Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Arbeide med Auditory HEI-OC1 Cells

Published: September 3, 2016 doi: 10.3791/54425
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Head and Neck Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Introduction

Hus Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) celler er avledet fra det auditive organ i en transgen muse 1,2. Inkubasjon av en celle fra denne transgene mus ved 33 ° C / 10% CO 2 (permissive betingelser) induserer ekspresjon av et gen immortalizing som utløser de-differensiering og proliferasjon akselerert; flytting av cellene til 39 ° C / 5% CO 2 (ikke-permissive betingelser) føre til redusert proliferasjon, differensiering og, i det minste i tilfellet med HEI-OC1, celledød 2,3.

HEI-OC1 celler ble klonet og karakterisert i vårt laboratorium over et tiår siden, og innledende studier indikerte at de uttrykker spesifikke markører for cochlea hårceller som Prestin, myosin 7a, Atoh1, BDNF, calbindin og calmodulin, men også markører for å støtte cellene som connexin 26 og fibroblast-vekstfaktor-reseptor (FGF-R) 2. Det ble derfor foreslått at HEI-OC1 kunne representere en common stamfar for sensoriske og støtte celler av orgel av Corti to. Parallelle studier ga sterke bevis for at arketypiske ototoksiske stoffer som cisplatin, gentamicin og streptomycin indusert caspase-3-aktivering i disse cellene, mens narkotika betraktes som ikke-ototoksisk, som penicillin, ikke 2,3. Derfor ble denne cellelinje foreslått som et in vitro-system for å undersøke de cellulære og molekylære mekanismer som er involvert i ototoxicity og for screening av potensielle ototoxicity eller otoprotective egenskaper av nye farmakologiske midler. Det er anslått at HEI-OC1 celler har blitt brukt i mer enn hundre og femti studier publisert i løpet av de siste ti årene.

Mens du ser på potensialet pro-apoptotisk effekt av ulike rusmidler var den store målet for de fleste studier med denne cellelinjen, har andre viktige celleprosesser som autofagi og senescence akkurat begynt å bli undersøkt i HEI-OC1 celler 4-7. Jegna fersk studie fra vårt laboratorium 8, brukte vi HEI-OC1 celler til å samle et omfattende sett av data om celledød, overlevelse, spredning, alderdom og autofagi indusert av forskjellige farmakologiske stoffer som brukes ofte i klinikken. Vi har også sammenlignet noen av responsene til HEI-OC1-celler med de fra HEK-293 (humane embryonale nyreceller) og HeLa (human epitel-celler) som fikk identisk behandling. Våre resultater viste at HEI-OC1-celler reagerer på hvert medikament på en karakteristisk måte, med en særegen dose- og tidsavhengig følsomhet til minst en av de mekanismene som studeres. Vi har også lagt vekt på at studie som en korrekt tolkning av de eksperimentelle resultatene vil kreve å utføre parallelle studier med mer enn en teknikk 8.

I en annen studie undersøkte vi bruken av HEI-OC1 celler for å vurdere den funksjonelle responsen Prestin, motoren protein av cochlea ytre hårcellene (OHCs) 9 + K + ATPase, som translocated fra plasmamembranen til cytoplasma uten vesentlige endringer i total celle-ekspresjon. I tillegg demonstrerte vi at P-HEI-OC1 celler har en robust NLC forbundet til Prestin motorisk funksjon, som reduseres når tettheten av Prestin molekyler tilstede i plasmamembranen økt. Til sammen disse resultatene støtter sterkt nytten av HEI-OC1 celler for å undersøke auditiv proteiner.

I denne videoen artikkelen beskriver vi hvordan kultur HEI-OC1 celler, hvorfor det er praktisk å bruke celler vokser givende forhold (P-HEI-OC1) for cytotoksisitetstester studier, hvordan man skal vurdere mekanismen / s legemiddelindusert cytotoksisitet og hvordan å utføre elektrofysiologiske studier (f.eks patch-clamp, ikke-lineær kapasitans (NLC)) for å undersøke funksjonelle egenskaper Prestin, den molekylære motor av cochlea OHCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cell Culture

Merk: Alle celledyrknings protokoller må utføres ved hjelp av riktig cellekultur teknikker (for referanse se de første 3 kapitler i cellebiologi: Et laboratorium Handbook, Volume I 10). HEI-OC1-celler ikke krever noen ekstra belegg eller behandling av cellekulturskåler for riktig tilslutning og vekst. Svært viktig: ikke bruk glass retter til cellekultur formål; fenotype og biologiske respons av cellene til farmakologiske medikamenter vil endre seg (G Kalinec & F Kalinec, upublisert); konvensjonelle plast cellekultur retter anbefales (se tabell av materiell / utstyr). Vær spesielt oppmerksom på aseptiske teknikker for å unngå forurensing, men aldri bruke antibiotika (for eksempel ampicillin eller streptomycin) med HEI-OC1 celler. Om nødvendig, bruk amfotericin B. Mens HeLa og HEK-293 celler som har vært anvendt som kontroll i tidligere studier med HEI-OC1 8, en hvilken som helst annen cellelinje kunnevære akseptable for dette formål.

