत शून्य परिभाषा के द्वारा होता है। किसी भी एक संक्रमण के लिए संकेत है, उदाहरण के लिए, 752 → 1269 घोड़े से (पेप्टाइड monoisotopic बड़े पैमाने पर 1,501.66 डाल्टन, अग्रदूत आयन मी / z 751.84 डाल्टन, आरोप राज्य = 2, टुकड़ा आयन y 13) आम तौर पर माप शोर और न केवल के साथ प्रतिस्पर्धा करने के लिए है अन्य संक्रमण चोटियों कि शायद अन्य प्रजातियों से हो सकता है से। उत्पादन इसलिए साफ चोटियों, संक्रमण के प्रति एक, एक आम अग्रदूत आयन बांटने उन बदलाव के लिए एक आम प्रतिधारण समय का एक सेट है।

चित्रा 1 डब्ल्यू डब्ल्यू / 1% का एक मिश्रण के लिए चार बदलाव के 752 → (1269, 706, 248, 1366) के सेट के लिए उत्पादन से पता चलता गोमांस में घोड़ा। के बाद से चार संक्रमण से प्रदर्शित घोड़े के साथ जुड़े रहे हैं, और शुद्ध गोमांस, भेड़ या सुअर का मांस के नमूने में अनुपस्थित रहे हैं, इन चोटियों घोड़े की उपस्थिति दर्शाता है। मजबूती के मानदंड, दो या अधिक बदलाव का एक सेट के आधार पर प्रत्येक कुछ निर्दिष्ट संकेत से अधिक करने के लिए शोर स्तर की पहचान स्थापित करता है। यह आंकड़ा इसलिए डब्ल्यू डब्ल्यू गोमांस में घोड़ा / 1% के मिश्रण में घोड़े की उपस्थिति स्थापित करता है।

कभी कभी, एक अलग संक्रमण का पता चला है। इस अग्रदूत आयन और एक भी टुकड़ा का एक मौका मैच को इंगित करता है, संभवतः एक बाहरी प्रोटीन से, सिस्टम से उम्मीद और मास स्पेक्ट्रोमीटर में programed उन लोगों के साथ। चोटी के विलक्षण प्रकृति, और एक अप्रत्याशित अवधारण समय पर इसकी घटना, सी हैएक आकस्मिक संक्रमण है कि अनदेखा किया जा सकता की gnature।

प्रत्येक संक्रमण चोटी के तहत क्षेत्र को व्यक्तिगत रूप से गणना की जा सकती है। एक उपयुक्त टुकड़ा, मांस संक्रमण शिखर क्षेत्रों के लिए घोड़े का अनुपात, उदाहरण के लिए, 752 → 1269 (घोड़ा) के लिए के आधार पर 767 → 1299 (बीफ), मिश्रण में वास्तविक मीट के अनुपात के अनुपात होगा। चित्रा 2 एक से पता चलता है बनाम गोमांस के साथ घोड़े का एक मिश्रण में घोड़े का वजन के लिए प्रतिशत वजन इन दो बदलाव के लिए चोटी के क्षेत्र द्वारा प्रतिशत की साजिश है। प्रतिशत संक्रमण शिखर क्षेत्रों मांस के वजन के लिए प्रतिशत वजन से मेल तो ढलान 1. इस साजिश में ढलान 1.03 है, यह दर्शाता है कि, ये बदलाव और CPCP जोड़ी के लिए, संक्रमण शिखर क्षेत्रों रिश्तेदार मात्रा का एक विश्वसनीय उपाय देना मिश्रण में दो मीट की। तो नमूने में घोड़े के मांस तो, के साथ अन्य कारकों अपरिवर्तित, की ढलान दो बार के रूप में गोमांस के रूप में मायोग्लोबिन में अमीर था पंक्ति एक से अधिक होना होगा।

