Introduction
コルチ1のハウス耳研究所-臓器（HEI-OC1）細胞は、トランスジェニックマウスの1,2の聴覚器官に由来しています。 33℃/ 10％CO 2（許容条件）で、このトランスジェニックマウスからの任意の細胞のインキュベーションは、脱分化と加速増殖をトリガーする不死化遺伝子の発現を誘導します。 39℃/ 5％CO 2の少なくともHEI-OC1、細胞死2,3の場合には、増殖、分化を減少した（非許容条件）リードに対して細胞を移動させます。
HEI-OC1細胞をクローニングし、十年以上前に私たちの研究室で特徴付けられ、そして初期の研究は、彼らが特定のそのようなプレスチン、ミオシン7aと、のAtoh1、BDNF、カルビンジンおよびカルモジュリンなどの蝸牛有毛細胞のマーカーだけでなく、支援のマーカーを発現することが示されましたコネキシン26及び線維芽細胞増殖因子受容体（FGF-R）2のような細胞です。したがって、それはHEI-OC1はのCommoを表すことが示唆されましたコルチ2の器官の感覚と支持細胞のためのn個の前駆細胞。薬は、非耳毒性考えながら並列研究はペニシリンのように、2,3なかった、シスプラチン、ゲンタマイシンおよびストレプトマイシンのような典型的な耳毒性薬が誘発されることをこれらの細胞におけるカスパーゼ3活性化を強力な証拠を提供しました。従って、この細胞株は、耳毒性に関与する細胞および分子機構を調査し、新しい薬理学的薬剤の潜在的な耳毒性またはotoprotective特性のスクリーニングするためのインビトロ系として提案されました。 HEI-OC1細胞を、過去10年間に発表された百以上及び五十の研究において使用されていると推定されます。
異なる薬剤の潜在的なプロアポトーシス効果を見ているが、この細胞株を含む研究のほとんどの主要な目標であったが、オートファジーと老化のような他の重要な細胞プロセスはちょうどHEI-OC1細胞4-7で調査され始めています。私naが我々の研究室8からの最近の研究では、我々は頻繁に診療所で使用される異なる薬理学的薬剤によって誘導される細胞死、生存、増殖、老化およびオートファジーに関するデータの包括的なセットを収集するためにHEI-OC1の細胞を使用しました。我々はまた、同一の治療を受けてHEK-293（ヒト胎児腎臓細胞）およびHeLa細胞由来のもの（ヒト上皮細胞）でHEI-OC1細胞の応答の一部を比較しました。我々の結果は、HEI-OC1細胞を、試験下のメカニズムの少なくとも1つに特有の用量及び時間依存性の感度で、特性ようにザ各薬物に応答することが示されました。また、実験結果の正しい解釈は、複数の技術8と平行した研究を行う必要がありますことをその研究に強調しました。
別の研究では、プレスチンの機能的応答を評価するためのHEI-OC1細胞の使用、蝸牛外有毛細胞のモータータンパク質（OHCS）9を調査しました+ K + ATPアーゼの減少と相関NP-HEI-OC1の細胞の細胞膜でのプレスチンの局在の増加ことがわかりました。また、我々は、P-HEI-OC1細胞は原形質膜に存在するプレスチン分子の密度が増加したときに減少し、運動機能を、プレスチンに関連付け堅牢なNLCを有することを実証しました。要するに、これらの結果は、HEI-OCの有用性をサポート1細胞は、聴覚タンパク質を調査します。
このビデオの記事では、我々は文化HEI-OC1細胞に、なぜ薬剤誘発性細胞毒性のメカニズム/秒を評価する方法、細胞毒性研究のために許容条件（P-HEI-OC1）で増殖する細胞を使用するのが便利であるとどのように方法について説明します電気生理学的研究を行うために（ 例えば 、パッチクランプ、非線形キャパシタンス（NLC））はプレスチン、蝸牛OHCSの分子モーターの機能的特性を調べました。
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Protocol
1.細胞培養
注：すべての細胞培養プロトコルは、適切な細胞培養技術を使用して実行されなければならない（：実験室ハンドブックVolume I 10参照用細胞生物学の最初の3章を参照のこと）。 HEI-OC1細胞は、適切な接着および増殖のための細胞培養皿の任意の追加のコーティングまたは治療を必要としません。非常に重要：細胞培養の目的のためにガラス製品食器を使用しないでください。表現型および薬理学的薬剤に対する細胞の生物学的応答は、（G Kalinec＆F Kalinec、未発表）を変更します。従来のプラスチック細胞培養皿を（材料/機器の表を参照）をお勧めします。汚染を避けるために、無菌技術に特別な注意を払うが、HEI-OC1細胞と抗生物質（ 例えば 、アンピシリンまたはストレプトマイシン）を使用することはありません。必要であれば、HeLaおよびHEK-293細胞は、HEI-OC1 8、任意の他の細胞株は、可能性のある以前の研究において対照として使用されてきたが、アンホテリシンBを使用この目的のために許容できます。
- 冷凍HEI-OC1細胞の蘇生
注：線条13,14を vascularisからこのプロトコルはまた、同じトランスジェニックコルチ11,12の臓器から、そのようなOC-K3として、私たちの研究室で開発されたマウス、およびSV-K1から他の細胞株を使用することができます。- 液体N 2から凍結保存しHEI-OC1細胞のバイアルを取り出し、37℃の水浴に入れてください。バイアルの下半分のみを水没、そして氷のわずかな量がバイアルに残るまで、それは解凍することができます。 70％アルコールでバイアルの外側を拭いてください。