  1. Gjenoppliving av Frozen HEI-OC1 Cells
    Merk: Denne protokollen kan også brukes sammen med andre cellelinjer fra den samme transgene mus utviklet i vårt laboratorium, for eksempel OC-3r, fra organ Corti 11,12, og SV-1 r, fra stria vascularis 13,14.
    1. Fjern en ampulle med cryopreserved HEI-OC1 celler fra flytende N2, og legg den i et vannbad ved 37 ° C. Senk bare den nedre halvdelen av flasken, og la den tine til bare en liten mengde is igjen i hetteglasset. Tørk av glasset med 70% alkohol.
    2. Pipette cellene fra ampullen og levere hele volumet (~ 1,5 x 10 5 celler / ml) langsomt, dråpe for dråpe, i et 15 ml konisk rør inneholdende 10 ml av en forvarmet vekstmedium, slik som Dulbeccos modifiserte Eagles medium ( DMEM), supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS).
    3. Fjerne DMSO ved sentrifugering av røret ved 300-500 x g i 5 min, forkaster than supernatanten og re-suspendering av cellene i 9 ml friskt vekstmedium (DMEM + 10% FBS). Disaggregert klumper eller ark av celler ved fluks og tilbakeløp av de suspenderte celler, fra pipetten til mediet og vice-versa, tre til fire ganger med spissen av pipetten berøre bunnen av røret.
    4. Plasser det totale volum av celler suspendert i vekstmedium i 100 mm-diameter ubehandlede, plast cellekulturskåler.
    5. Inkuber cellene ved 33 ° C med 10% CO 2 (permissive betingelser).
  2. Subkultur av HEI-OC1 Cells
    Bemerk: Før til konfluens (~ 80%) at cellene skal bringes i suspensjon og sub-dyrket for å hindre kulturen å dø. Denne protokollen kan også brukes sammen med andre cellelinjer som er utviklet i vårt laboratorium fra den samme transgene mus, som OC-k3, fra organet Corti 11,12, og SV-1 r, fra stria vascularis 13,14.
    1. Fjern gammelt medium og vask cellene med 2 ml PBS. </ Li>
    2. Dekk celle monolag med en oppløsning av 0,25% trypsin, ved bruk av 1 ml per 25 cm2 overflateareal. For å flytte til neste trinn mer enn 40% av cellene må tas. Undersøke celler ved hjelp av et invertert mikroskop og, om nødvendig, "klapse eller trykk på" de kulturskåler forsiktig for å løsne eventuelle gjenværende festede celler.
      Merk: Vær forsiktig så trypsinering i lange perioder kan føre til celledød; ikke nok, og de overførte cellene vil utilstrekkelig for de planlagte studiene.
    3. Resuspender cellene, ved å følge prosedyren beskrevet i 1.1.3, og overføre dem til et 15 ml konisk rør.
    4. Sentrifuger i 5 min ved 300-500 xg, kast medium, samle cellene med frisk vekst medium og frø dem i det minste fire 100 mm diameter cellekultur retter. Antallet celler pr antenne vil avhenge av mengden av celler gjenvunnet. Inkuber cellene ved 33 ° C med 10% CO 2 (P-HEI-OC1) og dividere på nytt så mange ganger som nødvendig forde planlagte eksperimenter eller for å generere et nytt lager.
    5. For lager forberedelse, erstatte 100 mm diameter retter med 250-550 ml cellekulturflasker; for eksperimenter, kan mindre retter eller multi-brønn plater være mer dekkende.
    6. For differensiering, ruge HEI-OC1 celler ved givende forhold til de når ~ 80% samløpet; deretter flytte rettene til 39 ° C med 5% CO 2 (NP-HEI-OC1) for 2 til 3 uker.
      Merk: Celler vil gradvis stoppe voksende og døende. Endre medium annenhver dag for å fjerne døde hudceller. Avhengig av det opprinnelige antall celler, vanligvis etter ~ 4 uker ingen flere celler vil være tilgjengelig for eksperimenter. Differensiering starter så snart cellene er plassert på NP forhold, men ikke hver celle skille i samme tempo. Viktigere, Prestin uttrykk og membran lokalisering øker under differensieringsprosessen (se Representative Resultater, figur 4), som gir en kvalitativog kvantitativ indikasjon på graden av differensiering.

2. Drug Cytotoksisitet Studier

Merk: HEI-OC1 celler dyrket på givende forhold (P-HEI-OC1) anbefales for disse studiene (se Representative Resultater, figur 1).

