Summary
Sono descritte le fasi cruciali di polimerizzazione anionica vivente di etere fenil glicidil (PheGE) di glicole metossi-polietilene (MPEG-b -PPheGE). Le micelle copolimero a blocchi risultanti (BCMS) sono stati caricati con doxorubicina 14% (% in peso) e rilascio prolungato di farmaci oltre 4 giorni sotto fisiologicamente è stato ottenuto relative condizioni.
Abstract
In questo studio, un copolimero anfifilica che comprende un blocco di formazione nucleo con gruppi fenilici è stato sintetizzato da polimerizzazione anionica vivente di fenil glicidil etere (PheGE) on metossipolietilenglicole (MPEG-b -PPheGE). Caratterizzazione del copolimero rivelato una stretta distribuzione molecolare (PDI <1.03) e confermato il grado di polimerizzazione di mPEG 122 - b - (PheGE) 15. La concentrazione critica micellare del copolimero è stata valutata utilizzando un metodo a fluorescenza stabilita con il comportamento di aggregazione valutate dalla dispersione della luce dinamica e trasmissione microscopia elettronica. Il potenziale del copolimero per l'uso in applicazioni di consegna della droga è stata valutata in modo preliminare compreso in vitro biocompatibilità, caricamento e rilascio del idrofobico antitumorale doxorubicina farmaco (DOX). Una formulazione micelle stabile di DOX è stato preparato con i livelli di farmaco di carico fino al 14% (% in peso), carico di droga efficiper proiezione> 60% (w / w) e sostenuta rilascio di farmaco per 4 giorni in condizioni fisiologicamente rilevanti (pH acido e neutro, presenza di albumina). Il livello elevato carico di droga e rilascio prolungato è attribuita alla stabilizzazione interazioni ¸-π tra DOX e il blocco di centro di formazione delle micelle.
Introduction
In mezzi acquosi, copolimeri a blocchi anfifilici assemblare per formare micelle copolimero a blocchi di dimensioni nanometriche (BCMs) che consistono di un nucleo idrofobico circondato da un guscio idrofilo o corona. Il nucleo micelle può fungere da serbatoio per l'incorporazione di farmaci idrofobi; mentre, la corona idrofila fornisce un'interfaccia tra il nucleo e il mezzo esterno. Poli (etilene glicole) (PEG) e suoi derivati sono una delle più importanti classi di polimeri e uno dei più ampiamente utilizzato nella formulazione di droga. 1-3 BCMs hanno dimostrato di essere una piattaforma drug delivery degna con diverse formulazioni basandosi su questo tecnologia attualmente in sviluppo clinico fase avanzata. 4 più comunemente, il blocco idrofobo del copolimero comprende policaprolattone, poli (D, L-lattide), poli (ossido di propilene) o poli (β-benzil-L-aspartato). 5 -9
Il gruppo di Kataoka indagato micelle sferiche formate da sone B B -. (Polyaspartic doxorubicina acido-coniugato) per la consegna di doxorubicina (DOX) 10,11 Nelle loro relazioni, hanno messo in avanti che le interazioni π-¸ tra il farmaco di polimero coniugato o PBLA e gratuito DOX agire per stabilizzare il nucleo micelle con conseguente aumento di carico di droga e la ritenzione. È accertato che la compatibilità o le interazioni tra un farmaco e il blocco di formazione nucleo sono fattori determinanti di parametri chiave relativi alle prestazioni. 12 Oltre a DOX, una serie di terapie contro il cancro includono anelli aromatici all'interno della loro struttura di base (ad esempio, metotrexate, Olaparib, SN -38).
Come risultato vi è interesse significativo nella sintesi di copolimeri che comprendono anelli benzilici nei loro blocchi di formazione nucleo. Anionico anello apertura polimerizzazione di PEG e dei suoi derivati abilitare il controllo sul peso molecolare e il risultato in materiali di bassa polidispersità in buona resa. 13,14 di etileossido ne con etere fenil glicidil (PheGE) o ossido di stirene (SO) può essere (co) polimerizzare per formare copolimeri a blocchi che formano micelle per solubilizzazione dei farmaci idrofobi. 15-18 La presente relazione descrive i passi necessari per vivere polimerizzazione anionica di fenil glicidil etere monomero in mPEG-OH come macroinitiator (Figura 1). Il copolimero a blocchi risultante e gli aggregati sono quindi caratterizzati in termini di proprietà di rilevanza usare nella somministrazione di farmaci.
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Protocol
Figura 1. Schema che mostra i nove passi chiave nella preparazione del MPEG-b -PPheGE copolimero. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
1. Preparazione dei reagenti in condizioni asciutte
- Preparazione dei reagenti.
- Pesare 15 g di mPEG-5K (M n = 5400 g / mol, PDI 1.03) e posto a 50 ° C in stufa sotto vuoto per 48 ore prima dell'uso.
- Dry 200 ml di dimetilsolfossido (DMSO) su idruro di calcio (CaH 2) (~ 1 g), posto sotto vuoto per 30 minuti, sotto argon spurgo e agitare per 48 ore prima dell'uso.