आकृति 1
चित्रा 1% के लिए अवधारण समय बनाम 1. एमआरएम संक्रमण तीव्रता डब्ल्यू डब्ल्यू गोमांस में घोड़ा /। संक्रमण 752 → (1269, 706, 248, 1366) हैं, नारंगी, काले, नीले और हरे, क्रमशः में दिखाया गया है। मार्कर पेप्टाइड HPGDFGADAQGAMTK है। चार संक्रमण टुकड़े y 13, वाई 7, वाई 2 और y 14, क्रमशः, जहां y n पेप्टाइड सी टर्मिनल अंत से n अमीनो एसिड में गिनती अर्थ चिह्नित किया जा सकता है। शोर करने के लिए संकेत 23 से 53 चार संक्रमण खत्म करने के लिए भिन्न होता है। एक अतिरिक्त लाल रेखा 0% घोड़ा, तुलना के लिए 100% गोमांस के लिए 752 → 1269 संक्रमण को दर्शाता है। अवधारण समय का केवल गैर शून्य क्षेत्र प्रदर्शित किया जाता है। यह आंकड़ा वाटसन एट अल। 3 से संशोधित किया गया है।es / ftp_upload / 54420 / 54420fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. गोमांस में घोड़े का प्लॉट, वजन के लिए प्रतिशत वजन के रूप में, बनाम प्रतिशत संक्रमण शिखर क्षेत्र के रूप में गोमांस में घोड़ा। भूखंड पेप्टाइड्स गोमांस (767) और घोड़ा (752) और दोनों के लिए y 13 टुकड़ा आयन की जोड़ी का उपयोग करता है। एक चोटी के क्षेत्र को दर्शाता है तो तालमेल 100 ए एच / (ए एच + ए बी) है। सबसे अच्छा फिट रेखा (2 आर = 0.99) की ढलान 1.03 है। यह आंकड़ा वाटसन एट अल। 3 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

एक उपयुक्त लक्ष्य प्रोटीन के चयन के लिए महत्वपूर्ण है। एक अच्छा लक्ष्य प्रोटीन ब्याज की प्रजातियों में इसी रूपों, पर्याप्त प्रजातियों पर निर्भर अनुक्रम भिन्नता, प्रजातियों विशिष्टता, है और जीवों के भीतर सुलभ मात्रा में मौजूद हैं की जरूरत है। मिश्रण है कि प्रसंस्करण आया है (उदाहरण के लिए, गर्मी उपचार) का आकलन करने के लिए, एक प्रोटीन एक दृश्य अपेक्षाकृत कि प्रसंस्करण के लिए प्रतिरक्षा होने वांछनीय है। Myoglobin पकाया लाल मांस सहित लाल मांस, के लिए एक अच्छे उम्मीदवार हैं, लेकिन केवल संभावना नहीं है। एक बार लक्ष्य प्रोटीन का फैसला किया है, प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा प्रोटीन प्रोटियोलिसिस है। एक प्रोटीन मायोग्लोबिन से अलग अच्छी तरह से एक विकल्प प्रोटियोलिसिस प्रोटोकॉल मांग कर सकते हैं।

प्रोटोकॉल के रूप में वर्णित संदर्भ शुद्ध प्रोटीन के आधार पर एक खंड शामिल हैं। यह अवधारण समय खिड़कियां और उपयुक्त अग्रदूत और टुकड़ा आयनों की खोज करना है। इस खंड बहुत उपयोगी लेकिन जरूरी नहीं है।

चित्रा 2 में कम से कम एक के रूप में प्रकट) दे। इसका कारण यह है उत्तरार्द्ध पेप्टाइड एक अपेक्षाकृत दबा KE दरार से पैदा होती है, इस मिश्रण में घोड़े के स्तर के एक के तहत अनुमान पैदा कर रहा है। विभिन्न अमीनो एसिड के साथ शुरू इसी पेप्टाइड्स इसलिए सबसे अच्छा परहेज कर रहे हैं। अक्सर दो इसी पेप्टाइड्स से टुकड़े समान एमिनो एसिड दृश्यों है और अच्छी तरह से व्यवहार कर रहे हैं, लेकिन यह हमेशा मामला नहीं है और विधि विकास के दौरान जाँच की जरूरत है। प्रजातियों की पहचान बहुत कम रिश्तेदार quantitation की तुलना में इन मुद्दों के प्रति संवेदनशील है।