- バイアルからの細胞をピペットでゆっくりと全体積（〜1.5×10 5細胞/ ml）を送達する15ミリリットルに、降下によってダルベッコ変法イーグル培地（のような予め温めた増殖培地10mlを含有する円錐管を、ドロップDMEM）、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充しました。
- トンを廃棄し、5分間、300〜500×gでチューブを遠心分離することにより、DMSOを削除します彼は上清および再懸濁し、新鮮な増殖培地（DMEM + 10％FBS）の9ミリリットルで細胞を。チューブの底に触れるピペットの先端に3〜4回、ピペットからの培地およびその逆に、懸濁された細胞のフラックスおよび還流により、細胞の塊またはシートを脱凝集。
- 100 mmの直径の未処理、プラスチック細胞培養皿中で増殖培地中に懸濁された細胞の総容積を置きます。
- 10％CO 2（許容条件）で33℃で細胞をインキュベートします。
- HEI-OC1細胞のサブカルチャー
注：コンフルエンス前に（〜80％）の細胞が培養死にかけを防止するために、サスペンションと継代培養に持ち込まれるべきです。このプロトコルはまた、線条から13,14を vascularis、コルチ11,12の臓器、およびSV-K1から、このようなOC-K3と同じトランスジェニックマウスから我々の研究室で開発された他の細胞株、一緒に使用することができます。- 古い培地を除去し、2mlのPBSで細胞を洗浄。</李>
- 表面積25cm 2のあたりを1ml用いて、0.25％トリプシン溶液で細胞単層を覆います。次のステップに移動するには、細胞の40％以上が切り離されなければなりません。必要に応じて、倒立顕微鏡を用いて細胞を調べて、「平手打ちまたはタップし、「残りの付着した細胞を解放するために静かに培養皿を。
注：細胞死を引き起こす可能性があります長時間トリプシン処理として注意してください。十分かつ計画的研究のために移入された細胞はなります不足していません。 - 1.1.3に記載の手順に従って、細胞を再懸濁し、15mLのコニカルチューブに移します。
- 300〜500×gで5分間遠心し、培地を廃棄し、新鮮な増殖培地で細胞を収集し、少なくとも、4 100ミリメートル直径の細胞培養皿をそれらをシードします。ディッシュあたりの細胞数は、回収された細胞の量に依存するであろう。 10％CO 2（P-HEI-OC1）で33℃で細胞をインキュベートして、再度のために必要な回数を分割計画された実験や新株を生成します。
- 株式の準備のために、250〜550ミリリットルの細胞培養フラスコにより100ミリメートル直径の料理を置き換えます。実験のために、小さな皿またはマルチウェルプレートは、より適切であり得ます。
- 彼らは〜80％コンフルエンスに達するまでの分化のために、許容条件下でHEI-OC1細胞をインキュベート。その後、2〜3週間、5％CO 2（NP-HEI-OC1）で39℃に皿を移動します。
注：細胞を漸進的に増殖すると死んで停止します。死細胞を除去するために、一日おきに培地を変更します。細胞の元の数に応じて、通常3〜4週間後にはより多くの細胞を実験に使用できなくなります。分化は、すぐに細胞がNP条件に置かれるように開始しますが、すべてのセルは同じペースで区別していません。分化プロセスの間に重要なことは、プレスチン発現と膜局在化が増加した （ 図4、 代表的な結果を参照してください）、定性を提供および分化のレベルの定量的な指標。
2.薬物細胞毒性研究
注：許容条件（P-HEI-OC1）で成長したHEI-OC1細胞（ 図 1、 代表的な結果を参照してください）これらの研究のために推奨されています。
- 細胞生存率（MTTアッセイ）
- 1.2に記載された手順に従うことによって、P-HEI-OC1細胞を収集し、自動細胞カウンターまたは血球計のいずれかでそれらを数えます。 2.0×10 5細胞/ mlに濃度を調整します。
- 、96ウェル透明平底プレート（ウェル当たり100μl）を上に細胞をシード基板への取り付けのために一晩インキュベートし、次いで、目的の薬とそれらを扱います。ブランクおよび非処理細胞（コントロール）を含めることを忘れないでください！
- 薬物治療（33℃、通常24または48時間）した後、製造者のプロトコルに従ってMTTアッセイを行います。一般に、このアッセイのためのプロトコルは、以下のステップがあります。
- 各ウェルにMTT試薬10μlのを追加します。
- 紫色の色素が表示されるまで、2〜4時間、37℃でプレートをインキュベートし、各ウェルにMTT洗剤試薬100μlのを追加します。プレートを振らないでください。
- プレートを覆い、37℃で2〜4時間、暗闇の中でそれを残します。
- ブランク（単独で、増殖培地）を含む各ウェルに570 nmの吸光度を測定するためにマイクロプレートリーダーを使用します。生存率100％とコントロール細胞の平均ODを使用してデータを正規化します。
- カスパーゼ3/7活性化アッセイ
