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Biology

El trabajo con células auditivas HEI-OC1

Published: September 3, 2016 doi: 10.3791/54425
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Head and Neck Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Introduction

House Ear Institute-órgano de Corti 1 células (IES-OC1) se derivan del órgano de la audición de un 1,2 ratón transgénico. La incubación de cualquier célula de este ratón transgénico a 33 ° C / 10% de CO 2 (condiciones permisivas) induce la expresión de un gen de inmortalización que desencadena de-diferenciación y la proliferación acelerada; mover las células a 39 ° C / 5% de CO 2 (condiciones no permisivas) conducen a disminución de la proliferación, la diferenciación y, por lo menos en el caso de HEI-OC1, la muerte celular 2,3.

células HEI-OC1 fueron clonados y caracterizados en nuestro laboratorio hace más de una década, y los estudios iniciales indicaron que expresan marcadores específicos de células ciliadas cocleares, como prestin, miosina 7a, Atoh1, BDNF, calbindina y calmodulina, sino también los marcadores de apoyo células como la conexina 26 y el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF-R) 2. Por lo tanto, se sugirió que HEI-OC1 podría representar un common progenitoras de las células sensoriales y de soporte del órgano de Corti 2. Estudios paralelos proporcionan una fuerte evidencia de que arquetípica fármacos ototóxicos, tales como cisplatino, gentamicina y estreptomicina inducida por la activación de la caspasa-3 en estas células, mientras que los medicamentos que se consideran no ototóxicos, como la penicilina, no lo hicieron 2,3. Por lo tanto, esta línea celular fue propuesto como un sistema in vitro para investigar los mecanismos celulares y moleculares implicados en la ototoxicidad y para la detección de la ototoxicidad potencial o propiedades otoprotective de nuevos medicamentos farmacológicos. Se estima que las células HEI-OC1 se han utilizado en más de ciento cincuenta estudios publicados en los últimos diez años.

Mientras que mirando el potencial pro-apoptóticos efecto de diferentes drogas fue el principal objetivo de la mayoría de los estudios con esta línea celular, otros procesos celulares importantes como la autofagia y la senescencia simplemente han comenzado a ser investigado en células HEI-OC1 4-7. yona reciente estudio realizado en nuestro laboratorio 8, que utiliza células HEI-OC1 para recoger un conjunto completo de datos sobre la muerte celular, la supervivencia, proliferación, senescencia y la autofagia inducida por diferentes drogas farmacológicas utilizadas con frecuencia en la clínica. También comparamos algunas de las respuestas de las células HEI-OC1 con las de células HEK-293 (células de riñón embrionario humano) y HeLa (células epiteliales humanas) que recibe un tratamiento idéntico. Nuestros resultados indican que las células HEI-OC1 responden a la cada fármaco de una forma característica, con una dosis-distintivo y la sensibilidad dependiente del tiempo de al menos uno de los mecanismos en estudio. También hicimos hincapié en que el estudio que una correcta interpretación de los resultados experimentales requerirá la realización de estudios paralelos con más de una técnica 8.

En un estudio diferente se investigó el uso de células HEI-OC1 para evaluar la respuesta funcional de prestin, la proteína de motor de las células ciliadas externas cocleares (CCE) 9 + K + ATPasa, que transloca desde la membrana plasmática al citoplasma sin cambios significativos en la expresión de células total. Además, hemos demostrado que las células P-HEI-OC1 tienen un robusto NLC asociado a prestina la función motora, que disminuye cuando la densidad de las moléculas de prestina presentes en la membrana plasmática se incrementó. En conjunto, estos resultados apoyan firmemente la utilidad de HEI-OC1 en las células para investigar las proteínas auditivas.

En este artículo de vídeo se describe cómo la cultura células HEI-OC1, por lo que es conveniente utilizar células que crecen en condiciones permisivas (P-IES-OC1) para los estudios de citotoxicidad, la forma de evaluar el mecanismo / s de la citotoxicidad inducida por fármacos y cómo para llevar a cabo estudios electrofisiológicos (por ejemplo, patch-clamp, la capacitancia no lineal (NLC)) para investigar las propiedades funcionales de prestin, el motor molecular de OHCs cocleares.

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Protocol

1. Cultura de la célula

Nota: Todos los protocolos de cultivo celular deben realizarse mediante técnicas de cultivo celular adecuados (para referencia ver los 3 primeros capítulos de Biología Celular: Un Manual de Laboratorio, Volumen I 10). células HEI-OC1 no requieren ningún recubrimiento adicional o el tratamiento de las placas de cultivo celular para la adherencia y el crecimiento adecuado. Muy importante: no utilice platos de vidrio para fines de cultivo de células; el fenotipo y la respuesta biológica de las células a los fármacos farmacológicos cambiarán (G Kalinec & F Kalinec, no publicado); Se recomiendan las placas de cultivo celular de plástico convencionales (véase la Tabla de Materiales / Equipos). Prestar especial atención a las técnicas asépticas para evitar contaminaciones, pero nunca utilizar antibióticos (por ejemplo, ampicilina o estreptomicina) con células HEI-OC1. Si es necesario, utilizar anfotericina B. Mientras que las células HeLa y HEK-293 se han empleado como control en los estudios anteriores con HEI-OC1 8, cualquier otra línea celular podríaser aceptable para este propósito.