  1. Cell Livskraftig (MTT-analyse)
    1. Samle P-HEI-OC1-celler ved å følge den fremgangsmåte som er beskrevet i 1.2, og telle dem med enten en automatisk celleteller eller hemocytometer. Juster konsentrasjonen til 2,0 x 10 5 celler / ml.
    2. Seed celler på 96-brønners store flatbunnede plater (100 ul per brønn) inkuberes over natten for festing til underlaget, og deretter behandle dem med medikamentene av interesse. Ikke glem å inkludere blanks og ikke-behandlede celler (kontroll)!
    3. Etter behandling (vanligvis 24 eller 48 timer ved 33 ° C), utføre MTT analysen følger produsentens protokoll. Generelt, Protokollene for denne analysen har følgende trinn:
      1. Tilsett 10 ul av MTT-reagens til hver brønn.
      2. Inkuber platen ved 37 ° C i 2 til 4 timer inntil lilla farge er synlig, og deretter tilsett 100 ul av MTT detergentreagens til hver brønn. Ikke rist plate.
      3. Dekk platen og la den stå i mørket i 2-4 timer ved 37 ° C.
      4. Bruk en mikroplateleser for å måle absorbans ved 570 nm i hver brønn, også de blanke feltene (vekstmedium alene). Normal data ved hjelp av gjennomsnittlig OD i kontrollceller som 100% av levedyktighet.
  2. Caspase 3/7 Activation-analyse
    Merk: HEI-OC1 celler dyrket på givende forhold (P-HEI-OC1) anbefales for disse studiene.
    1. Samle HEI-OC1-celler ved å følge den fremgangsmåte som er beskrevet i 1.2, og telle dem med enten en automatisk celleteller eller et hemocytometer. Juster konsentrasjonen til 2,0 x 10 5 celler / ml.
    2. Seed cellene på hvite vegger 96-brønns plater (100 ul per brønn) inkuberes over natten for festing til underlaget, og deretter behandle dem med medikamentene av interesse. Ikke glem å inkludere blanks og ikke-behandlede celler (kontroll)!
    3. Etter behandling (vanligvis 24 eller 48 timer ved 33 ° C), utfør caspase analysen etter den respektive produsentens protokoll. Generelt protokollene for denne analysen har følgende trinn:
      1. Klargjør reagenser, bland dem godt, og la dem nå romtemperatur.
      2. Fjerne cellene fra inkubatoren og la platene til romtemperatur.
      3. Legg den angitte mengden av reagens til hver brønn, er forsiktig med å unngå krysskontaminering ved ikke å berøre brønner som inneholder forskjellige prøver med de samme pipettespissene.
      4. Dekk platen og bland i 30 sekunder ved hjelp av en plate rister ved 300-500 rpm.
      5. Platen inkuberes ved romtemperatur i en periode av i det minste 30 min. determine optimal inkubasjonstid empirisk. Hvis romtemperaturen svinger bruke en konstant temperatur kuvøse, fordi temperatursvingninger vil påvirke luminescens lesing.
      6. Mål luminescens i hver brønn, og normalverdier med gjennomsnittlig luminescens i kontrollceller som 100% av caspaseaktivering.
  3. Cell Division (Proliferation)
    1. Samle HEI-OC1-celler ved å følge den fremgangsmåte som er beskrevet i 1.2, og telle dem med enten en automatisk celleteller eller et hemocytometer. Juster konsentrasjonen til 2,0 x 10 5 celler / ml.
    2. Seed celler på 96-brønners store flatbunnede plater (100 ul per brønn), inkuber over natten ved permissive betingelser for festing til underlaget, og deretter behandle dem med medikamentene av interesse. Ikke glem å inkludere blanks og ikke-behandlede celler (kontroll)!
    3. En time etter behandling, legge til hver brønn 1 mL forberedt 100x BrdU (5-brom-2'-deoxyurispise) løsning, og returnere platene til inkubator ved 33 ° C.
    4. Etter 12, 24 og 48 timer, fjerne den eksisterende medium fra tilsvarende plater og vask hver brønn en gang med PBS.
    5. Utfør celleproliferasjonsanalyse følge produsentens protokoll. Generelt protokollene for denne analysen har følgende trinn:
      1. Klargjør reagenser, inkludert feste / denaturering løsning, vaskebuffer, primært antistoff deteksjon løsning, sekundært antistoff deteksjon løsning, og BrdU løsning som angitt i produsentens protokoll.
      2. Legg fikserings / denaturerende løsning til hver brønn i de mengder som er angitt i produsentens protokoll, og holde platen ved romtemperatur i 30 min.
      3. Fjern fikserings / denaturering løsning og legge det primære antistoffet ved konsentrasjonen angitt i produsentens protokoll. Hold platen ved romtemperatur i 1 time.
      4. Ta ut av oppløsningen med den primære mauriBody, platen vaskes 3 ganger med vaskebuffer, og deretter legge til den sekundære antistoff i konsentrasjonen angitt i produsentens protokoll. Hold plate med det sekundære antistoff ved romtemperatur i 30 min.