注：許容条件（P-HEI-OC1）で成長したHEI-OC1細胞は、これらの研究のために推奨されています。- 1.2に記載された手順に従うことによりHEI-OC1細胞を収集し、自動細胞カウンターまたは血球計のいずれかでそれらを数えます。 2.0×10 5細胞/ mlに濃度を調整します。
- WH上の細胞をシード（ウェル当たり100μl）を96ウェルプレートをITE肉、基板への取り付けのために一晩インキュベートし、次いで、目的の薬とそれらを扱います。ブランクおよび非処理細胞（コントロール）を含めることを忘れないでください！
- 薬物治療（33℃、通常24または48時間）した後、それぞれの製造者のプロトコルに従ってカスパーゼアッセイを行います。一般的に、このアッセイのためのプロトコールは、以下のステップを有します。
- 、試薬を準備するだけでなく、それらを混合し、それらを室温に平衡化することができます。
- インキュベーターから細胞を除去し、プレートを室温に平衡化することができます。
- 同じピペットチップで異なるサンプルを含むウェルに触れていないことにより、交差汚染を避けるために注意しながら、各ウェルに試薬の指示量を追加します。
- プレートをカバーし、300〜500 rpmでプレートシェーカーを用いて30秒間混ぜます。
- 少なくとも、30分の期間、室温でプレートをインキュベートします。 Determin経験的に最適なインキュベーション時間を電子。室温が温度の変動が発光の読み取りに影響するため、恒温培養器を使用変動する場合。
- 各ウェルでの発光を測定し、カスパーゼ活性化の100％とコントロール細胞における平均発光を使用して値を正規化します。
- 細胞分裂（増殖）
- 1.2に記載された手順に従うことによりHEI-OC1細胞を収集し、自動細胞カウンターまたは血球計のいずれかでそれらを数えます。 2.0×10 5細胞/ mlに濃度を調整します。
- 、96ウェル透明平底プレート（ウェル当たり100μl）を上に細胞をシード基板に取り付けるための許容条件で一晩インキュベートし、次いで、目的の薬とそれらを扱います。ブランクおよび非処理細胞（コントロール）を含めることを忘れないでください！
- 一時間処理した後、各ウェルに準備された100倍のBrdU（5-ブロモ-2'- deoxyuriの1μlを添加します）ソリューションを食事をし、33℃のインキュベーターにプレートを返します。
- 12、24および48時間後に、対応するプレートから既存のメディアを除去し、PBSでよく一度それぞれを洗います。
- 製造業者のプロトコルに従って細胞増殖アッセイを実行します。一般的に、このアッセイのためのプロトコールは、以下のステップを有します。
- 固定/製造業者のプロトコルに示されるように、溶液、洗浄緩衝液は、一次抗体の検出溶液、二次抗体検出溶液とのBrdU変性溶液を含む試薬を準備します。
- 製造業者のプロトコルに示された量で、各ウェルに固定/変性溶液を加え、30分間室温でプレートを保持します。
- 固定/変性溶液を除去し、製造者のプロトコルに示されている濃度の一次抗体を追加します。 1時間室温でプレートを保管してください。
- 主要なアリとソリューションを削除しますibody、プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄し、その後製造業者のプロトコールに示した濃度の二次抗体を加えます。室温で30分間、二次抗体を用いてプレートを保管してください。
- 二次抗体を含む溶液を除去プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄し、基質を加えます。室温で10分間インキュベートした後、停止溶液を加えます。注意してください：色の変化を制御します。解決策は非常に暗くなる場合は、10分の標準的な開発時間の前に反応を停止。
- STOPソリューションを追加することの30分以内に450 nmの吸光度を読みます。
- 細胞毒性
注：許容条件（P-HEI-OC1）で成長したHEI-OC1細胞は、これらの研究のために推奨されています。- 細胞培養培地単独（対照）または培地プラス興味のある薬で、24〜48時間、通常、許容条件下でHEI-OC1細胞をインキュベートします。
- 処置の終わりにPBSで細胞を3回洗浄し、3分間の非酵素的細胞解離溶液の表面積25cm 2のごとに1 mlで使用切り離します。
- 5分間3000×gの遠心分離により細胞を回収し、ペレット化し、取り外した後、上清を除去し、細胞毒性アッセイに含まれる試薬と暗闇の中で15分間細胞を染色。
- フローサイトメーターの製造業者によって示さサイトメトリーのように流れによって生HEI-OC1細胞の数を決定します。
- 老化
- 細胞培養培地単独（対照）または培地プラス興味のある薬で、24〜48時間、通常、許容条件下でHEI-OC1細胞をインキュベートします。
- 信頼性の高い結果を提供することが知られてDebacq-Chainiaux ら 15またはその他の方法により、記載されたプロトコルで、フローサイトメトリーを用いて老化関連β-ガラクトシダーゼ陽性細胞の数を決定します。フローサイトメトリーのための簡単なプロトコルは次のとおりです。
- <実験処理の終了時にLI>、PBSで細胞を3回洗浄した後、許容条件で1時間、細胞培養培地中で100nMのバフィロマイシンA1でそれらをインキュベートします。