  1. Regeneración de las células congeladas HEI-OC1
    Nota: Este protocolo también se puede utilizar con otras líneas de células de la misma de ratón transgénico desarrollado en nuestro laboratorio, tal como OC-k3, de órgano de Corti 11,12, y SV-k1, de estría vascular 13,14.
    1. Retirar un vial de células criopreservadas HEI-OC1 de N2 líquido, y colocarlo en un baño de agua a 37 ° C. Sumergir solamente la mitad inferior del vial, y deje que se descongele hasta que sólo una pequeña cantidad de hielo permanece en el vial. Limpiar el exterior del vial con alcohol al 70%.
    2. Pipetear las células del vial y entregar todo el volumen (~ 1,5 x 10 5 células / ml) lentamente, gota a gota, en un tubo cónico de 15 ml que contiene 10 ml de un medio de crecimiento pre-calentado, como por Dulbecco medio de Eagle modificado ( DMEM), suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS).
    3. Eliminar DMSO centrifugando el tubo a 300-500 xg durante 5 min, descartar tél sobrenadante y volver a suspender las células en 9 ml de medio de cultivo fresco (DMEM + 10% FBS). Deshacer los agregados o láminas de células por flujo y reflujo de las células en suspensión, de la pipeta para el medio, y viceversa, de tres a cuatro veces con la punta de la pipeta de tocar la parte inferior del tubo.
    4. Coloque el volumen total de las células suspendidas en medio de crecimiento en mm de diámetro 100, placas de cultivo celular de plástico no tratadas.
    5. Se incuban las células a 33 ° C con 10% de CO 2 (condiciones permisivas).
  2. Subcultura de células HEI-OC1
    Nota: Antes de la confluencia (~ 80%), las células deben ponerse en suspensión y sub-cultivadas con el fin de evitar que la cultura de morir. Este protocolo también se puede utilizar con otras líneas de células desarrolladas en nuestro laboratorio a partir de la misma de ratón transgénico, como OC-k3, de órgano de Corti 11,12, y SV-k1, de estría vascular 13,14.
    1. Eliminar el medio viejo y se lavan las células con 2 ml de PBS. </ Li>
    2. Cubrir la monocapa de células con una solución de 0,25% de tripsina, utilizando 1 ml por 25 cm 2 de área de superficie. Para pasar a la siguiente etapa más del 40% de las células se debe separar. Se examinan las células utilizando un microscopio invertido y, si es necesario, "palmada o toque" las placas de cultivo suavemente para liberar las células unidas restantes.
      Nota: Tenga cuidado como tripsinización durante períodos prolongados puede causar la muerte celular; no es suficiente y las células transferidas se insuficiente para los estudios previstos.
    3. Resuspender las células, siguiendo el procedimiento descrito en 1.1.3, y transferirlos a un tubo cónico de 15 ml.
    4. Se centrifuga durante 5 min a 300-500 xg, se elimina el medio, recoger las células con medio de cultivo fresco y la semilla en, al menos, cuatro de 100 mm de diámetro placas de cultivo celular. El número de células por placa dependerá de la cantidad de células recuperadas. Se incuban las células a 33 ° C con 10% de CO 2 (P-HEI-OC1) y dividir de nuevo tantas veces como sea necesario paralos experimentos planeados o para generar una nueva acción.
    5. Para la preparación de valores, reemplazar placas de 100 mm de diámetro de 250-550 ml frascos de cultivo celular; para los experimentos, pequeños platos o placas multi-pozos pueden ser más adecuada.
    6. Para la diferenciación, incubar las células HEI-OC1 en condiciones permisivas hasta que llegan a ~ 80% de confluencia; a continuación, mover los platos a 39 ° C con 5% de CO 2 (NP-HEI-OC1) de 2 a 3 semanas.
      Nota: Las células se detendrán progresivamente la proliferación y la muerte. Cambiar el medio cada dos días para eliminar las células muertas. Dependiendo del número original de células, por lo general después de ~ 4 semanas no hay más células estarán disponibles para los experimentos. La diferenciación se inicia tan pronto como las células se colocan en condiciones de NP, pero no todas las células se diferencian en el mismo paso. Es importante destacar que, prestina expresión y localización de la membrana aumenta durante el proceso de diferenciación (ver resultados representativos, Figura 4), ​​proporcionando una cualitativay la indicación cuantitativa del nivel de diferenciación.

2. estudios de citotoxicidad de Drogas

Nota: Se recomienda células HEI-OC1 cultivadas en condiciones permisivas (P-IES-OC1) para estos estudios (ver resultados representativos, Figura 1).