      5. Fjern løsningen med den sekundære antistoff, platen vaskes 3 ganger med vaskebuffer, og legge til underlaget. Etter 10 min inkubasjon ved romtemperatur, tilsett STOP løsning. Vær forsiktig: Styr endring i farge; hvis løsningen blir meget mørk, stoppe reaksjonen før den standard utviklingstiden på 10 min.
      6. Les absorbans ved 450 nm i løpet av 30 min med å legge STOP Solution.
  4. cytotoksisitet
    Merk: HEI-OC1 celler dyrket på givende forhold (P-HEI-OC1) anbefales for disse studiene.
    1. Inkuber ved permissive betingelser, vanligvis i 24-48 timer, HEI-OC1-celler i cellekulturmedium alene (kontroll) eller medium pluss de stoffene av interesse.
    2. Ved slutten av behandlingenVask cellene tre ganger med PBS, og løsne ved hjelp av 1 ml per 25 cm2 av overflatearealet til en ikke-enzymatisk celledissosiasjon oppløsning i 3 min.
    3. Etter demontering, samle og pellet cellene ved sentrifugering ved 3000 x g i 5 minutter, fjern supernatanten og beis cellene i 15 min i mørket med reagenset som inngår i cytotoksisitet assay.
    4. Bestem antall levende HEI-OC1-celler ved flow cytometri som angitt av produsenten av det strømningscytometer.
  5. senescence
    1. Inkuber ved permissive betingelser, vanligvis i 24-48 timer, HEI-OC1-celler i cellekulturmedium alene (kontroll) eller medium pluss de stoffene av interesse.
    2. Bestem antall senescens-assosiert beta-galaktosidase-positive celler ved hjelp av flow cytometri med protokollen beskrevet av Debacq-Chainiaux et al. 15 eller en annen metode som er kjent for å gi pålitelige resultater. En kort protokoll for flowcytometri er følgende:
        <li> Ved slutten av den eksperimentelle behandlinger, vask cellene tre ganger med PBS og deretter inkubert dem med 100 nM bafilomycin A1 i cellekulturmedium i 1 time ved permissive betingelser.
      1. Legg C12FDG ved en endelig konsentrasjon på ~ 33 uM, og fortsette å inkubere cellene i 1-2 timer.
      2. Vask cellene to ganger med PBS, samlet dem opp ved hjelp av 1 ml per 25 cm2 av overflatearealet til en ikke-enzymatisk celledissosiasjon oppløsning i 3 min, og pellet dem ved sentrifugering ved 3000 xg i 5 min.
      3. Resuspender cellene i iskald PBS og bestemme antall positive HEI-OC1-celler ved flow cytometri som angitt av produsenten av det strømningscytometer.
  6. autophagy
    1. Samle HEI-OC1 celler kontroll og sultet (fratatt serum i 48 timer) ved å følge prosedyren beskrevet i 1.2, og behandle dem for Western blot å følge standardprotokoller. Generelt er protokoller for Western blot har følgende steps:
      1. Seed HEI-OC1 celler i 6-brønners plater ved en konsentrasjon på 1,0 x 10 5 celler / ml. Etter 24 og / eller 48 timer, vaskes cellene med iskald PBS.
      2. Lyse med 200 ul TNESV buffer (1% NP40, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM Na-3 VO 4) med protease inhibitor cocktail og 1 mM PMSF i 5 min på is.
      3. Samle cellene (ved skraping av bunnen av hver brønn), overføring til mikrosentrifugerør og sentrifuger ved 16 800 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
      4. Samle supernatants og kvantifisere proteinkonsentrasjonen ved hjelp av BCA analysen.
      5. Legg 5x ladningsbuffer og 1 mM DTT til hver prøve og koke i 5 minutter for å denaturere proteiner.
      6. Kjør prøvene ved hjelp av SDS-PAGE på en 4-12% gel, og overføre til PVDF membraner.
      7. Blokkere membraner med 5% fettfri tørrmelk i TBS-T med 0,1% Tween 20 i 60 minutter ved RT.
      8. Inkuber membranene over natten ved 4 ° C med primært antibodies.
      9. Den neste dag, vaske membranene grundig med TBS-T, og inkuber med en sekundær IgG-antistoff konjugert til pepperrotperoksidase (HRP) (1: 1500) i 1 time.
      10. Oppdage immunoreaktivitets med en forbedret chemiluminescence (ECL) detection system. Normal protein expression nivåer ved hjelp GAPDH (1: 2000 i TBS-T med 10% fettfri tørrmelk) som standard.
    2. I Western blot undersøke ekspresjonen av i det minste to forskjellige markører for autofagi som Beclin-1 og LC3B (vanligvis på 1: 1000 fortynning i TBS-T med 2,5% BSA). Ikke glem å se etter en kontroll av protein uttrykk som GAPDH eller aktin.
    3. Vurdere uttrykk av proteinet av interesse ved densitometry hjelp av en digital Blot skanner eller dataprogrammer som public domain NIH Image eller ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/).