प्रोटोकॉल चार लाल मांस के लिए प्रदर्शन किया गया हैS 3। अतिरिक्त मांस प्रजातियों को शामिल किया जा सकता है, हालांकि संक्रमण शिखर आकार की गुणवत्ता, तो भी कई मार्कर पेप्टाइड्स सह Elute खराब हो सकता है, प्रभावी रूप से ध्यान केन्द्रित करना समय को कम करने और अंततः रिश्तेदार quantitation अनुमान अपमानजनक। सुधार इंस्ट्रूमेंटेशन, पहले से ही उपलब्ध है, इस में सुधार होगा। एक संबंधित मुद्दा नहीं है कि सभी मीट अलग myoglobins है। उदाहरण के लिए, घोड़ा, गधा और ज़ेबरा myoglobins समान हैं और इस तरह की सख्ती से विधि बोल रहा गोमांस में घोड़ा या गधा या ज़ेबरा का पता लगाने में ही सक्षम है। कुछ मामलों में, भले ही myoglobins समान नहीं हैं, कुछ प्रमुख पेप्टाइड्स हो सकता है। उदाहरण के लिए, कुछ भेड़ के बच्चे मायोग्लोबिन व्युत्पन्न मार्कर पेप्टाइड्स भी बकरी में दिखाई देते हैं।

एक जटिलता के इस और किसी भी अन्य प्रोटीन आधारित quantitation विधि सामना करना पड़ रहा है कि प्रोटीन के स्तर का सभी प्रजातियों भर में लगातार मान लिया जाना चाहिए या प्रोटीन पेप्टाइड का स्तर एक मिश्रण में मीट के स्तर पर तुच्छता समकक्ष करने के लिए कर रहे हैं है। मायोग्लोबिन और चार लाल मीटर के लिएखाती इस सार्वभौमिक सच नहीं है। सामान्य में स्तरों चार के निम्नतम स्तर का प्रदर्शन निर्भर प्रजातियों, सूअर का मांस के साथ हैं। इसके अलावा, मायोग्लोबिन स्तर मांस काटें और पशु उम्र के साथ बदलता रहता है। इसलिए हालांकि संक्रमण के शिखर क्षेत्रों के अनुपात की मायोग्लोबिन के अनुपात को मज़बूती से नक्शा, वास्तविक मीट के अनुपात के मानचित्रण के मिश्रण में मीट की संभावना स्रोतों के बारे में मान्यताओं पर एक अनुमान के ड्राइंग है।