  1. La viabilidad celular (ensayo MTT)
    1. Recoger las células P-HEI-OC1 siguiendo el procedimiento descrito en 1.2, y contarlas, ya sea con un contador automático de células o hemocitómetro. Ajustar la concentración de 2,0 x 10 5 células / ml.
    2. Sembrar las células en placas de 96 pocillos de fondo plano claros (100 l por pocillo), incubar durante la noche para la unión al sustrato, y luego tratarlas con los fármacos de interés. No se olvide de incluir espacios en blanco y los no-células tratadas (control)!
    3. Después del tratamiento de drogas (por lo general 24 o 48 horas a 33 ° C), lleve a cabo el ensayo de MTT tras el protocolo del fabricante. En general, Los protocolos para este ensayo tienen los siguientes pasos:
      1. Añadir 10 l de reactivo MTT a cada pocillo.
      2. Incubar la placa a 37 ° C durante 2 a 4 horas hasta tinte púrpura es visible, y luego añadir 100 l del detergente de reactivo MTT a cada pocillo. No agite la placa.
      3. Cubrir la placa y se deja en la oscuridad durante 2 a 4 horas a 37 ° C.
      4. Use un lector de placas de microplacas para medir la absorbancia a 570 nm en cada pocillo, incluyendo los espacios en blanco (medio de crecimiento por sí solo). Normalizar los datos usando la densidad óptica promedio en las células control como 100% de viabilidad.
  2. Ensayo de activación de la caspasa 3/7
    Nota: Se recomienda células HEI-OC1 cultivadas en condiciones permisivas (P-IES-OC1) para estos estudios.
    1. Recoger las células HEI-OC1 siguiendo el procedimiento descrito en 1.2, y contarlas ya sea con un contador de células automático o un hemocitómetro. Ajustar la concentración de 2,0 x 10 5 células / ml.
    2. Sembrar las células en white de paredes de placas de 96 pocillos (100 l por pocillo), incubar durante la noche para la fijación al sustrato, y luego tratarlas con los fármacos de interés. No se olvide de incluir espacios en blanco y los no-células tratadas (control)!
    3. Después del tratamiento de drogas (generalmente 24 o 48 horas a 33 ° C), lleve a cabo el ensayo de caspasa siguiendo el protocolo del fabricante respectivo. En general, los protocolos para este ensayo tienen los siguientes pasos:
      1. Preparar los reactivos, mezclar bien, y dejar que se equilibren a temperatura ambiente.
      2. Eliminar las células de la incubadora y permitir que las placas se equilibren a temperatura ambiente.
      3. Añadir la cantidad indicada de reactivo a cada pocillo, teniendo cuidado de evitar la contaminación cruzada no tocando los pocillos que contenían diferentes muestras con las mismas puntas de pipeta.
      4. Cubrir la placa y mezclar durante 30 segundos usando un agitador de placas a 300-500 rpm.
      5. Se incuba la placa a temperatura ambiente durante un período de, al menos, 30 min. determine el período de incubación óptima empíricamente. Si la temperatura ambiente fluctúa utilizar una incubadora a temperatura constante, debido a las fluctuaciones de temperatura afectarán a la lectura de luminiscencia.
      6. Medir la luminiscencia en cada pocillo, y normalizar valores utilizando luminiscencia medio en las células de control como 100% de activación de la caspasa.
  3. La división celular (proliferación)
    1. Recoger las células HEI-OC1 siguiendo el procedimiento descrito en 1.2, y contarlas ya sea con un contador de células automático o un hemocitómetro. Ajustar la concentración de 2,0 x 10 5 células / ml.
    2. Sembrar las células en placas de 96 pocillos de fondo plano claros (100 l por pocillo), se incuba durante la noche a condiciones permisivas para la unión al sustrato, y luego tratarlas con los fármacos de interés. No se olvide de incluir espacios en blanco y los no-células tratadas (control)!
    3. Una hora después del tratamiento, añadir a cada pocillo 1 l de BrdU 100x preparada (5-bromo-2'-deoxyuricenar) solución, y devolver las placas a la incubadora a 33 ° C.
    4. Después de 12, 24 y 48 horas, se elimina el medio existente de las placas correspondientes y lavarla una vez con PBS.
    5. Realizar el ensayo de proliferación de células siguiendo el protocolo del fabricante. En general, los protocolos para este ensayo tienen los siguientes pasos:
      1. Preparar los reactivos, incluyendo fijación / solución desnaturalizante, tampón de lavado, solución de detección de anticuerpo primario, solución de detección de anticuerpo secundario, y la solución de BrdU como se indica en el protocolo del fabricante.
      2. Añadir la solución de fijación / desnaturalización a cada pocillo, en las cantidades indicadas en el protocolo del fabricante, y mantener la placa a temperatura ambiente durante 30 min.
      3. Eliminar la solución de fijación / desnaturalización y añadir el anticuerpo primario a la concentración indicada en el protocolo del fabricante. Mantener la reacción a temperatura ambiente durante 1 hr.
      4. Retire la solución con la hormiga primariaibody, lavar la placa 3 veces con tampón de lavado, y luego añadir el anticuerpo secundario a la concentración indicada en el protocolo del fabricante. Mantener la reacción con el anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 30 min.