3. elektro Eksperimenter med HEI-OC1 Cells

  1. høsting Cells
    Merk: Bruk celler vokser i 100 mm diameter kultur retter på 50% -80% konfluens. Trypsin, Accutase, enzym-fri løsning, eller p hosphate- b uffered s aline + e thylene d iamine t ETRA en CETIC syre (PBS-EDTA) kan brukes for å løfte cellene uten signifikante effekter på antallet og kvaliteten på gigaseals . I noen tilfeller kan imidlertid gjør trypsinbehandling cellene mer skjøre. I disse tilfellene la cellene komme seg i omtrent 30 minutter før forsøkene.
    1. Vask cellene to ganger med 10 ml PBS uten Ca2 + og Mg2 +.
    2. Tilsett 2 ml av en enzym-fri detacher løsning, slik som ikke-enzymatisk celledissosiasjon løsning, og inkuber rettene i 3 minutter ved 37 ° C med 5% CO2.
    3. Bruke et invertert mikroskop for å kontrollere avløsning av cellene. Om nødvendig, flytt cell kultur rett til å løsne flere celler, men gjør det forsiktig.
      Merk: Ikke rist fatet.
    4. Tilsett 10 ml DMEM + 10% FBS og pipettere cellene forsiktig opp og ned fem ganger med en 10 ml pipette.
    5. Ser på cellene under et mikroskop. Hvis> 80% av cellene allerede er separert (single), er det ikke lenger behov for pipettering. Hvis cellene er fortsatt i klynger, gjenta forsiktig pipettering til mer enn 80% cellene er singel.
    6. Plasser ~ 10 ml suspenderte celler i et 15 ml konisk rør, sentrifuge i 2 minutter ved 100 xg, og supernatanten kastes.
    7. Bruk ~ 200 ul ytre opptaksløsning (Leibovitz L-15 medium justert til 305-310 mOsm med destillert vann) for å resuspendere cellene. En optisk kontroll av cellene bør vise mange enkelt, runde celler med myke membran kanter.
  2. Patch-klemme og NLC Målinger
    1. Utfør patch-clamp og målinger av spenningsavhengig-lineær kapasitans (NLC) ved hjelp av endequate forsterkere og programvare, samt standard elektrofysiologiske teknikker. Som intern (intrapipette) oppløsning bruk 150 mM KCI, 1 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 2 mM ATP-Mg, 0,1 mM GTP-Na, og 10 mM HEPES; juster pH til 7,2 med Tris.
    2. Under mikroskopet, velg en enkel, sunn celle, med runde og glatte membran kanter. Feste spissen av glasset pipetten til celleoverflaten og sjekk membran motstand. Dette bør være i området rundt 3-6 megaOhms, tilsvarende en innvendig diameter (ID) av spissen av pipetten på ~ 2 um.
    3. Trykk forsiktig mikropipette spissen mot celleplasmamembran og deretter bruke sugekraft. En del av cellemembranen vil suges inn i pipetten, generering av et elektrisk motstand i størrelsesorden 10 - 100 gigaOhms (gigaseal).
    4. Etablere helcelle-tilstand ved å forstyrre plasmamembranen med suge pulser.
    5. Bruke celler som ikke uttrykker Prestin, for eksempel HEK-293, som en kontroll 9.
      Merk: Current responser skal filtreres ved 5 kHz, og korrigeres det for virkningene av gjenværende seriemotstand. All datainnsamling og de fleste analyser kan utføres ved hjelp av programvaren vanligvis følger med lock-in forsterkere. Kapasitans funksjon kan monteres på den første deriverte av en to stats Boltzmann funksjon knyttet ulineære fritt til membranspenning 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I et par nyere publikasjoner rapporterte vi et omfattende sett av studier som tar sikte på å evaluere responsen til HEI-OC1 celler til flere vanlige farmakologiske stoffer samt undersøke Prestin funksjon 8,9. I disse studiene har vi gjort bruk av alle protokoller som er beskrevet i forrige avsnitt.

Et av resultatene av disse tidligere studier var at HEI-OC1-celler dyrket ved ikke-permissive betingelser (39 ° C / 10% CO 2 = NP-HEI-OC1) viste en meget signifikant reduksjon i celleviabilitet, og en like betydelig økning i celledød, når det gjelder celler dyrket ved permissive betingelser (33 ° C / 10% CO 2 = P-HEI-OC1) (figur 1). Derfor noen cytotoksisitet undersøkelse utført på NP-HEI-OC1 cellene skal vie en betydelig innsats i diskriminerende virkninger av rusmidler fra virkningene av dyrkningsforhold. i tilleggsunn, siden narkotika effekter på celler allerede døende eller med en redusert levedyktighet kan være forskjellig at effektene av det samme stoffet på friske celler, anbefaler vi å bruke P-HEI-OC1 celler for eksperimenter som ikke spesifikt krever differensierte celler.

Våre studier på effekten av ulike farmakologiske stoffer også produsert interessante resultater. For eksempel cisplatin, et kjemoterapeutisk middel hyppig anvendt for behandling av flere humane ondartede sykdommer, og acetaminofen (APAP = N- et cetyl- pa ra-amino p henol), den mest solgte over-the-counter smertestillende middel i USA var både giftig for HEI-OC1-celler (figur 2). Men mens APAP redusert celle levedyktighet og økt caspase 3/7 aktivering, det gjorde ikke indusere celledød. Cisplatin, i kontrast, økt betydelig de tre responser (Figur 2). Interessant, caspases 3/7 var mostly aktivert ved lavere cisplatin konsentrasjoner, hvilket antyder at celledød indusert av lave doser av cisplatin ble sannsynligvis formidlet ved apoptose, mens høye doser letale effekter kan være forbundet med oncosis / necroptosis. Mens oncosis er blitt definert som en pre-dødelig vei som fører til uregulert celledød ledsaget av cellulær og organelle hevelse, blebbing, og øket membranpermeabilitet 17,18, er necroptosis en regulert, ikke-apoptotisk celledød mekanisme aktiveres av de samme stimuli som setter i gang apoptose men med morfologiske funksjoner som ligner på de av oncosis 19-22.