- Mettere 50 ml del monomero PheGE in un pallone asciutto e pulito (100 ml), aggiungere 1 g di CaH 2, tenuta sotto vuoto per 15 min in ghiaccio, spurgo sotto argone lasciare mescolare per 24 hr sotto argon prima dell'uso.
2. Preparazione del potassio Naftalene
- Accuratamente, tagliare piccoli pezzi di sodio (~ 1,5 g) essiccato con esano per rimuovere l'olio minerale in eccesso e aggiungere al pallone contenente il tetraidrofurano (THF) (v = 500 ml).
NOTA: I pezzi di sodio non devono essere esposte all'aria per lungo tempo a causa del rischio di incendio. - Aggiungere benzofenone (~ 5 g), spurgo con argon e sigillare il pallone (2 colli) con tappi di vetro.
- Dopo agitazione sotto argon per 24 ore, collegare il pallone a fondo tondo a un apparecchio di distillazione (Figura 2), distillare la soluzione scuro sotto argon mentre riflusso (cioè riflusso per un periodo di circa 2 ore dopo la soluzione diventa blu). Inizia a raccogliere il volume desiderato ~ 150 ml di THF chiudendo la valvola sinistra (trovato nel mezzo dell'apparecchio di distillazione).
NOTA: Se questa soluzione non diventa blu, fermare la distillazionemento, raffreddare a temperatura ambiente (RT) e aggiungere più benzofenone o di sodio e riavviare il distillazione. Questa è un'indicazione che il THF contiene ancora acqua. - In un Erlenmeyer asciutto aggiungere THF distillato (v = 100 ml) e sciogliere 3,9 g di naftalene.
NOTA: Stop distillazione, raffreddare a temperatura ambiente e aprire la valvola diritto di trasferire il volume di THF. - Come descritto al punto 2.1, tagliare piccoli pezzi di potassio (1,1 g) e aggiungere alla soluzione contenente il naftalene (concentrazione finale ~ 0,3 mol / L). Sigillare la beuta con un adattatore di lavaggio (T) (on / off) con un setto in alto e spurgo con argon.
- Dopo agitazione sotto argon per 24 ore, osservare la soluzione risultante della base naftalene potassio come colore verde scuro omogeneo.
- In condizioni inerti, rimuovere un'aliquota 5 ml della soluzione di base dalla muffola con una siringa e aggiungere 10 ml di acqua distillata. Successivamente aggiungere 1-2 gocce di fenolftaleina a questa soluzione,che trasforma la soluzione di un colore fucsia.
- Utilizzare una buretta per titolare la soluzione naftalene di potassio con una soluzione standard di acido cloridrico (0,1 N) finché la soluzione diventa incolore.
3. Materiali e le precauzioni necessarie per un'efficace Living anionici polimerizzazione
- Sistema di argon / collettore del vuoto.
NOTA: Come descritto in figura 2, un collettore doppio vetro con rubinetti cave di vetro viene utilizzato per commutare tra consegna argon e vuoto condizioni in vetro.- Collegare il serbatoio di argon (con manometro) per una colonna essiccante secco e alla linea collettore utilizzando tubi di gomma inerte. All'altra estremità della linea di argon, collegare un gorgogliatore (contenente olio minerale).
- Per i rubinetti di vetro, collegare i tubi flessibili inerti e gli aghi. Per l'altra linea del collettore, collegare una trappola vetro immersa in un Dewar fredda (riempito con ghiaccio / acqua o azoto liquido) ad una pompa ad alto vuoto.
- Apparecchio per distillazione del monomero e DMSO.
NOTA: Un conveniente (cioè, tutto in uno) Apparecchiatura per alta distillazione sotto vuoto viene impiegato (Figura 2). La vetreria a secco è realizzato con valvole alto vuoto, e condensatori built-in con una testa refrigerato interiore.- Collegare flusso dell'acqua attraverso l'ingresso (A) e di uscita (B) del gruppo di raffreddamento (lettera). Collegare l'altro ingresso / uscita (C) al collettore complanare per argon / vuoto. Aggiungere e sigillare un setto (fili metallici) alla bocca di mandata / aspirazione e collegare una cannula di acciaio inossidabile per il trasferimento di liquidi sensibili all'aria (D) (in alto / loop).
- Prima della polimerizzazione, distillare PheGE e DMSO cappe riscaldamento semisferiche a 100 ° C e 70 ° C, rispettivamente, per 2 ore sotto vuoto con agitazione. il punto di ebollizione del monomero PheGE è 254 ° C, mentre la temperatura di ebollizione per DMSO è 189 ° C a (1 atm).
- Vetreria per polymerizat anionicoionico.
- In aggiunta al sistema di distillazione, usare solo di alta cristalleria resistente al vuoto compreso rotonda palloni a fondo (certificati dal costruttore), cilindri graduata (per il trasferimento di volumi di solvente, base e monomeri), cannule, setti e fili metallici per sigillare i setti.
NOTA: per polimerizzazione, calore vivente accuratamente (sotto vuoto) e raffreddare la vetreria sotto flusso di argon prima dell'uso. Mantenere la pistola termica ad una distanza ~ 10 cm dal vetro.