      5. Retire la solución con el anticuerpo secundario, lavar la placa 3 veces con tampón de lavado, y añadir el sustrato. Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, se añade la solución de parada. Tenga cuidado: Controla el cambio de color; Si la solución se vuelve muy oscuro, detener la reacción antes de la hora de desarrollo estándar de 10 min.
      6. Leer la absorbancia a 450 nm dentro de los 30 min de la adición de la solución de parada.
  4. citotoxicidad
    Nota: Se recomienda células HEI-OC1 cultivadas en condiciones permisivas (P-IES-OC1) para estos estudios.
    1. Incubar a condiciones permisivas, por lo general durante 24 a 48 horas, las células HEI-OC1 en medio de cultivo celular solo (control) o medio más los fármacos de interés.
    2. Al final del tratamiento, Lavar las células tres veces con PBS, y separar usando 1 ml por 25 cm 2 de área de superficie de una solución de disociación celular no enzimática de 3 min.
    3. Después de separar, recoger y sedimentar las células por centrifugación a 3000 xg durante 5 min, eliminar el sobrenadante, y manchar las células durante 15 min en la oscuridad con el reactivo incluido en el ensayo de citotoxicidad.
    4. Determinar el número de células HEI-OC1 vivo por citometría de flujo como se indica por el fabricante del citómetro de flujo.
  5. Senectud
    1. Incubar a condiciones permisivas, por lo general durante 24 a 48 horas, las células HEI-OC1 en medio de cultivo celular solo (control) o medio más los fármacos de interés.
    2. Determinar el número de células positivas asociada a la senescencia beta-galactosidasa usando citometría de flujo con el protocolo descrito por Debacq-Chainiaux et al. 15 u otro método conocido para proporcionar resultados fiables. Una breve protocolo para la citometría de flujo es el siguiente:
        <li> Al final de los tratamientos experimentales, se lavan las células tres veces con PBS y después se incuban con 100 nM bafilomicina A1 en medio de cultivo de células durante 1 hora a condiciones permisivas.
      1. Añadir C12FDG a una concentración final de ~ 33 m, y continuar la incubación de las células durante 1-2 horas.
      2. Lavar las células dos veces con PBS, cosecharlos usando 1 ml por 25 cm 2 de área de superficie de una solución de disociación celular no enzimática de 3 min, y sedimentar ellos por centrifugación a 3000 xg durante 5 min.
      3. Resuspender las células en PBS enfriado con hielo y determinar el número de células HEI-OC1 positivos por citometría de flujo como se indica por el fabricante del citómetro de flujo.
  6. La autofagia
    1. Recoger células HEI-OC1 controlar y hambre (privados de suero durante 48 hr) siguiendo el procedimiento descrito en 1.2, y los procedimiento para la transferencia de Western siguiendo protocolos estándar. En general, los protocolos de transferencia de Western tienen el siguiente stePS:
      1. Semillas células HEI-OC1 en placas de 6 pocillos a una concentración de 1,0 x 10 5 células / ml. Después de 24 y / o 48 horas, se lavan las células con PBS helado.
      2. Lyse con 200 l de tampón de TNESV (1% de NP40, Tris-HCl 50 pH 7,5, NaCl 100 mM, 2 mM EDTA, 1 mM Na 3 VO 4) con cóctel inhibidor de la proteasa PMSF y 1 mM durante 5 min en hielo.
      3. Recoger las células (por raspado de la parte inferior de cada pocillo), transferir a tubos de microcentrífuga y se centrifuga a 16.800 xg durante 5 min a 4 ° C.
      4. Recoger los sobrenadantes y cuantificar la concentración de proteína utilizando el ensayo BCA.
      5. Añadir tampón de carga 5x y DTT 1 mM a cada muestra y hervir durante 5 min para desnaturalizar las proteínas.
      6. Ejecutar las muestras mediante SDS-PAGE en un gel al 4-12%, y la transferencia a membranas de PVDF.
      7. Bloquear las membranas con 5% de leche sin grasa seca en TBS-T con 0,1% de Tween 20 durante 60 min a RT.
      8. Se incuban las membranas durante la noche a 4 ° C con la hormiga primariaibodies.
      9. El día siguiente, lavar las membranas extensamente con TBS-T, y se incuba con un anticuerpo de IgG secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (1: 1500) durante 1 hr.
      10. Detectar la inmunorreactividad con un aumento de quimioluminiscencia (ECL) sistema de detección. Normalizar los niveles de proteína de expresión utilizando GAPDH (1: 2000 en TBS-T con 10% de leche en polvo descremada) como estándar.
    2. En las transferencias de Western investigar la expresión de, al menos, dos marcadores diferentes de la autofagia como Beclin-1 y LC3B (por lo general a 1: 1000 dilución en TBS-T con 2,5% de BSA). No se olvide de buscar un control de la expresión de proteínas, como GAPDH o actina.
    3. Evaluar la expresión de la proteína de interés por densitometría usando un escáner Blot digital o software de ordenador, tales como el dominio público NIH Image o ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/).