Ytterligere studier for å undersøke effekten av APAP og cisplatin på P-HEI-OC1-celler viste en klar doseavhengig effekt av APAP på celleproliferasjon som kunne forklare den spennende reduksjon i celleviabilitet uten celledød beskrevet i det foregående avsnitt (figur 3A). cisplatin als o nedsatt celleformering, og dens virkning forsterket med eksponeringstiden selv for små doser (figur 3A), men i tillegg redusert senescens ved alle konsentrasjoner og tidspunktene inngår i vårt studium (figur 3B). Den betydelige reduksjon i celle senescens indusert av cisplatin kan forklares ved økningen i celledød, forutsatt at senescent celler ville være, sikkert, tendens til å dø raskere enn friske celler 23.

Viktigere er disse representative resultater tyder på at HEI-OC1 celler reagerer på forskjellige farmakologiske medikamenter med en særegen dose- og tidsavhengig følsomhet til minst en av de mekanismene som studeres. Derfor vil en korrekt tolkning av noen eksperimentelle resultat krever en klar forståelse av de spesielle cellulære prosesser undersøkt og informasjon fra hver enkelt av de teknikkene som brukes til å evaluere dem.

jove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Confocal og flowcytometri eksperimenter, på den annen side, bekreftet Prestin uttrykk i P-HEI-OC1 og NP-HEI-OC1 celler, med Prestin immunolocalizing det meste på cytoplasma av P-HEI-OC1-celler (figur 4A, piler), og mer konsentrert på plasmamembranen i NP-HEI-OC1 celler (figur 4B, piler). Strømningscytometri studier viste en klar økning i Prestin ekspresjon i NP-HEI -OC1-celler i forhold til P-HEI-OC1-celler (figurene 4C og 4D). Den tidsavhengige økning i ekspresjon og plasmamembran lokalisering av Prestin i NP-HEI-OC1-celler tyder på at trans ble fulgt av syntese av flere Prestin molekyler. Men disse forsøkene ikke gi ledetråder for å avgjøre om Prestin molekyler opprinnelig lokalisert i cytoplasma flytte til plasmamembranen og nye molekyler erstatte dem, hvis de forblir på cytoplasma og bare nylig synthesized Prestin beveger seg til plasmamembranen, eller en kombinasjon av begge fremgangsmåter.

Elektrofysiologiske studier viste en robust NLC i P-HEI-OC1-celler (figur 5B), med en toppverdi som ble redusert og en spenning på topp kapasitans som skiftet til mer depolariserte verdier, når cellene ble beveget til ikke-permissive betingelser for en og 2 uker (figur 5C og 5D). På grunn av den progressive translokasjon av Prestin fra cytoplasma til plasmamembranen, vi opprinnelig antatt at NLC ville være høyere i NP-HEI-OC1 enn i P-HEI-OC1-celler, og at det ville ytterligere øke med tiden for inkubasjon ved NP forhold. Overraskende resultatene av våre studier viste nøyaktig den motsatte respons. Vi har spekulert på at økningen i tettheten av Prestin molekyler i plasmamembranen kunne begrense deres motoriske funksjoner.

hin-side = "en"> Note i figur 5 depolariseringen av spenningen på toppen kapasitans i HEI-OC1-celler i forhold til rapportert i OHCs og i transfekterte HEK293-celler 24 typiske verdier; Videre observerer at den depolariserende skift øker med tiden på NP betingelser. Den progressive depolariserende skift er lik den som er beskrevet i OHCs i løpet av mus og rotte utvikling 25,26, og det har vært antydet at det kan være relatert til utviklingen av andre cellulære strukturer forbundet med OHC plasmamembran 25, eller en modningsprosess indre til Prestin 24.

Vi håper denne korte opptelling av noen få studier med HEI-OC1-celler gir nok bevis på den potensielle nytten av HEI-OC1-celler for å undersøke et bredt spektrum av celle og molekylære responser.

ad / 54425 / 54425fig1.jpg "/>
Figur 1: Cellelivskraftig og celledød i P-HEI-OC1 og NP-HEI-OC1 Cells. (A) Celleviabilitet evaluert med MTT-analyse. Absorbans ble målt med et Plate Reader, og gjennomsnittlig OD av kontrollceller ble tatt som 100% av levedyktighet. (B) Celledød vurderes med Cvtotoksisitetsmålinq. Antall positive (døde) celler ble bestemt ved flowcytometri med 488 nm eksitasjon (blå laser) og FL1: 530 15 nm. Legg merke til meget signifikant (P ≤0.001) reduksjon i celleviabilitet (A) og økning i celledød (B) indusert av ikke-permissive betingelser. Stolper representerer standardfeil av gjennomsnittet (SEM). Modifisert fra referanse 8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