- In aggiunta al sistema di distillazione, usare solo di alta cristalleria resistente al vuoto compreso rotonda palloni a fondo (certificati dal costruttore), cilindri graduata (per il trasferimento di volumi di solvente, base e monomeri), cannule, setti e fili metallici per sigillare i setti.
Figura 2. Montaggio e fasi di distillazione / trasferimento chiave. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.4. Descrizione dei passaggi chiave di Living anionico di polimerizzazione: la distillazione e di trasferimento
- Pesare mPEG-5K (2 mmol, 10 g) in un f seccalask / Schlenk (forno) contenente una barra agitatrice e sigillare l'adattatore di lavaggio (T) (on / off) con un setto in alto.
- Collegare il pallone al collettore e spurgare il pallone per 2-3 minuti con vampate di argon. Ruotare la valvola in posizione di vuoto per spurgare il pallone.
- Ruotare il pallone manualmente e asciugare il recipiente di reazione in modo omogeneo con un asciugacapelli (pistola ad aria calda) fino a Mpeg-5K si scioglie.
NOTA: Tenere la pistola di calore ad una distanza ~ 10 cm dal pallone. - Dopo 1 minuto, eliminare il vuoto ruotando la valvola sul collettore verso la posizione argon con diversi scatta veloci.
NOTA: Un flusso continuo di argon deve essere osservato nel gorgogliatore. Quando il flusso è continuo, la valvola rimane in posizione argon. fasi di riscaldamento e raffreddamento ripetere due volte per rimuovere ogni traccia di umidità. - Mantenere il macroinitiator polimerico sotto vuoto per ~ 2 ore e sotto argon prima dell'inizio della reazione.
- Montare due distillazione apparati alto vuoto sotto il cofano (figure 2); uno per la distillazione di DMSO e uno per la distillazione del monomero (PheGE).
- Collegare le beute separate contenenti il DMSO e monomero ai due apparati e installare ciascuno su un mantello riscaldante emisferica (o in un bagno d'olio). Collegare acqua fredda all'inizio dell'apparecchiatura (in / out) e al collettore (argon / vuoto).
- Assicurarsi che ogni apparato è sicuro e ben sigillato. Inserire il vuoto mediante la valvola.
NOTA:. Come descritto al punto 3.3, ripetere il riscaldamento e il raffreddamento passi due volte per rimuovere ogni traccia di umidità. - Impostare il riscaldamento attraverso un regolatore di temperatura e iniziare agitazione delle soluzioni. Dopo 2 h di circolazione / distillazione di DMSO, chiudere la valvola del vuoto elevato (trovato nel mezzo dell'apparecchio di distillazione) per raccogliere circa 20 ml di soluzione (per lavare l'interno dell'apparecchio). Quindi, rilasciare la frazione nel pallone e ripetere l'operazione di nuovo per garantire la purezza della frazione desiderata che è collected tardi.
- Riscaldare il pallone contenente la MPEG-5K (sotto vuoto) con la pistola di calore fino a quando il polimero (MPEG-5K) si scioglie. Spurgare di nuovo con argon.
NOTA: La procedura contribuirà alla dissoluzione dopo il trasferimento del DMSO. - Dopo 2 ore, chiudere la valvola di alto vuoto e raccogliere il volume di solvente (V DMSO = ~ 100 ml). Arrestare riscaldamento ed eliminare il vuoto dal collettore. Rilasciare argon (da automatici) nella camera come descritto sopra.
- Sotto una pressione positiva di argon, collegare un lato della cannula (attesa presso il rubinetto dell'apparato) ad un cilindro graduato o direttamente al pallone contenente MPEG-5K (se distillazione ha laurea) e, immergere l'altra estremità attenzione nella frazione distillata di fresco.
- Utilizzando pressione argon, guidare il DMSO attraverso la cannula nel pallone di reazione. Collegare un gorgogliatore in più per il pallone (o cilindro, se necessario, per la misurazione) e, chiudere il rubinetto di vetro collegato al the gorgogliatore sul lato opposto del collettore.
NOTA: Quando un lato di una cannula viene rimossa per il trasferimento, assicurarsi che sia applicata una pressione positiva argon. - Per evitare incidenti causati dalla pressione argon, aprire il rubinetto di vetro per 1-2 secondi e richiudere per continuare il flusso di DMSO (ripetuto una volta per 0,5 min) fino al completo trasferimento è completato. Riaprire il rubinetto di arresto al termine.
NOTA: La stessa procedura deve ora essere seguita per la distillazione e la raccolta del monomero. Il solvente e monomero non possano essere rilevati contemporaneamente. - Transfer 5 ml di 0,3 M naftalene potassio tramite cateterismo in un cilindro graduato sigillata da un setto con cannula (loop).
NOTA: La stessa precauzione, come descritto nella nota 4.13. pressione argon positivo deve essere mantenuta prima dal pallone naftalene potassio al cilindro e quindi dal cilindro al pallone di reazione per evitare / contaminazione dell'acqua dell'aria. - Inserire un altro ago dalla manifold nel cilindro (argon). Rimuovere la cannula collegata al sistema di distillazione con attenzione e inserire rapidamente nel pallone di reazione.