3. Los experimentos de electrofisiología con células HEI-OC1

  1. Las células de cosecha
    Nota: Use las células que crecen en placas de cultivo de 100 mm de diámetro en el 50% -80% de confluencia. La tripsina, Accutase, solución libre de enzima, o p hosphate- b aline + e uffered s tileno d iamine t etra un ácido Cetic (PBS-EDTA) se puede utilizar para la elevación de las células sin efectos significativos en el número y la calidad de los gigaseals . En algunos casos, sin embargo, el tratamiento con tripsina hace que las células más frágil. En estos casos, permiten que las células se recuperaran durante aproximadamente 30 minutos antes de comenzar los experimentos.
    1. Se lavan las células dos veces con 10 ml de PBS sin Ca2 + y Mg2 +.
    2. Añadir 2 ml de una solución separador libre de enzimas, tales como la solución de disociación celular no enzimática, y se incuban los platos durante 3 min a 37 ° C con 5% de CO 2.
    3. Utilizar un microscopio invertido para comprobar el desprendimiento de las células. Si es necesario, mueva el cell placa de cultivo para separar más células, pero hágalo con suavidad.
      Nota: No agite el plato.
    4. Añadir 10 ml de DMEM + 10% FBS y pipeta de las células suavemente hacia arriba y hacia abajo cinco veces con una pipeta de 10 ml.
    5. Mira las células bajo un microscopio. Si> 80% de las células ya están separados (individual), no se necesitan más de pipeteo. Si las células se encuentran todavía en racimos, repetir el pipeteando suavemente hasta más de 80% de las células son individuales.
    6. Coloque los ~ 10 ml de células suspendidas en un tubo cónico de 15 ml, se centrifuga durante 2 min a 100 xg, y descartar el sobrenadante.
    7. Usar ~ 200 l de solución de grabación externo (medio L-15 de Leibovitz ajustó a 305 - 310 mOsm con agua destilada) para volver a suspender las células. Un control óptico de las células debe mostrar muchos, células redondas individuales con bordes lisos de membrana.
  2. Patch-clamp y las mediciones del NLC
    1. Realizar patch-clamp y las mediciones de capacitancia no lineal dependiente de voltaje (NLC) utilizando unaamplificadores dequate y software, así como técnicas electrofisiológicas estándar. Como el uso de la solución (intrapipette) interna KCl 150 mM, 1 mM MgCl 2, EGTA 0,1 mM, 2 mM ATP-Mg, 0,1 mM de GTP-Na, y HEPES 10 mM; ajustar el pH a 7,2 con Tris.
    2. Bajo el microscopio, un solo, célula sana, con bordes redondos y lisos de membrana. Coloque la punta de la pipeta de vidrio a la superficie celular y comprobar la resistencia de la membrana. Esto debería ser alrededor de 3-6 megaohmios, que corresponde a un diámetro interno (ID) de la punta de la pipeta de ~ 2 micras.
    3. Presione suavemente la punta de la micropipeta contra la membrana plasmática de la célula y luego aplicar el vacío. Una parte de la membrana celular se filtra con succión en la pipeta, la generación de una resistencia eléctrica en el orden de 10 - 100 gigaOhms (gigaseal).
    4. Establecer la condición de células enteras mediante la interrupción de la membrana de plasma con impulsos de aspiración.
    5. Utilizar células que no expresan prestin, tales como HEK-293, como control 9.
      Nota: Las respuestas actuales deben ser filtrados a 5 kHz, y correcciones para reflejar los efectos de la resistencia en serie residual. Toda la recopilación de datos y la mayoría de los análisis se pueden realizar utilizando el software incluido generalmente con los amplificadores lock-in. Función de la capacitancia se puede montar en la primera derivada de una función de Boltzmann dos estados relativos carga no lineal de voltaje de la membrana 16.

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Representative Results

En un par de publicaciones recientes se informó de un amplio conjunto de estudios dirigidos a evaluar la respuesta de las células HEI-OC1 a varios medicamentos farmacológicos de uso común, así como la investigación de la función prestina 8,9. En estos estudios hemos hecho uso de todos los protocolos descritos en las secciones anteriores.

Uno de los resultados de estos estudios anteriores era que las células HEI-OC1 cultivaron a condiciones no permisivas (39 ° C / 10% de CO 2 = NP-HEI-OC1) mostró una disminución muy significativa de la viabilidad celular, y un aumento igualmente significativo en la muerte celular, respecto a las células cultivadas en condiciones permisivas (33 ° C / 10% de CO 2 = P-HEI-OC1) (Figura 1). Por lo tanto, cualquier estudio de citotoxicidad realizó en las células NP-IES-OC1 deben dedicar esfuerzos considerables para discriminar efectos de los medicamentos de los efectos de las condiciones de cultivo. Ademasn, ya que los efectos del fármaco sobre las células ya morir o con una disminución de la viabilidad podría ser diferente que los efectos de la misma droga en las células sanas, que recomiendan el uso de células P-IES-OC1 para los experimentos que no requieren específicamente las células diferenciadas.