- 〜33μMの最終濃度でC12FDGを追加し、1〜2時間細胞をインキュベート続けます。
- 3分間の非酵素的細胞解離溶液の表面積25cm 2のごとに1 mlで使用して収穫、PBSで細胞を2回洗浄し、5分間、3,000×gで遠心分離することによってそれらをペレット。
- 氷冷PBSで細胞を再懸濁し、フローサイトメーターの製造業者によって示されるように、フローサイトメトリーによって正のHEI-OC1細胞の数を決定します。
- HEI-OC1細胞が制御集め、飢餓状態（48時間血清を奪わ）1.2に記載された手順に従うことにより、標準的なプロトコル以下のウェスタンブロットのためにそれらを処理します。一般的には、ウェスタンブロットのためのプロトコルは、以下の目を持っていますEPS：
- 1.0×10 5細胞/ mlの濃度で6ウェルプレート中の種子HEI-OC1細胞。 24および/または48時間後に、氷冷PBSで細胞を洗浄します。
- 氷上で5分間、プロテアーゼ阻害剤カクテルおよび1mM PMSFとTNESV緩衝液200μlで溶解（1％NP40、50mMのトリス塩酸pH7.5の、100mMのNaCl、2mMのEDTA、1 mMののNa 3 VO 4）。
- 4℃で5分間、16,800×gでマイクロ遠心チューブと遠心分離機に転送し、（各ウェルの底をこすることによって）細胞を収集します。
- 上清を収集し、BCAアッセイを用いてタンパク質濃度を定量化します。
- 5×ローディング緩衝液および1mMのDTTを各試料に添加し、タンパク質を変性させ、5分間沸騰させます。
- 4〜12％ゲル上でSDS-PAGEを使用してサンプルを実行し、PVDF膜に移します。
- RTで60分間、0.1％のTween 20を含むTBS-T中の5％脱脂粉乳で膜をブロックします。
- プライマリアリで4℃で一晩、膜をインキュベートibodies。
- 翌日、TBS-Tで十分に膜を洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）（1：1,500）にコンジュゲート二次IgG抗体とインキュベートし、1時間。
- 増強化学発光（ECL）検出システムとの免疫反応性を検出します。標準として：（10％脱脂粉乳を含むTBS-Tで2000 1）GAPDHを用いたタンパク質の発現レベルを正規化します。
- ウェスタンブロットでは、の発現を調査し、少なくとも、そのようなベクリン-1およびLC3Bとしてオートファジーの二つの異なるマーカー（通常は1：2.5％BSAを含むTBS-T 1,000希釈）。 GAPDHまたはアクチンなどのタンパク質発現の制御を探すことを忘れないでください。
- このようなパブリックドメインNIHイメージまたはImageJの（http://rsb.info.nih.gov/nih-image/）などのデジタルブロットスキャナやコンピュータソフトウェアを使用してデンシトメトリーにより目的のタンパク質の発現を評価します。
HEI-OC1細胞3.電気生理学実験
- 収穫細胞
注：使用した細胞は、50％-80％の集密度で直径100mmの培養皿中で増殖します。トリプシン、のAccutase、酵素を含まない溶液、またはpの hosphate- uffered のアリーン+ E B thylene D iamine トンクジラの酸（PBS-EDTA）はgigasealsの数と質に重大な影響を与えることなく細胞を持ち上げるために使用することができるETRA 。しかし、場合によっては、トリプシン処理細胞はより脆くなります。これらの場合において、細胞は、実験を開始する前に、約30分間回復させます。- 2+ の Ca 2+及びMgずに10mlのPBSで細胞を2回洗浄します。
- このような非酵素的細胞解離溶液として、無酵素デタッチャ溶液2mlを追加し、5％CO 2で37℃で3分間の料理をインキュベートします。
- 細胞の剥離を確認するために倒立顕微鏡を使用してください。必要であれば、セルを移動させますより多くの細胞を剥離するが、静かにそれを行うにはリットルの培養皿。
注：料理を振らないでください。 - DMEM + 10％FBSの10ミリリットルを加え、穏やかに上昇し、10 mlのピペットで5回上下細胞をピペット。
- 顕微鏡下で細胞を見てください。細胞の> 80％が既に（シングル）分離されている場合、それ以上のピペット操作は必要ありません。細胞は、クラスタに残っている場合は80％以上の細胞が単一になるまで、穏やかにピペッティングを繰り返します。
- 、15ミリリットルコニカルチューブに懸濁された細胞の〜10ミリリットルを置き、100×gで2分間遠心分離し、上清を捨てます。
- 細胞を再懸濁するために - 外部記録溶液（蒸留水で310 mOsmで305に調整ライボビッツL-15培地）の〜200μLを使用してください。細胞の光制御は、滑らかな膜のエッジを持つ多くの単一、丸い細胞を示すべきです。
- パッチクランプとNLC測定
- 使用して電圧依存非線形容量（NLC）のパッチクランプおよび測定を行いますdequateアンプとソフトウェアだけでなく、標準的な電気生理学的な技術。内部（intrapipette）溶液を150mMのKCl、1mMのMgCl 2、0.1mMのEGTA、2mMのATP-Mgを、0.1 mMのGTP-Na、及び10mMのHEPESを使用するように。トリスでpHを7.2に調整します。