NOTA: Utilizzare questa tecnica per il trasferimento di base e monomero. - Aggiungere il calo di base a goccia fino a quando la soluzione diventa scuro. Dopo la lenta scomparsa di colore, aggiungere un'altra parte fino a quando il colore scuro appare di nuovo, e ripetere fino a quando il pieno trasferimento.
- Trasferire il volume desiderato di monomero (V PheGE = 5 ml) per raggiungere un grado di polimerizzazione di PPheGE ~ n = 18-20.
- Lasciare la reazione per 48 ore a 80 ° C sotto atmosfera di argon con agitazione costante per garantire la completa polimerizzazione.
- Quench la reazione mediante aggiunta di gocce di HCl 1 N in metanolo (misurati utilizzando carta tornasole (pH neutro)) e osservati da una scomparsa colore.
- Estrarre il naftalene dalla soluzione DMSO con esano (3 x 50 ml). Rimuovere il DMSO per distillazione sotto vuoto ~ 70 ml (stesso apparato). tubarel giù la soluzione liquami e aggiungere 50 ml di THF.
- Rimuovere il sale dalla soluzione slurry per centrifugazione a 5.000 xg per 10 min. Trasferire il surnatante e aggiungere goccia a goccia per 500 ml di etere etilico freddo.
- Raccogliere il precipitato mediante filtrazione o centrifugazione (ripetere due volte) ed essiccare sotto vuoto a 30 ° C per 24-48 ore (resa 85%).
NOTA: Il copolimero è ora pronto per la caratterizzazione.
5. Caratterizzazione dei copolimeri
- Pesare 5-10 mg di copolimero (record di massa reale) in una padella di campione di alluminio e sigillare ermeticamente con il coperchio in alluminio. Carico campione pan e pan di riferimento (vuoto) nel calorimetro a scansione differenziale.
- Programma un metodo ( "caldo / freddo / calore") Ciclo: 1) il calore da 40 ° C a 100 ° C a 10 ° C / min, 2) fresco a -70 ° C a 10 ° C / min, 3) il calore a 100 ° C a 10 ° C / min. Ripetere 2) e 3) due volte. Determinare il punto di fusione (T m), in criallization (T c) e temperature di transizione vetrosa (Tg), e calore di fusione (d H f) dalle tracce termiche del terzo ciclo (se applicabile).
- Sciogliere i polimeri in THF (2 mg / ml) e filtrare attraverso un filtro di PTFE da 0,2 micron. Iniettare il campione in un sistema di cromatografia a permeazione (50 microlitri) e utilizzare il tempo di ritenzione del campione e una curva di calibrazione prodotta utilizzando una serie di standard di polistirene per determinare il peso molecolare del polimero. 19
- Sciogliere i (co) polimeri (15 mg / ml) in DMSO d 6 per 1 H NMR spettroscopia. 19
- Determinare la concentrazione micellare critica (CMC) del copolimero con 1,6-difenil-1,3,5-esatriene (DPH) come sonda a fluorescenza. 9
- Preparare una soluzione DPH magazzino in THF (2.32 mg / L) al buio e aggiungere 100 ml di questa soluzione, a ciascuna di una serie di fiale.
- Prepare una soluzione di copolimero magazzino in THF e aggiungere aliquote di uguale volume di (2 ml) alla serie di flaconi (ciascuno contenente una aliquota della soluzione madre DPH) con concentrazioni copolimero finali che variano da 0,01 a 1,000 mg di copolimero / ml.
- Successivamente, vortice copolimero-DPH soluzioni e aggiungere goccia a goccia a 10 ml di acqua bidistillata agitando bar. Le soluzioni devono poi essere mescolato vigorosamente al buio per 48 ore sotto un flusso di azoto per consentire lenta evaporazione del THF. La concentrazione finale di DPH in ciascuna soluzione è 0.232 mg / L.
- Misurare l'emissione di fluorescenza dei campioni a 430 nm (λ ex = 350 Nm) con una micropiastra spettrofluorimetro doppia scansione e la trama di fluorescenza contro log [polimero]. L'intervallo fra le due piste lineari fornisce il valore CMC per il copolimero.
6. Procedura per il caricamento di doxorubicina in BCMs
- Sciogliere 12 mg di DOX in 1 ml di acetonitrile, aggiungere 10 ml di trietilammina e lasciare che la soluzione mescolare al buio per 2 ore.
- Sciogliere il copolimero (45 mg) in 1 ml di THF e mescolare per lo stesso periodo di tempo. Aggiungere la soluzione di copolimero alla soluzione DOX e risciacquare flaconcino contenente copolimero residua con un volume aggiuntivo di THF (0,5 ml).
- Aggiungere la miscela copolimero-farmaco (2,5 ml) goccia a goccia ad una fiala (20 ml) contenente 15 ml di soluzione salina allo 0,9% (NaCl) con agitazione.
- Trasferire la soluzione in un sacchetto di dialisi (3,5 kDa tagliato) e dializzare contro fisiologica 0,9% (500 ml).