Nuestros estudios sobre el efecto de diferentes fármacos farmacológicos también produjeron resultados interesantes. Por ejemplo, el cisplatino, un agente quimioterapéutico que se usa con frecuencia para el tratamiento de varios tumores malignos humanos, y acetaminofeno (APAP = N- un pa cetyl- ra-amino p henol), el over-the-counter analgésico más ampliamente vendidos en los EE.UU., eran ambos tóxicos para las células HEI-OC1 (Figura 2). Sin embargo, mientras APAP disminución de la viabilidad celular y el aumento de la caspasa 3/7 de activación, que no indujo la muerte celular. El cisplatino, por el contrario, aumentó significativamente las tres respuestas (Figura 2). Curiosamente, las caspasas 3/7 eran mostly activa a concentraciones más bajas de cisplatino, lo que sugiere que la muerte celular inducida por dosis bajas de cisplatino probablemente estaba mediada por apoptosis, mientras que las altas dosis efectos letales podrían estar asociados con oncosis / necroptosis. Mientras oncosis se ha definido como una vía pre-letal conduce a la muerte celular no regulado acompañada de inflamación celular y de orgánulos, formación de ampollas, y aumento de la permeabilidad de la membrana 17,18, necroptosis es un mecanismo de la muerte celular no apoptótica regulada activado por los mismos estímulos que inician apoptosis pero con características morfológicas similares a las de oncosis 19-22.

Estudios adicionales dirigidos a investigar los efectos de APAP y cisplatino en las células P-IES-OC1 mostraron un claro efecto, dependiente de la dosis de APAP sobre la proliferación celular que podría explicar la disminución intrigante de la viabilidad celular y sin muerte celular descrito en el párrafo anterior (figura 3A). ALS cisplatino o disminución de la proliferación celular, y su efecto aumenta con el tiempo de exposición incluso para pequeñas dosis (Figura 3a), pero además de la disminución de la senescencia en todas las concentraciones y puntos de tiempo incluidas en nuestro estudio (Figura 3B). La disminución significativa en la senescencia celular inducida por cisplatino podría explicarse por el incremento en la muerte celular, en el supuesto de que las células senescentes serían, probablemente, con tendencia a mueren más rápidamente que las células sanas 23.

Es importante destacar que estos resultados sugieren que las células representativas HEI-OC1 responden a diferentes medicamentos farmacológicos con una dosis-distintivo y la sensibilidad dependiente del tiempo de al menos uno de los mecanismos en estudio. Por lo tanto, una interpretación correcta de cualquier resultado experimental requerirá una clara comprensión de los procesos celulares particulares investigados y la información proporcionada por cada una de las técnicas utilizadas para evaluarlas.

jove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> confocal y citometría de flujo experimentos, por el contrario, confirmó la expresión en células prestina P-IES-OC1 y NP-IES-OC1, con prestina immunolocalizing sobre todo en el citoplasma de las células P-HEI-OC1 (Figura 4A, flechas), y más concentrado en la membrana plasmática en las células NP-HEI-OC1 (Figura 4B, flechas). la citometría de flujo estudios mostraron un claro aumento de la expresión prestin en NP-HEI -OC1 células respecto a las células P-HEI-OC1 (Figuras 4C y 4D). El aumento dependiente del tiempo en la expresión y localización de la membrana de plasma de prestin en las células NP-HEI-OC1 sugiere que la translocación fue acompañada por síntesis de más moléculas prestina. sin embargo, estos experimentos no proporcionan pistas para decidir si las moléculas prestina originalmente situadas en el citoplasma movimiento a la membrana plasmática y las nuevas moléculas de ellos sustituyen, si permanecen en el citoplasma y sólo el recién synthesized prestina se mueve a la membrana de plasma, o una combinación de ambos procesos.

Estudios electrofisiológicos mostraron un robusto NLC en las células P-HEI-OC1 (Figura 5B), con un valor de pico que la disminución y un voltaje en el pico de la capacitancia que se desplazó a valores más despolarizados, cuando las células se trasladaron a condiciones no permisivas para 1 y 2 semanas (Figuras 5C y 5D). Debido a la translocación progresiva de prestin desde el citoplasma a la membrana plasmática, que originalmente la hipótesis de que NLC sería mayor en NP-HEI-OC1 que en las células P-HEI-OC1, y que sería aumentar aún más con el tiempo de incubación a NP condiciones. Sorprendentemente, los resultados de nuestros estudios mostraron exactamente la respuesta opuesta. Especulamos que el aumento de la densidad de moléculas prestina en la membrana plasmática podría ser la restricción de su función de motor.

hin-page = "1"> Nota en la Figura 5, la despolarización de la tensión en la capacitancia pico en células HEI-OC1 respecto a los valores típicos reportados en las CCE y en células HEK293 transfectadas 24; Por otra parte, observamos que el cambio de despolarización aumenta con el tiempo en condiciones de NP. El cambio de despolarización progresiva es similar a la descrita en OHCs durante ratón y rata desarrollo 25,26, y se ha sugerido que podría estar relacionada con el desarrollo de otras estructuras celulares asociados con la membrana plasmática de la OHC 25, o un proceso de maduración intrínseca prestina a 24.

Esperamos que esta breve recuento de algunos estudios con células HEI-OC1 proporciona suficiente evidencia de la utilidad potencial de las células HEI-OC1 para la investigación de un amplio espectro de respuestas celular y molecular.