- 顕微鏡下で、ラウンドと滑らかな膜のエッジと、単一、健康な細胞を選択します。細胞表面にガラスピペットの先端を取り付け、膜抵抗を確認してください。これは〜2μmのピペットの先端の内径（ID）に対応する、周りに3-6メガオームである必要があります。
- 静か細胞原形質膜に対するマイクロピペットの先端を押してから吸引を適用します。 100 gigaOhms（ギガシール） - 細胞膜の部分は、10の順に、電気抵抗を発生させる、ピペット内に吸引されます。
- 吸引パルスで細胞膜を破壊することによって、全細胞の状態を確立します。
- このようなHEK-293、制御9のようにプレスチンを発現しない細胞を、使用してください。
注：現在の応答は5kHzでフィルタリングする必要があり、修正は、残留直列抵抗の影響のために作られました。すべてのデータの収集と分析は最も通常のロックイン増幅器に付属するソフトウェアを用いて行うことができます。容量関数は、膜電圧16に非線形電荷に関する2状態ボルツマン関数の一次導関数に適合させることができます。
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Representative Results
最近の出版物のカップルで、私たちはいくつかの一般的に使用される薬理学的薬剤へのHEI-OC1細胞の応答を評価するだけでなく、プレスチン機能8,9を調査することを目的とした研究の包括的なセットを報告しました。これらの研究において、我々は、前のセクションで説明したすべてのプロトコルを利用しました。
これらの先行研究の結果の一つは、非許容条件下で培養HEI-OC1細胞を、（39℃/ 10％CO 2 = NP-HEI-OC1）は細胞生存率の非常に有意な減少、および同様に有意な増加を示したことでした細胞死で、許容条件下で培養した細胞に対して、（33℃/ 10％のCO 2 = P-HEI-OC1）（ 図1）。したがって、任意の細胞毒性試験は、培養条件の影響から識別薬物効果にかなりの努力を捧げべきNP-HEI-OC1細胞上で行いました。 additioで細胞に対する薬物の効果はすでに死んまたはであるためnは、減少した生存率は、健康な細胞上の同じ薬剤の効果は、我々は分化した細胞を特異的に必要としない実験のためにP-HEI-OC1細胞を使用することをお勧めしますことを異なる可能性があります。
異なる薬理学的薬剤の効果に関する我々の研究はまた、興味深い結果が得られました。例えば、シスプラチン、化学療法剤は、しばしばいくつかのヒト悪性腫瘍の治療、及びアセトアミノフェン（APAP = N-セチルPA RA-アミノのp henol）に使用される、アメリカで最も広く販売されて店頭鎮痛剤、 HEI-OC1細胞（ 図2）のための毒性の両方でした。 APAPは、細胞生存率を減少し、カスパーゼ3/7活性を増加したが、それは、細胞死を誘導しませんでした。シスプラチンは、対照的に、大幅に3つの応答（ 図2）を増加させました。興味深いことに、カスパーゼ3/7 MOSTLました高用量致死効果は、腫瘍症/ネクロトーシスと関連することができながら、シスプラチンの低用量によって誘導される細胞死はおそらく、アポトーシスによって媒介されたことを示唆し、低いシスプラチン濃度で活性化のy。腫瘍症はブレブ形成、細胞およびオルガネラ腫脹を伴う無秩序な細胞死に至る前致死経路として定義され、膜透過性17,18が増加してきたが、ネクロトーシスが開始同じ刺激によって活性化規制非アポトーシス細胞死のメカニズムでありますアポトーシスが、腫瘍症19-22と同様の形態学的特徴を持ちます。
APAPおよびP-HEI-OC1細胞に対するシスプラチンの効果を調査することを目的としたさらなる研究は、前の段落で説明した細胞死なしで細胞生存率の魅力的な減少を説明することができる細胞増殖のAPAPの明確な用量依存性効果を示した（ 図図3（a））。シスプラチンのALS O細胞増殖を減少させ、その効果は、少量（ 図3A）の露光時間で増大するが、加えて、我々の研究（ 図3B）に含まれる全ての濃度および時点で老化を減少させました。シスプラチンによって誘導される細胞老化の有意な減少は、老化細胞は、おそらく、健康な細胞23よりも早く死ぬしやすいだろうと仮定して、細胞死の増加によって説明することができます。
重要なことは、これらの代表的な結果は、HEI-OC1細胞は、研究中のメカニズムの少なくとも1つに独特の用量および時間依存感度で異なる薬理学的薬剤に応答することを示唆しています。したがって、いずれの実験結果の正しい解釈を検討し、特定の細胞プロセスを明確に理解し、それらを評価するために使用される技術の一つ一つによって提供される情報が必要になります。