दृष्टिकोण इस काम में उल्लिखित अन्य प्रकाशित योगदान से तरीकों की एक संख्या में अलग है। एक और अधिक विशिष्ट मार्ग प्रोटिओमिक तरीकों का उपयोग करने के लिए विभिन्न प्रजातियों में अलग-निर्भर मार्कर पेप्टाइड्स, जो मामले में अलग-अलग प्रजातियों के लिए मार्कर एक दूसरे 8-12,14,19 के साथ कोई विशेष संबंध के अधिकारी की पहचान है। इसके विपरीत, हम प्रजातियों पर निर्भर अनुक्रम वेरिएंट 3 अप करने के लिए ब्याज की सभी प्रजातियों के लिए आम प्रोटीन का चयन किया है। इसके अलावा हमारे रिश्तेदार quantitation रणनीति के लिए केंद्रीय जा रहा है, यह लाभ है कि नमूना हैतैयारी रणनीतियों अनुकूलित किया जा सकता। इसके अलावा, इस तरह के इसी प्रोटीन इसी तरह व्यवहार करने के लिए, उदाहरण के लिए, निकासी में या इस तरह खाना पकाने या डिब्बाबंदी के रूप में नमूने के वाणिज्यिक प्रसंस्करण में उम्मीद की जा सकती है। प्रजातियों की पहचान तो आम तौर पर, असमान मार्कर पेप्टाइड्स का पता लगाने के माध्यम से आय आमतौर पर एक या दो अनुक्रम मतभेद रखने निकट से संबंधित पेप्टाइड का पता लगाने के माध्यम से CPCP दृष्टिकोण प्रजातियों की पहचान आय में जबकि। अंत में, प्रोटीन के quantitation किसी अन्य रूप में एक प्रजाति के वजन से प्रतिशत अनुमान लगाने के लिए पारंपरिक प्रत्येक प्रोटीन को अलग से जाना जाता मानकों के आधार पर 7,14,15 का पूर्ण quantitation के माध्यम से आगे बढ़ना हो सकता है। हालांकि CPCP विधि अंशांकन तरीकों के लिए कोई जरूरत नहीं है का उपयोग कर। इसके बजाय, रिश्तेदार का स्तर, दो प्रजातियों से दो इसी पेप्टाइड्स के संकेत ताकत की तुलना पूर्ण माप मंच को पूरी तरह दरकिनार करके अनुमान है। चूंकि अंतिम लक्ष्य Ano में एक प्रजाति के वजन से एक प्रतिशत हैवहाँ एक रिश्तेदार quantitation, तो CPCP दोनों अधिक प्रत्यक्ष और दो पूर्ण quantitation माप की तुलना की तुलना में आसान है। इन सुविधाओं को कम प्रयोगात्मक बार, लगभग दो घंटा के परिष्कृत प्रोटोकॉल का उपयोग होना पूर्वानुमानित में अनुवाद, तकनीक खाद्य धोखाधड़ी का पता लगाने के दायरे में एक तेजी से निगरानी उपकरण के रूप में उपयोगी बना रही है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Uniprot database www.uniprot.org Freely accessible database of protein sequences
Skyline software www.skyline.gs.washington.edu Free software to download that enables the creation of targeted methods for proteomic studies, peptide and fragment prediction 
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com O9830
Methanol, HPLC grade Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk 10674922
Acetonitrile, HPLC grade Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk 10010010
Urea Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com U5378
Trypsin(from bovine pancreas treated with TPCK) Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com T1426
Formic acid  Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com F0507
Coomassie Plus Protein Assay Reagent Thermo Fisher Scientific www.thermofisher.com 1856210
Protein standard Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com P0914
Ultra Turrax homogeniser T25 Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk 13190693
Edmund and Buhler KS10 lab shaker
Heraeus Fresco 17 Centrifuge Thermo Fisher Scientific www.thermoscientific.com 75002420
Vacuum centrifuge RC 1022 Jouan
Plate Reader
Strata-X 33u polymeric reversed-phase cartridges 60 mg/3 ml tubes Phenomenex, Macclesfield, UK 8B-S100-UBJ
4000 QTrap triple-quadrupole mass spectrometer AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com
1200 rapid resolution LC system Agilent, Stockport, UK
XB C18 reversed-phase capillary column (100 mm x 2.1 mm, 2.6 µm particle size) Phenomenex, Macclesfield, UK www.phenomenex.com
Analyst 1.6.2 software AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com QTrap data acquisition and analysis, including peak area integration
Autosampler vials

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References

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जैव रसायन अंक 115 जैव रसायन अंक मांस प्रमाणीकरण कई प्रतिक्रिया मोड मास स्पेक्ट्रोमेट्री मायोग्लोबिन पेप्टाइड्स रिश्तेदार quantitation प्रजातियों विशिष्ट
प्रजाति निर्धारण और मिश्रण में Quantitation मांस प्रमाणीकरण करने के लिए पेप्टाइड्स एप्लाइड के एमआरएम मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग
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Gunning, Y., Watson, A. D., Rigby, N. M., Philo, M., Peazer, J. K., Kemsley, E. K. Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication. J. Vis. Exp. (115), e54420, doi:10.3791/54420 (2016).

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