NOTA: Modificare la salina esterna dopo 6 ore e lasciare che la dialisi continua per 24 ore con agitazione al buio a temperatura ambiente. - Trasferire il dializzato in un tubo da 50 ml e centrifugare a 5000 xg per 15 min.
- Trasferire il supernatante in un sistema di ultrafiltrazione (con capacità di 10 ml) contenente una membrana di dialisi (cut off 10 kDa). Mettere l'adattatore mescolando nel sistema di ultrafiltrazione, chiudere il coperchio e aperto cometream dell'azoto.
- Concentrare la soluzione BCM ad un volume di 4 ml e aggiungere 6 ml di soluzione salina fresca e ripetere la procedura due volte.
- Concentrare la soluzione BCM a 4 ml, lavare la camera con 0,5 ml di soluzione salina ed aggiungere alla soluzione. Conservare in fiale marrone a temperatura ambiente in un ulteriore scuro uso prima.
7. Valutazione di doxorubicina Caricamento in DOX-BCMs
- Sciogliere DOX-BCM in dimetilformammide (100 ml a 400 ml) per distruggere le micelle e diluire in soluzione acquosa di HCl (0,1 N) prima della valutazione (100 ml in 900 ml di HCl 0,1 N).
- Misurare carico di droga a 490 nm utilizzando un sistema da banco micropiastra spettrofotometrica. Utilizzare le seguenti equazioni per determinare la capacità di carico di droga (DLC) e l'efficienza della droga di carico (DLE):
DLC (wt%) = (peso di farmaco caricata / peso totale di BCMs) x 100%
DLE (%) = (peso di farmaco carico / peso di farmaco nei mangimi) x 100%
8. Valutazionein vitro di rilascio di DOX da DOX-BCMs
- Indagare il rilascio di DOX da BCMs a 37 ° C in 0,1 M tampone fosfato salino (PBS, pH 7,4) contro PBS pH 7,4 contenente 0,1% (w / v) Tween 80, BCMs + BSA (50 mg / ml) contro PBS pH 7,4 e 0,1 M di acetato-tampone a pH = 5,5. 20,21
- Diluire la formulazione BCM-DOX (700 microlitri) nella soluzione tampone (2,3 ml) per determinare una quantità totale di ≈ 0,6-0,7 mg di DOX nel sacchetto di dialisi.
- Posizionare la soluzione nel sacchetto di dialisi, sigillare con clip e immergere il sacchetto in 200 ml dei rispettivi supporti esterni.
- Rimuovere 2 ml della soluzione esterna del sacchetto di dialisi in momenti predeterminati e sostituirlo con lo stesso volume di tampone fresco.
- Conservare le aliquote rimosse a -20 ° C prima dell'analisi mediante spettrofotometria UV-Vis (Abs 490 nm). La percentuale cumulativa di farmaco rilasciato (E R) può essere calcolata utilizzando la seguente equazione:
NOTA: Dove m DOX rappresenta la quantità di DOX nei BCMs, V 0 è il volume totale dei mezzi di distribuzione (200 ml), V t è il volume del supporto sostituiti (V t = 2 ml), Ci è la concentrazione prima della correzione, e C n rappresenta la concentrazione di DOX nel campione.
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Representative Results
Figura 3. Illustrazione della polimerizzazione anionica fenil glicidil etere sull'MPEG macroinitiator produrre MPEG-b - (PheGE) 15 per la preparazione di micelle copolimero a blocchi per il caricamento di doxorubicina La rappresentazione la deprotonazione del gruppo ossidrile di mPEG utilizzando naftalene potassio. come un radicale-anione, seguita dalla polimerizzazione del monomero fenil glicidil etere (PheGE). Immagine microscopia elettronica a trasmissione rappresentante (TEM) dei BCMs colorate con acetato di uranile (1% w / v) e la distribuzione delle dimensioni delle micelle come determinato dalla dispersione della luce dinamica (DLS). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
figura 3, polimerizzazione anionica fenil glicidil etere sull'MPEG macroinitiator stato usato per preparare il copolimero a blocchi (micelle DOX-MPEG-b - (PhGE) 15 per intrappolamento doxorubicina Una stretta distribuzione del peso molecolare per l'MPEG-b -. (PhGE) 15 copolimero è stata confermata mediante GPC (PDI = 1.03) e il grado di polimerizzazione è stato determinato mediante analisi 1 H NMR (Figura 4) [σ = 7,2 ppm (m , 2H meta, fenile 2 (= CH -)), σ = 6.8 ppm (d, 3H, 2 orto e para 1 (- CH -), σ = 3,95 ppm (m, 2H, CH 2 O- -CH-) ] con il gruppo metilico fine del mPEG utilizzato come picco di riferimento (σ = 3.22 ppm (s, 3H).
Figura 4. Caratterizzazione ed analisi. A) Analisi GPC di MPEG e copolimero in THF. B) 1 HSpettri NMR di mPEG5K (spettro superiore) e MPEG-b -. (PheGE) 15 (spettro inferiore) in d 6 -DMSO Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1. Caratteristiche del copolimero.