「FO：=-together.within-ページを保つ「jove_content 1 ">共焦点他方では、フローサイトメトリー実験は、プレスチンはで主にimmunolocalizingで、P-HEI-OC1およびNP-HEI-OC1細胞でプレスチン発現を確認しましたP-HEI-OC1細胞（ 図4A、矢印）の細胞質、およびNP-HEI-OC1細胞（ 図4B、矢印）での形質膜において、より濃縮した。フローサイトメトリーは、研究では、NP-HEIでプレスチン発現の明らかな増加を示しました-OC1細胞はP-HEI-OC1細胞（ 図 4Cおよび4D）に対する。NP-HEI-OC1細胞におけるプレスチンの発現および原形質膜局在化の時間依存的増加は、転座がよりプレスチン分子の合成を伴っていたことを示唆しています。しかし、これらの実験は、それらが細胞質にとどまるとのみ新しくシンセ場合、もともと細胞質の形質膜への移行、新しい分子に位置プレスチン分子は、それらを置き換えるかどうかを決定するための手がかりを提供していませんでしたプレスチンは、原形質膜、または両方のプロセスの組み合わせに移動esized。細胞は1のために、非許容条件に移動されたときに電気生理学的研究は、減少したピーク値と、より脱分極の値にシフトしたピーク容量の電圧と、P-HEI-OC1細胞（ 図5B）で堅牢なNLCを示し、 2週間後（ 図5Cおよび5D）。なぜなら、細胞質から細胞膜へのプレスチンの進行転座、我々は当初NLCはP-HEI-OC1細胞よりもNP-HEI-OC1が高いであろうと、それはさらにNPインキュベーション時間と共に増加するという仮説を立て条件。驚くべきことに、我々の研究の結果は正反対の反応を示しました。我々は、原形質膜におけるプレスチン分子の密度の増加は、それらの運動機能を制限することができると推測しました。
HEI-OC1細胞のピーク容量で図5のヒンページ= "1">注電圧の脱分極はOHCSにし、トランスフェクトしたHEK293細胞24で報告された典型的な値に尊重します。また、脱分極シフトはNP条件で、時間とともに増加することを確認します。進行性の脱分極シフトは、マウスおよびラットの開発25,26間にOHCSで説明したものと同様であり、そしてOHCの原形質膜25、または内因性成熟過程に関連する他の細胞構造の開発に関連することが示唆されました24をプレスチンします。
私たちは、HEI-OC1細胞と少数の研究のこの簡単な再集計は、細胞および分子応答の広いスペクトルを調査するためのHEI-OC1細胞の潜在的有用性の十分な証拠を提供したいと考えています。
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図1：P-HEI-OC1 およびNP-HEI-OC1細胞における細胞生存率と細胞死 。 （A）細胞生存率はMTTアッセイにより評価しました。吸光度をプレートリーダーで測定し、コントロール細胞の平均ODは生存率を100％としました。 （B）細胞毒性アッセイで評価細胞死。 530 15nmの正（死）細胞の数は、488 nmの励起（青色レーザ）とFL1とフローサイトメトリーによって決定しました。非許容条件によって誘導される細胞死（B）において非常に有意な（P≤0.001）細胞生存率の減少（A）と増加に注意してください。バーは平均の標準誤差（SEM）を表します。参照8から修正された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
「図2」SRC = "/ファイル/ ftp_upload / 54425 / 54425fig2.jpg" />
図2：MTT、 カスパーゼ3/7および細胞毒性アッセイによって分析した場合にAPAP及びシスプラチンにさらさHEI-OC1細胞の応答 MTTアッセイで評価（A）細胞の生存率、および吸光度をプレートリーダーで測定しました。 （B）実行カスパーゼ3/7の活性化。 （C） 薬物-細胞毒性アッセイで評価し細胞死を誘導し;正（死）細胞の数をフローサイトメトリーによって決定しました。すべての実験データは、可能な同時の統計分析を行うために、それぞれの制御条件（コントロール= 1）に正規化しました。 * =コントロールにP≤0.05について。バーは平均の標準誤差（SEM）を表します。 fromreference 8変更された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：HEI-OC1 細胞」分裂速度 および老化にAPAP及びシスプラチンの影響。 （A） HEI-OC1細胞の有糸分裂の速度で薬物誘発性の変化は、24及び48時間でのBrdUアッセイを用いて評価した。HEI-OC1細胞における（B）薬物誘導性の老化フローサイトメトリーによって測定し、老化しました関連βガラクトシダーゼ（SA-Bgal）技術。すべての実験データは、可能な同時の統計分析を行うために、それぞれの制御条件（コントロール= 1）に正規化しました。 * =コントロールにP≤0.05について。バーは平均の標準誤差（SEM）を表します。修正されたfromreference 8。 トンの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。彼の姿。