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Figura 1: Viabilidad celular y muerte celular en P-IES-OC1 y NP-IES-OC1 células. Viabilidad (A) Cell evaluó con el ensayo MTT. Se midió la absorbancia con un lector de placas, y OD medio en las células de control se tomó como 100% de viabilidad. La muerte (B) de la célula evaluada con un ensayo de citotoxicidad. El número de células positivas (muertos) fue determinada por citometría de flujo con 488 nm de excitación (láser azul) y FL1: 530 15 nm. Tenga en cuenta el (≤0.001 P) disminución muy significativa de la viabilidad celular (A) y el aumento de la muerte celular (B) inducida por condiciones no permisivas. Las barras representan el error estándar de las medias (SEM). Modificado de la referencia 8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2:. Respuestas de las células HEI-OC1 Expuestos a APAP y cisplatino cuando se analiza por MTT, caspasas 3/7 y la citotoxicidad ensayos de viabilidad (A) Cell evaluado con el ensayo de MTT, y la absorbancia midieron con un lector de placas. (B) La activación de las caspasas ejecutoras 3/7. (C) La muerte celular inducida evaluada con un ensayo de citotoxicidad - Drogas; el número de células positivas (muertos) se determinó por citometría de flujo. Los datos de cada experimento se normalizaron a las condiciones de control respectivos de control (= 1) para hacer posible el análisis estadístico simultánea. * = P ≤0.05 respecto al control. Las barras representan el error estándar de las medias (SEM). Modificado fromreference 8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Efectos de la APAP y cisplatino en HEI-OC1 Cells mitótico tarifas y senescencia. (A) Cambios inducidos por fármacos sobre la tasa de división mitótica de las células HEI-OC1, a las 24 y 48 horas, se evaluó con un ensayo BrdU. (B) la senescencia inducida por fármacos en células HEI-OC1 se midió por citometría de flujo y la senescencia asociado β-galactosidasa (SA-Bgal) técnica. Los datos de cada experimento se normalizaron a las condiciones de control respectivos de control (= 1) para hacer posible el análisis estadístico simultánea. * = P ≤0.05 respecto al control. Las barras representan el error estándar de las medias (SEM). Modificado fromreference 8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de tsu figura.

Figura 4
Figura 4:. Prestina Expresión en P-IES-OC1 y NP-IES-OC1 células - células fueron marcadas con anti-prestina de anticuerpos y observado por microscopía confocal y citometría de flujo (A) En las células P-IES-OC1 prestina immunolocalized sobre todo en el citoplasma (flechas). (B) En las células NP-HEI-OC1, en ​​contraste, la reactividad prestin se concentró en la membrana plasmática (flechas). (C y D) La citometría de flujo estudios en células HEI-OC1 se cultivaron durante 2 semanas en condiciones NP (D) mostraron un claro aumento de la expresión respecto prestin a las células P-HEI-OC1 (C). (C) de la inserción es secundario ab solamente (control negativo). Modificado de la referencia 9.Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5: Estudios de NLC en células P-IES-OC1 y NP-IES-OC1 (A) células HEI-OC1 Patch-montado.. (B - D) NLC en P-IES-OC1 y NP-IES-OC1 células. Tenga en cuenta la disminución en el pico de NLC y el cambio progresivo de las curvas de valores de las celdas NP-HEI-OC1 más despolarizadas. Modificado de la referencia 9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este informe se describe cómo la cultura células HEI-OC1 y las utilizamos para evaluar los mecanismos de citotoxicidad inducida por fármacos y para investigar las propiedades funcionales de prestina, el motor molecular de las CCE coclear. Los procedimientos técnicos, sin embargo, son lo suficientemente generales como para ser adaptado fácilmente a diferentes estudios.

Todos los protocolos descritos aquí requieren el uso correcto de técnicas de cultivo celular bien establecidos 10. Al igual que con cualquier otra línea celular, se trabaja con células HEI-OC1 requiere una instalación de cultivo celular está debidamente equipado, con un gabinete con certificación de seguridad biológica, una centrífuga refrigerada, un baño de agua, y un microscopio invertido para el examen de cultivos celulares y de células de recuento Si el uso de técnicas hemocytometric. Un requisito único, sin embargo, es la disponibilidad de dos incubadoras humidificadas, un juego a 33 ° C / 10% de CO 2 para las células P-IES-OC1 y otra a 39 ° C / 5% de CO 2 para celular NP-IES-OC1s. Si los estudios previstos implican sólo las células P-HEI-OC1, la segunda incubadora se puede ajustar a 37 ° C / 5% de CO 2 para diferentes ensayos.

El uso de placas de cultivo celular de plástico es un requisito adicional importante para trabajar con células HEI-OC1. De hecho, las células HEI-OC1 son muy robustos y lo harán el crecimiento en diferentes superficies y en condiciones muy diferentes. Sin embargo, su fenotipo y su respuesta a los medicamentos y otros estímulos dependerán en gran medida de los parámetros de cultivo (G & F Kalinec Kalinec, sin publicar). Como argumentamos en un trabajo previo 8, esta plasticidad de las células HEI-OC1 se puede utilizar ventajosamente para diseñar nuevos experimentos. Por ejemplo, es bien sabido que la tensión de oxígeno en la perilinfa coclear es mucho más baja (~ 2 kPa) que en una incubadora típica a nivel del mar (~ 21,3 kPa) 27. La incubación de las células HEI-OC1 en O 2 concentraciones inferiores cambiarán sus respuestas, tal vez ellos haciendo un mejor modelo para la auditoríaORY células sensoriales.

