Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.
udvikling zebrafisk muskel højt konserveret med mammale systemer gør dem til en fremragende model til at studere muskelfunktionen og sygdom. Mange myopatier påvirker skeletmuskulatur funktion kan hurtigt og nemt vurderet i zebrafisk i løbet af de første par dage af embryogenese. Ved 24 timer efter befrugtningen (HPF), vildtype zebrafisk spontant kontrakt deres hale muskler og med 48 HPF, zebrafisk udstille kontrolleret svømning adfærd. Reduktion i hyppigheden af eller andre ændringer i, kan disse bevægelser indikere en skeletmuskel dysfunktion. At analysere svømmeadfærd og vurdere muskel præstationer i begyndelsen zebrafisk udvikling, vi udnytter både berøringsfølsomme-fremkaldte flugt respons og bevægelseskomponenter analyser.
Touch-fremkaldte flugt respons assays kan anvendes til at vurdere muskel ydeevne under korte burst bevægelser, der skyldes sammentrækning af hurtige ryk muskelfibre. Som svar på en ydre stimulus, som i dette tilfælde er et tryk påhovedet, vildtype zebrafisk ved 2 dage efter befrugtning (DPF) typisk udviser en kraftig byge svømmetur, ledsaget af skarpe sving. Vores metode kvantificerer skeletmuskel funktion ved at måle den maksimale acceleration ved en burst svømning bevægelse, accelerationen er direkte proportional med den kraft, der frembringes ved muskelkontraktion.
I modsætning hertil er bevægelseskomponenter assays under tidlig zebrafisk larveudviklingen anvendes til at vurdere muskel ydeevne under vedvarende perioder med muskelaktivitet. Brug af et sporingssystem til overvågning svømmeadfærd opnår vi en automatiseret beregning af frekvensen af aktivitet og afstand i 6 dage gamle zebrafisk, afspejler deres skeletmuskel funktion. Målinger af svømning ydeevne er værdifulde for fænotypisk vurdering af sygdomsmodeller og high-throughput screening af mutationer eller kemiske behandlinger påvirker skeletmuskulatur funktion.
Gennem det seneste årti zebrafisk er blevet mere og mere brugt til at studere muskel cellebiologi og sygdom. Den hurtige eksterne udvikling af zebrafisk embryo, kombineret med dets optiske klarhed, tillader direkte visualisering af muskel-dannelse, vækst og funktion. Processen med muskeludvikling er stærkt bevaret i zebrafisk, og dette har muliggjort vellykket modellering af en række muskelsygdomme herunder muskeldystrofier og medfødte myopatier 1-8. Detaljeret gennemgang af zebrafisk modeller har ikke kun givet nye indsigt i Patobiologi af disse betingelser, men også en platform for afprøvning af egnede behandlinger 6,9-13.
Analysen af zebrafisk modeller for muskelsygdomme bygger på pålidelige og reproducerbare assays til måling af muskel ydeevne. Tidligere undersøgelser har med succes målt kraften generere kapacitet af zebrafisk stammen musklen i fisk mellem 3 og 7 dpf afelektrisk stimulering kontraktion af et immobiliseret fisk fastgjort til en kraft transduktion systemet 14. Dette kan tilvejebringe detaljerede målinger af kraft, men er ikke velegnet til højere throughput eksperimenter og der er fordele ved at måle muskel ydeevne under svømning. Ved 2 dpf zebrafisk muskel er fuldt funktionel og fiskene kan fremkalde burst svømning bevægelser som reaktion på stimuli. Touch-fremkalde flugtrespons assay anvendes til at måle acceleration ved en burst svømning bevægelse, som kan anvendes som et mål for kontraktil kraft.
En af de mest anvendte foranstaltninger af muskelfunktion i myopati patienter er 6 min gangtest, der registrerer den samlede distance gik på en hård flad overflade 15,16. Vi har anvendt en tilsvarende test til måling af muskel funktion i 6 dpf zebrafisk larver, hvorved vi overvåger den samlede distance svømmet, og det samlede antal flytninger af hver larve over en 10 min periode. Dette udføresanvendelse af et automatiseret sporingssystem, som giver pålidelig og high-throughput målinger af muskelydelse. Begge muskel test er meget reproducerbar og er blevet anvendt til at kvantificere forskelle i musklen præstationer i zebrafisk myopati modeller 8.