In mezzi acquosi, copolimeri a blocchi anfifilici come MPEG-b - (PheGE) 15 assemblano per formare micelle che consistono di un nucleo idrofobico circondata da un guscio idrofilo. La CMC del copolimero è stata misurata utilizzando un metodo a fluorescenza stabilita. La CMC di MPEG-b - (PheGE) 15 è stato determinato in ~ 9 mg / ml (Figura 5A nel riquadro). Trasmissione microscopia elettronica confermato morfologia sferica per gli aggregati copolimero e quindi dinamicalight scattering (Figura 3 e Tabella 2) è stato impiegato per valutare il diametro idrodinamico (D h ~ 25 nm). Come mostrato nella figura 6-a, L929 cellule di fibroblasti di topo sono state esposte a MPEG-b - (PhGE) 15 BCMs ed è stata osservata alcuna citotossicità dopo il periodo di incubazione 24 ore.
Figura 5. L'intensità della fluorescenza e la caratterizzazione CMC. A) Plot dell'intensità di fluorescenza di DPH in funzione della concentrazione di MPEG-b - (Phe) 15 copolimero a blocchi. Inserto mostra la fase iniziale di aggregazione del copolimero a blocchi a 0,1-10 mg / ml. B) trama di valori CMC ottenuti dalla letteratura per una serie di copolimeri con gruppi fenilici sul blocco di formazione nucleo. I quadrati rossi rappresentano i valori calcolati per l'energia Gibbs di topillization delle corrispondenti copolimeri (± 0,5 kJ / mol). 22,25-28 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 2. Caratterizzazione dei BCMs preparato secondo il metodo di dialisi.
Solubilizzazione del farmaco nel BCMs è influenzata dalla solubilità acquosa del farmaco e la propensione per l'interazione tra il farmaco e si e / o il blocco di formazione nucleo delle micelle. Nella sua forma di sale, DOX è relativamente solubile (~ 10 mg / ml) in acqua. Così per caricare nelle BCMs, DOX viene sciolto in acetonitrile e neutralizzata con TEA per ottenere la base libera (3 eq.). Con un pKa di 8,5, DOX diventa relativamente insolubili in condizioni basiche guida incapsulamento nelle BCMs con stabilizione da interazioni di stacking π-¸ (MPEG-b - (PhGE) 15). Come descritto in letteratura, capacità di carico simili per DOX a DOX-MPEG-b -. (PhGE) 15 sono stati riportati con un valore medio del 14% (w / w) 21-24 Dopo ultrafiltrazione, si è riscontrato che le concentrazioni di copolimero a partire da 10 mg / ml solubilizzato con successo fino a 1,6 mg DOX / ml. L'efficienza della droga di carico è salito al 52% (w / w) per l'MPEG-b - (PhGE) 15 BCM (Tabella 2). I profili di rilascio di DOX dalle BCMs in diversi media sono stati esaminati (Figura 6c).
Figura 6. citotossicità e di rilascio del farmaco cinetica. A) valuzione della citotossicità in cellule L929 del mouse fibroblasti di MPEG-b -. (PheGE) micelle 15 copolimero come determinato con il saggio MTS a seguito di un periodo di incubazione 24 ore (n = 3 singoli esperimenti, SD <10%) B) spettri di emissione normalizzato di DOX libero e micelle DOX-caricati in PBS, pH 7,4 a 10 mg ml di concentrazione / DOX. La lunghezza d'onda di eccitazione è di 480 nm e lo spettro di emissione sono raccolti da 500-700 nm C) i profili di uscita della DOX dal blocco MPEG-b -. (PhGE) 15 copolimero micelle (quadrati) in PBS 0,1 M pH 7,4, (cerchi) in PBS 0,1 M pH 7,4 contenente BSA 50 mg / ml (nel sacchetto) e (triangoli) in acetato di Na + tampone 0,1 M pH 5,5 e (giù triangoli) libera DOX (n = 2) in PBS pH 7,4. (per ogni condizione, n = 3 singoli esperimenti, SD <10%). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figure.
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Discussion
Grazie al buon controllo che la polimerizzazione anionica fornisce più di peso molecolare è uno dei processi più applicati nell'industria per la preparazione di polimeri a base di monomeri di ossirano (PEG e PPG). Le condizioni ottimali e stringenti devono essere utilizzati per la polimerizzazione di successo da raggiungere. la purificazione rigorosa di tutti i reagenti e apparecchi adeguata sono essenziali per il personaggio vivente della sintesi. Limitazioni della configurazione attuale sono per lo più associati con la tecnica di trasferimento che si basa su incannulamento. Utilizzando la pressione del caso, l'incannulamento è una tecnica sicura scala di laboratorio per l'ambiente accademico. L'applicazione di queste precauzioni fornirà una migliore riproducibilità e controllo durante il processo di polimerizzazione (basso PDI). Inoltre, queste procedure di trasferimento e di depurazione possono essere utilizzati per la preparazione di copolimeri, quali MPEG-b -PCL, MPEG-b -PLLA, e MPEG-b -page. 19,29 Tuttavia, questa comoda procedure può non essere adeguato per polimerizzazione di monomeri alcuni che richiedono condizioni più rigorose (ad esempio stirene). In alternativa, la tecnica di break-guarnizione è generalmente preferito per la polimerizzazione anionica. 30 Per controllare questi passi nell'industria, sistemi analoghi (acciaio / vetro) sono collegati tra loro tramite valvole ermetici.