Debe hacerse hincapié en que los protocolos descritos para la cultura y subcultivo de células HEI-OC1 también se pueden utilizar con otras líneas de células auditivas desarrollado en nuestro laboratorio a partir de la misma de ratón transgénico, como OC-k3 de órgano de Corti 11,12 y SV -k1 de estría vascular 13,14. Además, estas líneas celulares podrían ser útiles como células control para HEI-OC1 en experimentos seleccionados. Por ejemplo, hemos utilizado recientemente células SV-k1 para demostrar que la inmunorreactividad inversamente proporcional a la prestina y anticuerpos Na + K + ATPasa en la membrana plasmática de las células HEI-OC1 era celular respuesta de tipo dependiente del lugar de asociado con el ratón transgénico de que estas células se obtuvieron a 9.

Otro requisito crítico para el trabajo con células HEI-OC1 es la práctica de técnicas asépticas apropiadas, tales como la limpieza de todas las superficies de trabajo dentro de la cabina de seguridad con un 70% eTHANOL o isopropanol y la descontaminación de los materiales requeridos para los procedimientos. Sin embargo, mientras que otras líneas celulares de mamífero son frecuentemente protegidos contra la contaminación bacteriana inadvertida mediante el uso de penicilina-estreptomicina u otras combinaciones similares, antibióticos nunca deben ser utilizados con células HEI-OC1 excepto si el propósito del estudio es investigar sus efectos. células HEI-OC1 se generaron en condiciones libres de antibióticos, y deben evitarse para reducir la aparición de células resistentes a los antibióticos.

Por último, queremos volver a insistir en un punto ya se ha mencionado varias veces en este informe: el fenotipo y la respuesta de las células HEI-OC1 a las drogas y otros estímulos dependerán en gran medida de los parámetros de cultivo. Por lo tanto, es muy importante que los laboratorios que trabajan con células HEI-OC1 utilizan protocolos similares y condiciones de cultivo celular con el fin de hacer que sus resultados realmente comparable con los proporcionados por otros grupos. Además, esmuy importante recordar que la línea celular HEI-OC1 es sólo un modelo, con todas las limitaciones que tiene un modelo. Esperando que los experimentos in vitro con células HEI-OC1 proporcionará datos que representan con precisión las respuestas in vivo de las células sensoriales auditivas real es poco realista. Sin embargo, estamos convencidos de la línea celular HEI-OC1 es un modelo útil para la investigación de las respuestas funcionales de las células sensoriales auditivas y la proyección de la ototoxicidad potencial de los medicamentos farmacológicos.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEI-OC1 cells ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS 
Class II Biological Safety cabinet The Baker Company Sterilgard III AND COMPANIES INDICATED IN THE
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5810R PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY
Inverted microscope Zeiss Axiovert 25 EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR
Waterbath Stovall HWB115 PRODUCT COULD BE USED.
Cell counter Nexcelom Cellometer Auto T4
Two (2) Cell incubators, one at 33 °C/10% CO2 and other at 39 °C/5% CO2 Forma Scientific 3110
Cell culture dishes, PS, 100 mm x 20 mm with vents Greinier Bio-One 664-160
Cell culture dishes , PS,  60 mm x 15 mm with vents  Greiner Bio-One 628160
Cellstar tissue culture flasks  250 ml Greiner Bio-One 658-175
Cellstar tissue cultur  flasks 550 ml Greiner Bio-One 660-175
 6 well cell culture plate, with lid-Cellstar Greiner Bio-One 657-160
Microtest Tissue culture plate, 96 well, flat bottom with lid Becton Dickinson 353072
Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white, clear bottom Greiner Bio-One 655098
50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars Becton Dickinson  352070
15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars Greiner Bio-One 188-271
PBS pH 7.4 (1x)  Life Technologies 10010-023
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) Life Technologies 11965-084
Fetal bovine serum (FBS)  Hyclone SH10073.1
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Gibco/Invitrogen 21083-027
Trypsin, 0.25%  Life Technologies 25200-056
TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit Trevigen 4890-25-K
Caspase-Glo 3/7 Assay  kit Promega   G8091 
BrdU Cell Proliferation Assay Kit  Cell Signaling 6813
Non-enzymatic cell dissociation solution  Sigma-Aldrich C5789
Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit Promega   G8741 
FACSAriaIII instrument  BD Biosciences  FACSAriaIII With 488 nm excitation (blue laser)
Digital Blot Scanner LI-COR C-DiGit
Electrophoresis and Blotting Unit Hoefer SE300 miniVE
Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software Molecular Devices SpectraMax 5
Patch-clamp amplifier HEKA EPC-10
Puller for preparing patch electrodes Sutter Instruments P-97

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References

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Biología Celular Número 115 las células HEI-OC1 cultivo celular la citotoxicidad la muerte celular la viabilidad celular la senescencia celular la autofagia. FACS la función motora prestina patch-clamp capacitancia no lineal
El trabajo con células auditivas HEI-OC1
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Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., … More

Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. Working with Auditory HEI-OC1 Cells. J. Vis. Exp. (115), e54425, doi:10.3791/54425 (2016).

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