図4：P-HEI-OC1およびNP-HEI-OC1細胞におけるプレスチン発現-細胞は、抗プレスチン抗体で標識し、共焦点顕微鏡とフローサイトメトリーによって観察された （A）P-HEI-OC1細胞ではで主に免疫局在プレスチン細胞質（矢印）。 NP-HEI-OC1細胞（B）は 、対照的に、プレスチン反応性は細胞膜（矢印）で濃縮しました。 （CおよびD）は、NP状態（D）で2週間培養HEI-OC1細胞におけるフローサイトメトリー研究フローP-HEI-OC1細胞（C）にプレスチン発現に関して明確な増加を示しました。 （C）挿入図は、二次的なものです ABのみ（陰性対照）。参照9から変更。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：P-HEI-OC1 およびNP-HEI-OC1細胞 （A）パッチクランプHEI-OC1セル内NLC研究 。 （B - D）NLC P-HEI-OC1およびNP-HEI-OC1細胞インチNLCのピークの減少とよりNP-HEI-OC1のセルの値を脱分極する曲線の漸進的シフトに注意してください。参照9から修正された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このレポートでは、どのように文化HEI-OC1細胞をに説明し、薬剤誘発性細胞毒性のメカニズムを評価するためにそれらを使用し、プレスチン、蝸牛OHCSの分子モーターの機能特性を調査します。技術的手順は、しかしながら、容易に別の試験に適合することが十分に一般的です。
ここで説明するすべてのプロトコルは、十分に確立された細胞培養技術10の正しい使用を必要とします。ただ、他の細胞株と同様に、HEI-OC1細胞での作業は認定生物学的安全キャビネット、冷却遠心機、水浴、および細胞培養物の検査のための1つの倒立顕微鏡を用いてカウントを細胞について適切に装備した細胞培養施設を必要とし、 hemocytometric技術を使用している場合。固有の要件は、しかしながら、NP-HEI-OC1細胞39℃/ 5％CO 2でのP-HEI-OC1細胞を33℃/ 10％CO 2で2加湿インキュベータ、一組の利用可能性およびその他であります秒。計画された研究のみがP-HEI-OC1細胞を含む場合、第二のインキュベータを37℃/ 5異なるアッセイについての％CO 2に設定することができます。
プラスチック細胞培養皿の使用はHEI-OC1細胞を操作するための重要な追加必須です。実際には、HEI-OC1細胞は非常に堅牢であり、彼らは別の面で、非常に異なる条件下での増殖ます。しかし、それらの表現型と薬物および他の刺激に対する反応が強く培養パラメータ（G Kalinec＆F Kalinec、未発表）に依存します。我々は以前の紙8で論じたように、HEI-OC1細胞のこの可塑性は、有利には、新規の実験を設計するために使用されてもよいです。例えば、よく蝸牛外リンパ中の酸素圧は海面（〜21.3キロパスカル）27に典型的なインキュベーター中でより（約2キロパスカル）はるかに低いことが知られています。低いO 2濃度でインキュベートHEI-OC1細胞は、おそらくそれらを監査するためのより良いモデルを作り、その応答を変更しますORY感覚細胞。
HEI-OC1細胞の培養および継代培養のために記載されたプロトコルは、このようなコルチ11,12とSVの臓器からOC-K3と同じトランスジェニックマウスから我々の研究室で開発された他の聴覚の細胞株でも使用することができることを強調すべきです-k1線条から13,14 vascularis。また、これらの細胞株は、選択された実験でHEI-OC1細胞のためのコントロールとして有用であり得ます。例えば、我々は最近、反比例免疫反応性がプレスチンするとHEI-OC1の細胞の細胞膜でのNa + K + ATPアーゼ抗体は、細胞型依存性応答ではなく、トランスジェニックマウスから関連付けられていたことを実証するためにSV-K1細胞を使用していましたこれは、これらの細胞が9を得ました。
HEI-OC1細胞を操作するための他の重要な要件は、70％eで安全キャビネット内のすべての作業面を洗浄するなどの適切な無菌技術の練習ですthanolまたはイソプロパノールと手続きに必要な物質の除染。他の哺乳動物細胞株は、しばしばペニシリン - ストレプトマイシンまたは他の類似の組み合わせを使用して、不注意な細菌汚染から保護されている間しかし、抗生物質は研究の目的は、その効果を調べることである場合を除き、HEI-OC1細胞を使用してはなりません。 HEI-OC1細胞を、抗生物質を含まない条件下で生成された、と彼らは抗生物質耐性細胞の出現を減らすために避けなければなりません。
最後に、我々はすでにポイントを再強調し、この報告書で何度か言及したい：表現型および薬物および他の刺激にHEI-OC1細胞の応答は強く培養パラメータに依存します。したがって、HEI-OC1細胞を扱う研究室は、他のグループによって提供されるとの結果が真に同等にするために同様のプロトコルおよび細胞培養条件を使用することが非常に重要です。また、それはHEI-OC1細胞株は、モデルが持っているすべての制限付きで、唯一のモデルであることを覚えておくことが非常に重要。 HEI-OC1細胞を用いたin vitro実験を正確に実際の聴覚感覚細胞のin vivoでの応答を表すデータを提供することを期待することは非現実的です。しかし、我々は強くHEI-OC1細胞株は、聴覚感覚細胞および薬理学的薬剤の潜在的な耳毒性のスクリーニングの機能的応答を調査するための有用なモデルであると考えています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEI-OC1 cells | ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS | ||