Per monomeri ossirano, il meccanismo generale è un attacco nucleofilo del oxyanion (ione libero o coppia ionica) sull'anello ossirano, che porta ad anello polimerizzazione apertura. Tuttavia, a seconda della natura dei monomeri ossirano sostituiti, alcuni monomeri possono non polimerizzare o non possono essere polimerizzati ad alto peso molecolare. Questo tipo di polimerizzazione non tollera componenti acidi o basici, tra il monomero stesso, specie solvente o altre che portano a reazioni di terminazione e / o di trasferimento di catena nel mezzo (perdita del controllo della reazione). Per produrre un fenile cuscinetto PEGylated copolimero a blocchigruppi di polimerizzazione anionica, alternative alla fenil glicidil etere monomero può essere trovato: stirene, ossido di stirene o allil etere glicidil seguita da una reazione di Michael radicale benzile mercaptano sono opzioni. mPEG può essere preparato per condensazione del monomero di etilene e quindi polimerizzato nelle stesse condizioni come descritto in questo documento, utilizzando un iniziatore idrossilato (ad esempio, metanolo). Tuttavia, MPEG di vari pesi molecolari a bassa PDI è disponibile in commercio.
Per evitare residui di acqua, il macroinitiator (ad esempio, MPEG-OH) deve essere ben secco pre-essiccamento in stufa, seguita dalla procedura di calore pistola-essiccazione. Le reazioni possono essere eseguite in solventi aprotici polari, coordinando solventi, o in massa. Quando la polimerizzazione richiede condizioni specifiche, come l'elevata temperatura, solventi a polarità forte di THF devono essere utilizzati, come DMSO, diglima o HMPA. Come descritto nel protocollo (sezione 4 2). DMSO è igroscopico e se la distillazione non è ben condotto, le tracce di acqua può inattivare la specie attiva. Altri solventi possono essere utilizzati, ma DMSO ha una capacità dissolvente alto per cationi, capacità dissolvente basso per anioni e permette ad alta temperatura di polimerizzazione. 31,32 DMSO è un ottimo solvente per la base catalizzata polimerizzazione delle olefine epossidi e con forti sostituenti elettroni ritiro. Iniziazione della polimerizzazione può essere ottenuto generazione in situ di iniziatori alcossido potassio attraverso titolazione MPEG-OH con una soluzione diluita di naftalene potassio. 33 E 'importante preparare accuratamente la soluzione di naftalene potassio e di titolare la soluzione con acido prima il suo uso. Infatti, se la concentrazione di naftalene potassio è sotto o sovrastimato, il macroinitiator può formare aggregati o non riescono a attivare completamente iliniziatore e, a sua volta la polimerizzazione può essere compromessa. Quando viene aggiunto goccia a goccia la naftalene potassio, la lenta scomparsa del colore fornisce controllo visivo sul consumo della base dal promotore. In queste condizioni, lo scambio protonico rapida tra i gruppi ossidrilici (dormiente) ed alcossidi (attivo) assicura una polimerizzazione controllata del monomero. 13
Il comportamento aggregazione di copolimeri a blocchi di composizione simile a MPEG 122 - B -. (PhGE) 15 sono stati indagati da diversi gruppi con i valori riportati CMC compresi tra 1 e 10 mg / ml 25,27,28,34-36 valori CMC per un copolimero specifico può variare a seconda del metodo specifico impiegato per la determinazione. In questo studio, un metodo basato sulla fluorescenza è stato impiegato con DPH scelto come sonda dato che risulta solo in un segnale di fluorescenza, una volta inseriti nelle BCMs (Figura 5A riquadro). Figura 5Binclude i valori CMC ottenuti per i vari copolimeri a blocchi con gruppi fenilici. Come mostrato, i valori CMC dei copolimeri variano a seconda della natura della catena polimerica recanti gruppi fenilici e grado di polimerizzazione. 25,27,28,34-36 Lo scambio di catene copolimeriche tra le micelle e mezzo esterno dipende lo stato del nucleo micelle così come il parametro interazione Flory-Huggins tra i due blocchi e il solvente. La temperatura di transizione vetrosa (Tg) di bulk omopolimero PPheGE si caratterizza per essere inferiore a quello del PS rinfusa. 37 A causa della natura vetrosa di PS, copolimeri con un alto grado di polimerizzazione di PS (n> 35) possiedono un nucleo vetroso a RT (T g ~ 80 ° C). 38
Termodinamicamente, due approcci principali sono state avanzate per descrivere il processo micellizzazione, vale a dire, il modello di separazione di fase (separazione di fase alla CMC), e il modello di massa-azione (association-dissociazione equilibrio micelle / unimers). 39 Secondo entrambi gli approcci, l'energia standard di Gibbs cambio (DeltaG ◦) per il trasferimento di 1 mole di amphiphile dalla soluzione alla fase micellare (DeltaG ◦ energia libera di micellizzazione), in assenza di interazioni elettrostatiche, è dato da DeltaG ◦ = RT ln (CMC). 39 Come mostrato in figura 5B, i valori di CMC e DeltaG ◦ sono in accordo con i valori ottenuti per i copolimeri che sono simili nella composizione (in termini di totale copolimero M W e rapporto tra idrofobico per lunghezza del blocco idrofilo) per MPEG-b - (PhGE) 15. Come illustrato nella Tabella 1, l'analisi DSC della MPEG-b - (PhGE) 15 materiale sfuso copolimero confermato un singolo T m a 51 ° C che è attribuito al blocco idrofilo ed è depressa rispetto allaalone mPEG (60 ° C). In soluzione, si presume che i nuclei di MPEG-b -PS micelle copolimeriche, con blocchi di polistirene di lunghezza simile a quella di PhGE in MPEG-b - (PhGE) 15, cominciano a diventare mobili a temperatura fisiologica (cioè, 37 ° . C) 38,40 Pertanto, l'MPEG-b - (PhGE) 15 BCM probabilmente in possesso di un nucleo relativamente mobile che consente il movimento locale ambiente e temperature fisiologiche.