Mange forskellige dyremodeller, herunder mus, hunde, zebrafisk, fluer og orme har bidraget til vores forståelse af den genetiske og molekylære grundlag for muskelsygdomme, og bidraget til udviklingen af terapeutiske metoder til at bekæmpe dem. Zebrafisken prale af flere fordele for studiet af muskelsygdom. Zebrafisken tilvejebringer et genetisk manipulerbar system til vurdering kompleks muskel mønsterdannelse i et egnet fysiologisk miljø, hvilket ikke er muligt i in vitro dyrkningssystemer. I modsætning til andre hvirveldyr dyremodeller, det store antal fisk produceret sammen med sin optiske klarhed, muliggør hurtig, høj kapacitet in vivo kemisk og genetisk screening.
Her beskriver vi udviklingen af zebrafisk bevægelse analyser til at give en høj kapacitet og automatiseret metode til at vurdere muskel ydeevne under zebrafisk embryogenese. For begge analyser må det erkendes, at døgnrytmen ogeksterne miljømæssige stimuli i væsentlig grad vil påvirke zebrafisk svømmeadfærd 17,18. Gentagen prøvning af samme zebrafisk vil også føre til tilvænning forårsager et fald i reaktion på den taktile stimulus 23. Derfor for at opnå reproducerbare resultater mellem eksperimenter hver zebrafisk embryo bør kun blive anvendt én gang, tidspunktet på dagen og lysforhold bør standardiseres, og vandtemperaturen skal reguleres stramt.
Ved hjælp af touch evoked analyse ved 2 dpf vi direkte kan måle den maksimale acceleration af en burst svømning handling, som er proportional med muskelkraft. Tidligere teknikker i zebrafisk har undersøgt muskelkraft ved at binde begge ender af embryoner til eksperimentelt udstyr hvorefter muskelsammentrækning stimuleres ved hjælp af et elektrisk felt og kraft-generere kapacitet af musklen 14 måles. Selv om denne metode måler den kraft produktionskapacitet af than larve muskel, betyder det ikke måling af den faktiske kraft, der genereres af larvestadiet musklen under svømning. Vi udviklede derfor en fremgangsmåde til indirekte at vurdere den kraft, der genereres ved normale larve svømning bevægelse for at give et samlet mål for muskel sundhed. Højhastighedstog videosystem, der kan optage individuelle zebrafisk bevægelser på en billedfrekvens på 1.000 billeder / sek kan anvendes til at identificere små men signifikante forskelle i muskelfunktion, som ikke direkte kan skelnes med det blotte øje. Det vil være interessant at se, hvordan tidligere rapporterede ændringer i elektrisk stimuleret kraft generation korrelerer med ændringer i svømning ydeevne.
Desuden touch fremkaldt reaktion assays kan også anvendes til at vurdere svømning kinematik, såsom formen og hastigheden af legemet bølge under svømning bevægelse 24, hvilket gav en kvantitativ måling af den bevægelsesadfærd.
På grund af den spontane bevægelse af zebrafish larver efter 3 dpf, var vi ikke i stand til at udføre touch-fremkalde analyser til at måle muskelfunktion. Omvendt målte vi muskel resultater over en længere periode ved at bestemme afstanden svømmet med zebrafisk larver ved 6 dpf. Denne test, selv om et indirekte mål for muskelfunktion, kan anvendes til at identificere fisk udviser nedsat muskelpræstation 8 eller neurodegeneration 25,26. Denne test giver ikke kun en måling analog med 6 min gangtesten men er også velegnet til automatiseret høj-throughput in vivo drug eller mutagenese-skærme.
The authors have nothing to disclose.
We thank Viewpoint for their kind sponsorship of this manuscript. This work was funded by an Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant (APP1010110).
21G X 1' Blunt Needle | Terumo/Admiral Medical Supplies | TE2125 | |
48-well plates | Sigma | M8937 | |
90mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S90001 | |
High Speed Camera | Baumer | HXC20 | |
http://www.randomization.com | N/A | Steps 1.1.2, 2.1.3 | |
Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
Plastic Pipette | VWR | 16001-188 | |
StreamPix5 | NorPix | Step 1.2.3 | |
Temperature Control Unit | Viewpoint | ||
Tweezers, style 8 | ProSciTech | T04-821 | |
Zebrabox System | Viewpoint | ||
Zebralab | Viewpoint | Steps 1.3.1, 2.2.1 |