</ Html"Figur 2" src = "/ files / ftp_upload / 54425 / 54425fig2.jpg" />
Figur 2:. Responses av HEI-OC1 celler eksponert for APAP og Cisplatin analysert ved MTT, Kaspaser 3/7 og cytotoksisitetsassayer (A) Celleviabilitet evaluert med MTT-analyse, og absorbans målt med en Plate Reader. (B) Aktivering av bøddelens kaspaser 3/7. (C) Drug - indusert celledød vurderes med Cvtotoksisitetsmålinq; antall positive (døde) celler ble bestemt ved flow-cytometri. Dataene i hvert eksperiment ble normalisert til de respektive kontrollforhold (kontroll = 1) for å gjøre mulig samtidig statistisk analyse. * = P ≤0.05 hensyn til kontroll. Stolper representerer standardfeil av gjennomsnittet (SEM). Modifisert fromreference 8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Effekter av APAP og Cisplatin på HEI-OC1 Cells 'Mitotisk Rate og Senescence. (A) Narkotikainduserte endringer på frekvensen av mitotisk deling av HEI-OC1 celler, på 24 og 48 timer, ble evaluert med en BrdU analysen. (B) Legemiddelutløst senescence i HEI-OC1 celler ble målt ved flowcytometri og senescence- forbundet β-galaktosidase (SA-Bgal) teknikk. Dataene i hvert eksperiment ble normalisert til de respektive kontrollforhold (kontroll = 1) for å gjøre mulig samtidig statistisk analyse. * = P ≤0.05 hensyn til kontroll. Stolper representerer standardfeil av gjennomsnittet (SEM). Modifisert fromreference 8. Klikk her for å se en større versjon av thans skikkelse.

Figur 4
Figur 4:. Prestin Expression i P-HEI-OC1 og NP-HEI-OC1 Cells - Celler ble merket med Anti-Prestin Antistoff og Observert ved konfokalmikroskopi og flowcytometri (A) I P-HEI-OC1 celler Prestin immunolocalized det meste på cytoplasma (piler). (B) In NP-HEI-OC1-celler, i motsetning til dette ble Prestin reaktivitet konsentrert ved plasmamembranen (piler). (C og D) Strømningscytometri studier i HEI-OC1 celler dyrket i 2 uker ved NP betingelser (D) viser en klar økning i Prestin uttrykk i forhold til P-HEI-OC1-celler (C). (C) Inset er sekundær ab bare (negativ kontroll). Modifisert fra referanse 9.Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: NLC studier i P-HEI-OC1 og NP-HEI-OC1 Cells (A) Patch-klemmes HEI-OC1 celle.. (B - D) NLC i P-HEI-OC1 og NP-HEI-OC1 celler. Legg merke til at reduksjonen i toppen av NLC og den progressive forskyvning av kurvene for flere depolariserte verdier i NP-HEI-OC1-celler. Modifisert fra referanse 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne rapporten beskriver vi hvordan kultur HEI-OC1 celler og bruke dem til å vurdere mekanismer for narkotika-indusert cytotoksisitet og å undersøke funksjonelle egenskaper Prestin, den molekylære motor av cochlea OHCs. De tekniske fremgangsmåter, men er generelt nok til å være lett tilpasses forskjellige studier.

Alle protokollen beskrevet her krever riktig bruk av veletablerte cellekulturteknikker 10. Akkurat som med en hvilken som helst annen cellelinje, som arbeider med HEI-OC1-celler krever en riktig utstyrt cellekultur anlegget, med en sertifisert biologisk trygghetskabinett, en avkjølt sentrifuge, et vannbad, og en invertert mikroskop for undersøkelse av cellekulturer og for telling av cellene hvis du bruker hemocytometric teknikker. En unik krav, derimot, er tilgjengeligheten av to fuktede inkubatorer, ett sett ved 33 ° C / 10% CO 2 for P-HEI-OC1 celler og andre ved 39 ° C / 5% CO 2 for NP-HEI-OC1 celles. Hvis den planlagte studier omfatter bare P-HEI-OC1-celler, kan andre inkubator settes ved 37 ° C / 5% CO2 i forskjellige analyser.

Bruk av plastcellekulturskåler er en viktig ytterligere forutsetning for å arbeide med HEI-OC1-celler. Faktisk, HEI-OC1-celler er meget robuste, og de vil vekst i forskjellige overflater og under meget forskjellige forhold. Imidlertid vil deres fenotype og deres respons på legemidler og andre stimuli sterkt avhengig av kulturen parametere (G Kalinec & F Kalinec, upublisert). Som vi hevdet i et foregående papir 8, kan denne plastisitet HEI-OC1-celler med fordel anvendes til å designe nye eksperimenter. For eksempel er det vel kjent at oksygen strekk i cochlea perilymph er mye lavere (~ 2 kPa) enn i en typisk inkubator ved havoverflaten (~ 21,3 kPa) 27. Inkubasjon HEI-OC1 celler ved lavere O 2 -konsentrasjoner vil endre sine svar, kanskje noe som gjør dem en bedre modell for revisjonORY sanseceller.

Det skal understrekes at de beskrevne protokoller for kultur og subkultur av HEI-OC1 celler kan også brukes sammen med andre auditive cellelinjer utviklet i vårt laboratorium fra den samme transgene mus, som OC-K3 fra organ Corti 11,12 og SV -k1 fra stria vascularis 13,14. Videre kan disse cellelinjene være anvendelige som kontroll for HEI-OC1-celler i utvalgte eksperimenter. For eksempel har vi nylig brukt SV-K1-celler for å vise at den omvendt proporsjonal immunoreaktiviteten til Prestin og Na + K + ATPase-antistoffer på plasmamembranen til HEI-OC1 cellene var celletype-avhengig respons i stedet for i forbindelse med transgene mus fra som disse cellene var avledet 9.