In questo studio dialisi ed ultrafiltrazione sono stati utilizzati come un mezzo conveniente per rimuovere farmaco libero e per aumentare la concentrazione del farmaco / copolimero per successive applicazioni in vivo. In alternativa, liofilizzazione può essere impiegato per concentrare la formulazione; Tuttavia, questo richiede l'ottimizzazione compresa eventuale aggiunta di stabilizzanti (ad esempio, PEG, destrosio) per migliorarne la bagnabilità per la ricostituzione. La risultante DOX-MPEG-b - (PhGE) 15 BCM ha mostrato s similiprofili di rilascio ustained (PBS 7.4) ai sistemi BCM sviluppati da Kataoka e coll. 21 in PBS a pH 7,4, meno del 10% del totale del farmaco è stato rilasciato entro sei ore mentre più del 95% della libera DOX viene rilasciata dalla dialisi bag entro lo stesso periodo di tempo. rilascio prolungato a pH neutro indica una buona stabilità della formulazione per il periodo di quattro giorni.
Siero di sangue umano è costituito da circa il 7% di proteine, due terzi dei quali è l'albumina. 41 Pertanto, al fine di simulare in vivo condizioni di rilascio del farmaco viene comunemente valutata in soluzioni tampone contenenti concentrazioni fisiologicamente rilevanti di questa proteina. Nel presente studio, BSA è stato incluso nel sacchetto di dialisi ad una concentrazione di 50 mg / ml. In presenza di albumina, il rilascio di DOX dalle BCMs aumentata a circa il 30% dopo 4 giorni di incubazione a 37 ° C. Rilascio di DOX dalle BCMs in tampone a pH 5,5 confermato che protonatione di DOX in queste condizioni si traduce in un aumento di rilascio del farmaco dopo 72 ore e questo aumenta fino al 60% dopo 4 giorni. Nel complesso, i risultanti DOX-BCM hanno mostrato risultati promettenti in vitro, simile o equivalente ad altre formulazioni BCM di DOX presenti in letteratura, e quindi incoraggiare la valutazione supplementare in vivo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/HAMF12 | Gibco, Life Technologies | 12500 | Supplemented with 10% FBS. Warm in 37 °C water bath. |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Sigma-Aldrich | T4049 | Warm in 37 °C water bath |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F1051 | Canada origin |
| MDA-MB-468 cell line | ATCC | HTB-132 | |
| MTS tetrazolium reagent | PROMEGA | G111B | |
| Phenazine ethosulfate (PES) | Sigma-Aldrich | P4544 | >95% |
| mPEG5K (Mn 5,400 g/mol) | Sigma-Aldrich | 81323 | PDI=1.02 |
| Dimethylsolfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5% |
| Naphthalene | Sigma-Aldrich | 147141 | >99% |
| Phenyl glycidyl ether | Sigma-Aldrich | A32608 | >85% |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich | 427551 | >99% |
| Potassium | Sigma-Aldrich | 451096 | >98% |
| Tetrahydrofuran | Caledon Laboratory Chemicals | 8900 1 | ACS |
| Hexane | Caledon Laboratory Chemicals | 5500 1 | ACS |
| Calcium hydride (CaH2) | ACP | C-0460 | >99.5% |
| Diethyl Ether | Caledon Laboratory Chemicals | 1/10/4800 | ACS |
| Microplate reader | BioTek Instruments | ||
| Differential scanning calorimetry (DSC) | TA Instruments Inc | DSC Q100 | |
| Gel permeation chromatography (GPC) | Waters | 2695 separation moldule / 2414 detector | 2 Columns: Agilent Plgel 5 µm Mixed-D |
| NMR spectroscopy | Varian Mercury 400MHz | ||
| Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151858 | 99.96% |
| DMSO-d | Sigma-Aldrich | 156914 | 99.96% |
| Vaccum pump | Gardner Denver Welch Vacuum Tech, Inc. | Ultimate pressure 1x10-4 torr | |
| Drierit with indicator, 8 mesh | Sigma-Aldrich | 238988 | Regenerated at 230 °C for 2 hr |
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