| Class II Biological Safety cabinet | The Baker Company | Sterilgard III | AND COMPANIES INDICATED IN THE |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY |
| Inverted microscope | Zeiss | Axiovert 25 | EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR |
| Waterbath | Stovall | HWB115 | PRODUCT COULD BE USED. |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto T4 | |
| Two (2) Cell incubators, one at 33 °C/10% CO2 and other at 39 °C/5% CO2 | Forma Scientific | 3110 | |
| Cell culture dishes, PS, 100 mm x 20 mm with vents | Greinier Bio-One | 664-160 | |
| Cell culture dishes , PS, 60 mm x 15 mm with vents | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Cellstar tissue culture flasks 250 ml | Greiner Bio-One | 658-175 | |
| Cellstar tissue cultur flasks 550 ml | Greiner Bio-One | 660-175 | |
| 6 well cell culture plate, with lid-Cellstar | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Microtest Tissue culture plate, 96 well, flat bottom with lid | Becton Dickinson | 353072 | |
| Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white, clear bottom | Greiner Bio-One | 655098 | |
| 50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars | Becton Dickinson | 352070 | |
| 15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars | Greiner Bio-One | 188-271 | |
| PBS pH 7.4 (1x) | Life Technologies | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH10073.1 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco/Invitrogen | 21083-027 | |
| Trypsin, 0.25% | Life Technologies | 25200-056 | |
| TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4890-25-K | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8091 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling | 6813 | |
| Non-enzymatic cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | C5789 | |
| Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G8741 | |
| FACSAriaIII instrument | BD Biosciences | FACSAriaIII | With 488 nm excitation (blue laser) |
| Digital Blot Scanner | LI-COR | C-DiGit | |
| Electrophoresis and Blotting Unit | Hoefer | SE300 miniVE | |
| Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software | Molecular Devices | SpectraMax 5 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Puller for preparing patch electrodes | Sutter Instruments | P-97 |
References
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