Andre kritiske krav for å arbeide med HEI-OC1 celler er praksisen med riktige aseptiske teknikker som rengjøring av alle arbeidsflater innenfor sikkerhetskabinett med 70% ethanol eller isopropanol og sanering av alle materialer som kreves for prosedyrene. Men mens andre pattedyrcellelinjer er ofte beskyttet mot utilsiktet bakteriell forurensning ved hjelp av penicillin-streptomycin eller andre lignende kombinasjoner, antibiotika må aldri brukes med HEI-OC1 celler unntatt dersom formålet med studien er å undersøke deres effekter. HEI-OC1-celler ble samlet i antibiotikafrie betingelser, og de må unngås for å redusere fremveksten av antibiotika-resistente celler.

Til slutt ønsker vi å re-understreke et poeng allerede nevnt flere ganger i denne rapporten: fenotype og responsen HEI-OC1 celler til narkotika og andre stimuli vil sterkt avhenge av kultur parametere. Derfor er det svært viktig at laboratoriene som arbeider med HEI-OC1 cellene bruker lignende protokoller og celledyrkningsforhold for å gjøre sine resultater virkelig kan sammenlignes med de som tilbys av andre grupper. I tillegg er detsvært viktig å huske at HEI-OC1 cellelinje er bare en modell, med alle de begrensninger som en modell har. Forventer at in vitro med HEI-OC1 celler vil gi data nøyaktig representerer in vivo svarene av reelle auditive sanseceller er urealistisk. Men vi har stor tro på HEI-OC1 cellelinje er en nyttig modell for å undersøke funksjonelle responser av auditive sanseceller og screening av potensialet ototoksisitet av farmakologiske stoffer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEI-OC1 cells ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS 
Class II Biological Safety cabinet The Baker Company Sterilgard III AND COMPANIES INDICATED IN THE
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5810R PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY
Inverted microscope Zeiss Axiovert 25 EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR
Waterbath Stovall HWB115 PRODUCT COULD BE USED.
Cell counter Nexcelom Cellometer Auto T4
Two (2) Cell incubators, one at 33 °C/10% CO2 and other at 39 °C/5% CO2 Forma Scientific 3110
Cell culture dishes, PS, 100 mm x 20 mm with vents Greinier Bio-One 664-160
Cell culture dishes , PS,  60 mm x 15 mm with vents  Greiner Bio-One 628160
Cellstar tissue culture flasks  250 ml Greiner Bio-One 658-175
Cellstar tissue cultur  flasks 550 ml Greiner Bio-One 660-175
 6 well cell culture plate, with lid-Cellstar Greiner Bio-One 657-160
Microtest Tissue culture plate, 96 well, flat bottom with lid Becton Dickinson 353072
Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white, clear bottom Greiner Bio-One 655098
50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars Becton Dickinson  352070
15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars Greiner Bio-One 188-271
PBS pH 7.4 (1x)  Life Technologies 10010-023
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) Life Technologies 11965-084
Fetal bovine serum (FBS)  Hyclone SH10073.1
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Gibco/Invitrogen 21083-027
Trypsin, 0.25%  Life Technologies 25200-056
TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit Trevigen 4890-25-K
Caspase-Glo 3/7 Assay  kit Promega   G8091 
BrdU Cell Proliferation Assay Kit  Cell Signaling 6813
Non-enzymatic cell dissociation solution  Sigma-Aldrich C5789
Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit Promega   G8741 
FACSAriaIII instrument  BD Biosciences  FACSAriaIII With 488 nm excitation (blue laser)
Digital Blot Scanner LI-COR C-DiGit
Electrophoresis and Blotting Unit Hoefer SE300 miniVE
Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software Molecular Devices SpectraMax 5
Patch-clamp amplifier HEKA EPC-10
Puller for preparing patch electrodes Sutter Instruments P-97

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
  2. Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening. Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).
  3. Devarajan, P., et al. Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways. Hear Res. 174, 45-54 (2002).
  4. Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line. Hear Res. 284, 33-41 (2012).
  5. Hayashi, K., et al. The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress. Cell Signal. 27, 382-393 (2015).
  6. Tsuchihashi, N. A., et al. Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells. Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).
  7. Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).
  8. Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
  9. Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function. Hear Res. 335, 9-17 (2016).
  10. Celis, J. E. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, 3rd, Elsevier Academic Press. (2006).
  11. Bertolaso, L., et al. Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents. Audiology. 40, 327-335 (2001).
  12. Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines. Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).
  13. Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse. 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).
  14. Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence. Hear Res. 163, 27-36 (2002).
  15. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
  16. Santos-Sacchi, J. Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance. J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).
  17. Fink, S. L., Cookson, B. T. Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells. Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).
  18. Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).
  19. Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).
  20. Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).
  21. Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation. Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).
  22. Vercammen, D., et al. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways. J Exp Med. 188, 919-930 (1998).
  23. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).
  24. Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).
  25. Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
  26. Oliver, D., Fakler, B. Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat. J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).
  27. Tsunoo, M., Perlman, H. B. Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function. Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).

Tags

Cellular Biology HEI-OC1 celler cellekultur cytotoksisitet celledød celle levedyktighet celle senescence autofagi. FACS Prestin motorikk patch-clamp ikke-lineær kapasitans
Arbeide med Auditory HEI-OC1 Cells
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., … More

Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. Working with Auditory HEI-OC1 Cells. J. Vis. Exp. (115), e54425, doi:10.3791/54425 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter