Abstract
Zebra balığı kas gelişimi son derece onlara kas fonksiyonu ve hastalık incelemek için mükemmel bir model yapma memeli sistemlerle muhafaza edilir. iskelet kas fonksiyonunu etkileyen birçok miyopatiler hızlı ve kolay bir embriyogenez ilk birkaç gün içinde zebrafish değerlendirilebilir. 24 saat sonrası fertilizasyon (hpf) tarafından, wild tip zebrabalıkları kendiliğinden kuyruk kasları sözleşme ve 48 hpf, Zebra balığı sergi kontrollü yüzme davranışlarıyla. sıklığında azalma, ya da diğer değişiklikler, bu hareketler bir iskelet kas disfonksiyonu gösterebilir. yüzme davranışlarını analiz ve erken Zebra balığı gelişiminde kas performansını değerlendirmek için, biz de dokunmatik uyarılmış kaçış tepkisi ve hareket analizleri kullanmaktadır.
Dokunmatik uyarılmış kaçış tepki deneyleri hızlı kasılan kas liflerinin kasılmasıyla ortaya çıkan kısa patlama hareketleri sırasında kas performansını değerlendirmek için kullanılabilir. Bu durumda, bir dokunun bir dış etmenin etkisi, yanıt olarak,Baş, sonrası fertilizasyon (dpf) 2 gün wild tip Zebra balığı genellikle keskin dönüşler eşliğinde güçlü bir patlama yüzmek, sergilerler. Bizim yöntemi ivme kas kasılması tarafından üretilen kuvvet ile doğru orantılı olarak, bir patlama yüzme hareketi sırasında maksimum ivmeyi ölçerek iskelet kası fonksiyonunu rakamlarla.
Buna karşılık, erken zebra balığı larva gelişimi sırasında hareket yeteneği deneyler, kas aktivitesinin devam dönemlerde kas performansının değerlendirilmesi için kullanılır. yüzme davranışlarını izlemek için bir izleme sistemi kullanarak, biz onların iskelet kas fonksiyonlarının yansıtıcı 6 gün eski Zebra balığı faaliyet ve mesafe sıklığı otomatik hesaplama, edinin. yüzme performansı ölçümleri hastalık modelleri ve iskelet kas fonksiyonunu etkileyen mutasyonlar veya kimyasal tedavilerin yüksek verimli tarama fenotipik değerlendirme için değerlidir.
Introduction
Geçtiğimiz on yıl zebrabalıkları üzerinde giderek kas hücre biyolojisi ve hastalık incelemek için kullanılır olmuştur. optik netlik ile birleştiğinde zebrafish embriyo, hızlı dış gelişme, kas oluşumu, büyüme ve fonksiyon doğrudan görselleştirme izin verir. Kas geliştirme süreci son derece zebrabalıkları muhafaza edilir ve bu müsküler distrofi ve konjenital miyopatiler 1-8 da dahil olmak üzere kas hastalıklarının bir dizi başarılı modelleme izin verdi. Zebra balığı modellerin detaylı olarak incelenmesi ancak bu koşulların patobiyolojisi yeni bakış açıları sağlanan değil, aynı zamanda uygun tedavilerin 6,9-13 test için bir platform sağlamadı.
kas hastalıklarının zebrabalıkları modellerinin analizi kas performansını ölçmek için güvenilir ve tekrarlanabilir deneyleri dayanır. Önceki çalışmalar başarıyla tarafından DPF 3 ila 7 arasında balık Zebra balığı gövde kas kuvveti üreten yeteneği ölçülür varelektriksel bir güç iletim sistemi 14 bağlı bir hareketsizleştirilmiş balık kasılmasını stimüle eder. Bu kuvvet detaylı ölçümler sağlayabilir ancak ideal yüksek verim deneyleri için uygun değildir ve yüzme sırasında kas performansını ölçmek için avantajları vardır. Zebra balığı kas dpf 2'de tamamen işlevseldir ve balık uyaranlara yanıt olarak patlama yüzme hareketleri ortaya çıkarabilir. dokunmatik uyandırmak çıkış yanıt deney kasılma gücünün bir ölçüsü olarak kullanılabilir bir darbe yüzme hareketi sırasında ivme ölçümü için kullanılır.
Miyopati hastalarda kas fonksiyonlarının en çok kullanılan önlemlerden biri toplam mesafe sert ve düz bir yüzeye 15,16 yürüdü kaydeden 6 dk yürüme testidir. Biz toplam mesafe yapılırsa yapılsın izlemek ve böylece, zebra balığı larvası dpf 6 kas fonksiyonu ölçmek için kıyaslanabilir bir test uygulanmış ve 10 dakikalık bir süre boyunca, her bir larvaya yapılan hareketlerin sayısı var. Bu gerçekleştirilirkas performansı, güvenilir ve yüksek verimli ölçümleri sağlayan otomatik bir izleme sistemi kullanılarak. Her iki kas testleri yüksek oranda tekrarlanabilir ve Zebra balığı miyopati modellerde 8 kas performansında farklılıklar ölçmek için kullanılmıştır.
Protocol
1. Dokunmatik uyarılmış Tepki Testi
- Dokunmatik uyarılmış Tepki Testi için Embriyolar dpf'e 2 hazırlanması
- Etkinlik gün 17,18 boyunca önemli ölçüde değişebilir çünkü testi yapılır hangi günün hangi saati deneyler arasında tutarlı olduğundan emin olun.
NOT: Deney kör gerçekleştirilen ve test sırası deneysel eserler en aza indirmek için randomize edilmelidir. - balık atama deneyi yürüten kişiye bilinmeyen bir numara suşları. serbestçe kullanılabilir online araçlar test sırasını belirleyen rastgele listesini oluşturmak kullanarak, bu aşağıdaki.
- en az bir saat önce test, koryon bir delik kopyalama ve yavaşça ince cımbız çifti kullanılarak ayrı koryon çekerek dechorionate embriyolar. 28 ° C inkübatör dönmeden önce petri pislikleri temizleyin.
- Etkinlik gün 17,18 boyunca önemli ölçüde değişebilir çünkü testi yapılır hangi günün hangi saati deneyler arasında tutarlı olduğundan emin olun.
- Dokunmatik uyarılmış Tepki Testi Sahne
- Isı stage 28 ° C'de en az 15 dakika için test başlamadan önce.
Bu aşama sıcaklığı kontrol edilir ve 28 ° C'de kalır: NOT Test süresince ° C. Sıcaklık aktivitesini etkileyecek ve sabit bir sıcaklıkta muhafaza etmek önemlidir. ısıtılmış aşamada mevcut değilse, o zaman, su sıcaklığının izlenmesi ve tüm deneyler aynı sıcaklıkta yürütülmelidir. - Embriyo orta (5 mM NaCl, 0.17mM KCI, 0.33 mM CaCl2, su içinde 0.33 mM MgSO 4) aydınlatılmış sahneye dolu bir petri yerleştirin ve petri üzerinde yüksek hızda kamera monte.
- balık o kadar hızlı yüzme eylemi kaydedilir emin olmak için yakalama hızı olarak sn (1000 fps) 1.000 çerçevesini seçin (örneğin burada açıklanan izle Pix 5 gibi) ve "çalışma alanı" sekmesi altında video kamera kayıt yazılımı başlatın.
- Bir seferde bir embriyo ile çalışan, Midd embriyo yerleştiringörüş alanında açıkça görülebilir zebrabalıkları sahip petri Le.
NOT: Embriyo deney başlamadan recapturing ve embriyo konumlandırma bazı hastalık modellerinde kas zayıflığı teşvik edebilir uyaran ve tekrarlanan patlama yanıtları hissizleştirilmek neden olabileceğinden, başka bir ile değiştirin uzak öncesinde yüzer edin. - "Rekor" butonuna tıklayarak kaydetmeye başlayın ve başın üstünde bir künt iğne ile hafifçe dokunarak embriyo mechanosensory uyaran sunmak.
- Embriyo görüş alanının dışında swum veya dinlenme döndüğünde Kaydı durdur.
NOT: Mekanik uyaran aşağıdaki patlama kaçış tepkisi ilk 0,2 saniye içinde ivme zirveleri. Bu nedenle, balık görüş alanında bir kayıt çıkış tepkisinin ilk 0.2 saniye boyunca en az olduğundan emin olun. Adım 1.2.3 açıklanan yazılımı kullanarak, veriler otomatik olarak kaydedilirBir avi video dosyası olarak. Böyle indirmek için serbestçe kullanılabilir her ikisi de Bedava Video Capture veya Softonic, gibi alternatif video yakalama yazılımı da kullanılabilir. - Yeni bir petri embriyo dönün ve test için başka bir embriyo seçin. 15 balık az üzerinde test gerçekleştirin.
- Isı stage 28 ° C'de en az 15 dakika için test başlamadan önce.
- Yüzme Davranış sayısallaştırılması
- Yüzme davranışı ölçmek için, yazılımı başlatmak ve Avi kaydedilen video dosyasını açmak için "arka plan çıkarma olmadan Tek Larva Locomotion" modülünü seçin.
- "Freehand" ya da filmin menü çubuğu seçme alanlardan "çokgen" aracını kullanarak analiz için kullanılacak. Bölge balık orijinal pozisyonunu ve balık yüzmek olacağı bölgeyi hem de kapsar emin olun. prob analiz edilecek alanın dışında olduğundan emin olun. Yazılım otomatik olarak istenilen alanda balık yörüngesini takip edecektir.
- t gerçekleştirmek içinO analiz, menü çubuğundan "deney" linkine tıklayın ve "yürütme" seçeneğini seçin. Istenen konumda ham veri analizi dosyası (.phr biçimi) kaydetmek isteyip istemediğiniz sorulduğunda. kaydettikten sonra, analiz başlamak için "start" tıklayın. "Deney" altında "stop" tıklayarak analizi End açılır menüsünden. sonuçlarını içeren bir pencere ekrana gelecektir.
- "Maksimum ivme" değerini elde etmek için sağa kaydırın. İstenirse, sonuçlar pencereyi kapatmak ve "sonuçları" başlığı altında "ihracat anlık sonuç" butonuna tıklayarak bu verileri dışa açılır menüsünden. Uygun ham veri analizi dosyasını seçin ve açık tıklayın. bir elektronik tablo programında açılabilir bir metin dosyası hedef klasörde kaydedilir.
- Her balık ve her bir suş için ortalama maksimum ivme elde etmek için ortalama bu işlemi tekrarlayın (Şekil 1).
Not: Alternatif olarak usin içing Burada açıklanan yazılım, böyle serbestçe kullanılabilir ImageJ yazılım gibi benzer paketler ilgili hareket veri ayıklamak için kullanılabilir. 3D Parçacık Tracker eklentisi yüzme yörüngeleri izlemek için kullanılabilir.
2. Hareket Testi - 10 dk Swim Testi
- Yüzme Analizi Embriyolar dpf'e 6 Hazırlanması
- Gerekirse, sıralama embriyolar gerekli genotipi için, ayrı bir Petri kabı (tabak başına 25-30 embriyo) bir floresan protein veya fenotip ile ifade incelenmesi ve yerine göre örneğin. Seçenek olarak ise, genotip hareket tahlilin tamamlanmasından sonra belirlenebilir.
- 3 dpf'e, petri kapları yeniden incelemek ve herhangi bir çıkmamış embriyolar ve enkaz kaldırmak. 6 dpf'e kadar 28 ° C inkübatör Petri yemekleri dönün.
- Zebra balığı larvaları en aktif olduğu zamandır 9 am ve 12 saatleri arasında tüm suşların testini gerçekleştirin. p test ve pozisyonu sırası rastgelevahşi tip ve mutant örneklerin geç sirkadiyen farklılıklar ve diğer deneysel önyargı etkilerini en aza indirmek için.
NOT: etkinlik gün boyunca önemli ölçüde değişebilir, çünkü test süresi deneyler arasında tutarlı olması önemlidir. - En az 30 dakika, oyuk başına bir larva ile 48 oyuklu plaka test yer larvalarına karşı önceden. Su yüzeyi sadece kuyunun üst altında olacak şekilde transferinden sonra hiçbir kabarcıkları vardır sağlanması, kuyu doldurun. 28 ° C inkübatör plakaları dönün.
- kuluçka plakaları almak ve testten önce beş dakika ışığında iklime alıştırmak.
- Hareket tahlilin gerçekleştirilmesi
- Bu larvalar karanlıkta tespit edilebilir, böylece 60 kare / saniyeye kadar yakalayan, kızılötesi dijital kamera ile donatılmış kayıt odasına, içine 48 plaka yerleştirin. Kuyuların tüm lokomosyon yazılımına dairesel ızgara içine yerleştirilir emin olun ve tüm larvalar cle olduğunuarly saptanabilir.
- yazılımı başlatmak ve "izleme" modülünü seçin. "Dosyası" altında "oluşturmak yeni protokol" üzerine tıklayın ve deney için kullanılan kuyuların numarayı düzenleyin. Deneme süresini ve "parametreleri" butonuna tıklayarak 10 dakika için entegrasyon süresini hem de set menü açılır ve "protokol parametrelerini" ve daha sonra "zaman" sekmesini seçerek. Aynı "protokol parametreleri" diyalog kutusunda "seçenekler" sekmesine tıklayın ve "Numeriscope" checkbox "protokol parametreleri" diyalog kutusu kapatılabilir, aşağıdaki tıklandığında emin olun.
- kayıt alanları kuyulardan birinde tüm ızgara ve çift tıklayın vurgulamak ayarlayın. "Çizmek alanlar" butonuna tıklayın ve sol üst, sağ üst ve sol alt kuyuların etrafında çizmek ve yazılım otomatik olarak her bir konumunu belirlemek için izin verir "build", tıklayın. Ayrıca bir ölçekte çizmekbar ve "grubu için geçerli" üzerine tıklayın. Tamamlandığında, "alanlarını çizmek" butonuna tıklayın.
- Görme sadece balık hareketleri arka plan sinyalleri ile ortaya koyan bir seviyeye "algılama eşiği" çubuğunu kaydırarak algılama eşiğini belirler.
NOT: algılama eşiği suşları ve böylece eşikleri, yeni bir suş test zaman belirlenmelidir arasında değişecektir. Örnek veriler 25 mm bir algılama eşiği sunulmaktadır / sn cinsinden kullanılmıştır. - test başlamadan önce hareketsizlik tespiti ve küçük ve büyük hareketler için hareket eşik girin.
NOT: temsilci veriler 6 mm / sn bir hareketsizlik eşiğini ve 30 mm'lik bir etkinlik patlama eşiğine sundu In / sn kullanılmıştır. eşikleri minimum hareket aktif dikkate alınması gereken belirlemek ve gerekli seviye patlama aktivitesini kabul ve (küçük aktif içine ancak patlama eylemlerinde altında faaliyet sınıflandırma izin edilecekty eşikleri) ve patlama aktivitesi eşiğinden daha büyük (büyük) hareketleri. eşikler incelendi özel balık türlerinin aktivitesine bağlı olarak değiştirilebilir.
Not: Deney, ya açık ya da koyu koşullarda gerçekleştirilebilir, ancak zebra balığı larvası koyu 18 daha aktif olduğu gösterilmiştir. - "Parametreleri" altında "ışık sürüş ayarları" butonuna tıklayarak% 0 olması odasının içine ışık yoğunluğunu ayarlayın açılır menüsünden. Ortaya çıkan diyalog kutusunda, gerekli ışık ayarları ekleyin.
NOT: odasının içine ışık yoğunluğu larva aktiviteyi teşvik etmek test süresinde ve kapatmak için tetiklenebilir - kayıt odasının kapısını kapatın ve video kaydını başlatmak.
- Yüzme Davranış sayısallaştırılması
- Deney tamamlandıktan sonra, "deney" altında "stop" linkine tıklayarak menüyü aşağı bırakın. Bir diyalog botüm sonuçlar x gösterilecektir.
- "Içeren açmak klasördeki" konulu excel tıklamayla bu sonuçları erişebilir ve ortaya çıkan klasöründe görünür excel dosyasını açın. önemli parametreler "smlct" (küçük hareket sayımı), "larct" (büyük hareket sayımı), "smldist" (küçük hareketlerle balık tarafından katedilen toplam mesafe) ve "lardist" büyük hareketler balık kapsadığı (toplam mesafe vardır ).
NOT: Kayıt sonrasında, yazılım da 10- sırasında hareketin bir görsel temsilini içeren ve bir .png resim dosyası ((10 dk kayıt video içeren) bir .avi dosyası biçiminde iki ek çıkış dosyaları döndürür dak deneyi; bakınız Şekil 2). - Lokomosyon değerleri hesaplanır kez doğru hesaplanmış lokomosyon değerleri balık yüzme hareketlerini tasvir edip, (bakınız Şekil yorumlayan .avi ve .png dosyalarını yeniden3).
Not: Burada tarif edilen yazılım kullanılarak bir alternatif olarak, örneğin serbestçe kullanılabilir ImageJ yazılımı gibi paketler lokomotor davranışını izlemek için de kullanılabilir.
Representative Results
Dokunun yanıt deney Kas gücünün orantılı ölçüsüdür hızı ve yüzme hareketlerinin ivmesini belirlemek için kullanılabilir uyarılmış. Mekanik bir uyarana tepki olarak böyle vahşi tip Zebra balığı sergi hızlı bir yüzme eylem dpf'e kafasına 2 küçük musluk gibi. Video yakalanır ve iki farklı zebra balığı miyopati modellerde analiz edilmiştir: Tg (ACTA1 D286G -eGFP), önemli bir kas güçsüzlüğü gösterilmiştir nemaline miyopati modeli ve şiddetli kas kusurları tarif edildiği Duchenne kas distrofisi modeli 19,20 dpf'e 5 de. Tipik bir dokunuş bir videodan Görüntüler Şekil 1A temsil edilmektedir tahlil uyarılmış. Zebra balığı hızlandırılması incelenmiş ve patlama yüzme kaçış tepkisi (Şekil 1B) ilk 0,2 saniye içinde zirveye bulunmuştur. Bu zirve maksimum ivme kuvveti g orantılı bir önlem sağlariskelet kası kapasitesini enerating. Tg (ACTA1 D286G -eGFP): ortalama 276,0 ± 28,8 m / s 2, n = 3 bağımsız tekrarlı deneyin içeren = maksimum ivme değerleri her bir suş için bir ortalama maksimum ivme değeri (ortalama ± standart hata) elde etmek üzere ortalaması alınmıştır 15 ayrı balık; Vahşi tipli kontrolü: Ortalama = 500,8 ± 50,28 m / sn 2, n = 15 ayrı balık içeren 3 bağımsız çoğaltmak deneyleri; dmd pc2 - / - mutant: Ortalama = 249,9 ± 19,1 m / sn 2, n = 12-19 bireysel balık içeren 3 bağımsız çoğaltmak deneyleri; dmd pc2 +/- heterozigot: Ortalama = 235,9 ± 8.7 m / sn 2, n = 16-27 bireysel balık içeren 3 bağımsız çoğaltmak deneyleri; dmd pc2 + / + wild tip homozigot: Ortalama = 230,9 ± 8.7 m / sn 2, n = 8-27 bireysel balık (Şekil 1C) içeren 3 bağımsız çoğaltmak deneyleri. Beklendiği gibi, Tg (ACTA1 D286G -eGFP) Balık fare modelleri ve hasta verileri 8,21,22 ile tutarlıdır azalmış kas fonksiyonunu gösteren maksimum ivmelenme önemli bir azalma olduğu görüldü. Dmd pc2 - / - mutant balık, ancak 20 (Şekil 1D) dpf'e 3 ila kas kusurları tespit tutarlı, 2 dpf'e, maksimum ivme hiçbir fark olmadığını göstermiştir.
Hareket deneyleri kas performansında bir gösterge olarak zebra balığı suşlarının aktivitesi ve uzaklık swum belirlemek için 6 dpf yapıldı. Test sonrasında on dakikalık test süresi boyunca yüzme hareketleri şematik bir gösterimi sırasıyla yavaş ve hızlı hareket dönemleri temsil eden kırmızı ve yeşil çizgiler ve hareketsizlik dönemleri (Şekil 2) temsil eden siyah çizgilerle, üretilmiştir. oppos olarak hareketsizlik nispeten hiçbir dönemleri ile Bireysel yabanıl tip zebrabalıkları gösteri yüksek etkinlikEd test süresi (Şekil 2B) içinde daha az aktif olan Tg (ACTA1 D286G -eGFP) Balık e.
Yüzme davranışı her balık (Şekil 3) ile hareketi sayısı ve uzaklık swum münferit değerlerin ortalaması alınarak belirlendi. Her ikisi de, Tg (ACTA1 D286G -eGFP) balık (Şekil 3A ve 3B) ve DMD, PC2 - / - Mutant balık (Şekil 3C ve 3D), ilgili göre swum hareketleri ve mesafe ortalama sayısında belirgin bir azalma olduğu bulunmuştur kontroller: Tg (ACTA1 D286G -eGFP) balık: hareketlerin ortalama sayısı = 94.3 ± 13.6, ortalama mesafe yapılırsa yapılsın = 112.9 ± 18.4 mm, n = 45 balık içeren 3 bağımsız çoğaltmak deneyleri; vahşi tip kontrolleri: hareketlerin sayısını = 177.4 ± 14.0 ile ortalama mesafe yapılırsa yapılsın = 300.2 ± 22.8 mm, n = 3 bağımsız r45 balık içeren eplicate deneyler; dmd pc2 - / - mutant: mesafe swum ortalama hareketlerinin sayısını = 163.3 ± 30.0 ortalama: 298.4 ± 60,37 mm, n = 12-20 balık içeren 3 bağımsız çoğaltmak deneyleri; dmd pc2 +/- heterozigot: hareketlerin sayısı ortalama = ± 38,8 362,3, mesafe swum ortalama: 660,3 ± 86.1mm n = 17-27 balık içeren 3 bağımsız çoğaltmak deneyleri; dmd pc2 + / + vahşi tip homozigot: hareketlerin sayısını = 341.9 ± 91.6 ortalama = 574,3 ± 170.9mm n = 8-25 balık içeren 3 bağımsız çoğaltmak deneyleri mesafe swum anlamına gelir.
Şekil 1:. Kantitasyonu Zebra balığı embriyolarının dpf'e için 2 yanıt deneyi dokunmatik-uyandırmak kontrol zebrabalıkları (A) Anlık görüntüleri sırasında 2 dpf'e deneyleri dokunmatik-uyandırmak. (B) ilk 0.2 saniye Hızlanma eğrisiTek Tg (ACTA1 D286G -eGFP) (kırmızı) ve dokunmatik uyarıcının uygulanması, aşağıdaki tek bir kontrol (mavi) zebra balığı. maksimum ivme noktalı çizgilerle temsil edilmektedir. (C, D) (C) Tg (ACTA1 D286G -eGFP) zebrabalıkları dokunmatik uyarılmış müdahale deneyleri kaydedilen maksimum ivmelenme (m / sn2) miktarının ve (D) dmd pc2 - / - mutant balık 2 dpf'e zebrafish kontrol grubuna göre. Hata çubukları, 3 suret deneyler için ortalama ± SEM temsil * p <0.05. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Zebra balığı embriyolarının için lokomosyon tahlillerin Temsil (A) balığı embriyolar 48 oyuklu plakalara yerleştirilir ve hareket kızılötesi sayısal kamera kullanılarak yukarıda kaydedilir. Kırmızı çizgiler yavaş hareketler ve (yazılım girilen algılama eşikleri ile belirlendiği gibi) hareketsizlik gösteren siyah çizgiler gösteren hızlı hareketler, yeşil çizgiler tasvir ile test döneminde Zebra balığı hareket (B) şematik. Tıklayınız daha büyük bir versiyonunu görmek için bu figür.
Şekil 3:. Zebra balığı larvalarının dpf'e için 6 lokomosyon tahlillerin Kantitasyonu hareketlerinin (A) sayısının Kantitasyonu ve (B) Tg 6 dpf'e zebrafish kontrol grubuna göre (ACTA1 D286G -eGFP) zebrafish mesafe T./ - - 6 dpf'e zebrafish kontrol grubuna göre mutant balık hareketleri (C) sayısı ve (D) miktarının belirlenmesi dmd PC2 izlediği mesafe. Hata çubukları, 3 suret deneyler için ortalama ± SEM temsil * p <0.05, ** p <0.01. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
fareler, köpekler, Zebra balığı, sinek ve solucanlar gibi birçok farklı hayvan modelleri kas hastalıklarının genetik ve moleküler temeli anlayışımız yolunda katkıda ve bunlarla mücadele etmek terapötik yaklaşımların geliştirilmesinde yardımcı olması. Zebra balığı kas hastalığı çalışmaları için çeşitli avantajlar sunuyor. Zebra balığı, in vitro kültür sistemlerinde mümkün değildir, uygun bir fizyolojik bir ortamda, karmaşık kas modelli değerlendirmek için genetik olarak manipüle edilebilir bir sistem sağlar. Diğer omurgalı hayvan modellerinde farklı olarak, hep birlikte optik berraklık üretilen balık sayıda, in vivo kimyasal ve genetik tarama hızlı, yüksek hacimli kolaylaştırır.
Burada zebrabalıkları embriyogenez sırasında kas performansını değerlendirmek için yüksek verimlilik ve otomatik bir yöntem sağlamak için Zebra balığı hareket deneyleri gelişimini açıklar. Her iki tahliller için de kabul edilmesi gerektiğini sirkadiyen ritimler vedış çevresel uyaranlara anlamlı zebrabalıkları yüzme davranışı 17,18 etkileyecektir. Aynı zebrabalıkları Tekrarlanan test de 23 uyaran dokunsal yanıt olarak bir azalmaya neden alışkanlık yol açacaktır. Bu nedenle, deneyler arasında tekrarlanabilir sonuçlar her zebrabalıkları embriyo elde etmek için sadece bir gün ve aydınlatma koşulları zaman standardize edilmelidir kez test edilmiş ve su sıcaklığı sıkı regüle edilmesi gerekmektedir edilmelidir.
doğrudan kas kuvveti ile orantılı bir patlama yüzme eylemi, maksimum ivme ölçebilir dpf'e dokunma kullanarak 2'de analiz uyarılmış. Zebra balığı Önceki teknikler ölçülür bir elektrik alanı ve kas 14 kuvvet üreten yeteneğini kullanarak uyarılan kas kasılması deneysel ekipman aşağıdakilere embriyoların her iki ucunu bağlayarak kas kuvveti inceledik. Bu yöntem, t üretim kapasitesi kuvvetini ölçer ikenO larva kas, bu yüzme sırasında larva kas tarafından üretilen gerçek gücü ölçmez. Bu nedenle dolaylı olarak kas sağlığının genel bir ölçü sağlamak için, normal larva yüzme hareketi sırasında oluşan kuvveti değerlendirmek için bir yöntem geliştirdi. 1000 kare hızında bireysel zebrabalıkları hareketleri kayıt yeteneğine yüksek hızlı video sistemi, / sn gözle doğrudan ayırt edilemez kas fonksiyonlarının küçük ama anlamlı farklılıklar tespit etmek için kullanılabilir. Bu elektriksel olarak uyarılmış kuvvet nesil değişiklikleri yüzme performansında değişiklikler ile ilişkili bildirilen ne kadar önceden görmek için ilgi olacaktır.
Ek olarak dokunmatik yanıt deneyler ayrıca lokomotor davranışlar nicel bir ölçümünü elde etmek için, yüzme hareketi 24 boyunca vücut dalga şekli ve hız gibi yüzme kinematik değerlendirmek için kullanılabilir uyarılmış.
Nedeniyle zebraf spontan hareketineish larvalar 3 dpf'e sonra, biz kas fonksiyonunu ölçmek için dokunmatik uyandırmak deneyleri gerçekleştirmek mümkün değildi. Tersine, biz 6 dpf'e Zebra balığı larvalarının mesafe swum belirleyerek daha uzun bir süre boyunca kas performansını ölçtük. Bu test, kas fonksiyonunun dolaylı ölçüm de, balık bozulmuş kas performansının 8 veya nörodejenerasyonu 25,26 görüntülendiği belirlemek için kullanılabilir. Bu test 6 dakika yürüme testine benzer bir ölçüm sağlar ama aynı zamanda in vivo ilaç ya da mutagenez ekranlarında otomatik yüksek verimlilik için uygun değil sadece.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G x 1' Blunt Needle | Terumo/Admiral Medical Supplies | TE2125 | |
| 48-well plates | Sigma | M8937 | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S90001 | |
| High Speed Camera | Baumer | HXC20 | |
| http://www.randomization.com | N/A | Steps 1.1.2, 2.1.3 | |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic Pipette | VWR | 16001-188 | |
| StreamPix5 | NorPix | Step 1.2.3 | |
| Temperature Control Unit | Viewpoint | ||
| Tweezers, style 8 | ProSciTech | T04-821 | |
| Zebrabox System | Viewpoint | ||
| Zebralab | Viewpoint | Steps 1.3.1, 2.2.1 |
References
- Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130 (23), 5851-5860 (2003).
- Gupta, V. A., Kawahara, G., et al. A splice site mutation in laminin-α2 results in a severe muscular dystrophy and growth abnormalities in zebrafish. PLoS ONE. 7 (8), e43794 (2012).
- Gupta, V., Kawahara, G., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum Mol Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).
- Kawahara, G., Karpf, J. A., Myers, J. A., Alexander, M. S., Guyon, J. R., Kunkel, L. M. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci. 108 (13), 5331-5336 (2011).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model & Mech. 5 (3), 389-396 (2012).
- Ruparelia, A. A., Oorschot, V., Vaz, R., Ramm, G., Bryson-Richardson, R. J. Zebrafish models of BAG3 myofibrillar myopathy suggest a toxic gain of function leading to BAG3 insufficiency. Acta Neuropathol. 128 (6), 821-833 (2014).
- Sztal, T. E., Sonntag, C., Hall, T. E., Currie, P. D. Epistatic dissection of laminin-receptor interactions in dystrophic zebrafish muscle. Hum Mol Genet. 21 (21), 4718-4731 (2012).
- Sztal, T. E., Zhao, M., et al. Zebrafish models for nemaline myopathy reveal a spectrum of nemaline bodies contributing to reduced muscle function. Acta Neuropathol. 130 (3), 389-406 (2015).
- Pichler, F. B., Laurenson, S., Williams, L. C., Dodd, A., Copp, B. R., Love, D. R. Chemical discovery and global gene expression analysis in zebrafish. Nat Biotechnol. 21 (8), 879-883 (2003).
- Peterson, R. T., Shaw, S. Y., et al. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nat Biotechnol. 22 (5), 595-599 (2004).
- Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown. Biochem Bioph Res Co. 413 (2), 358-363 (2011).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat Rev Drug Discov. , (2005).
- Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays. J Vis Exp. (82), e50925 (2013).
- Sloboda, D. D., Claflin, D. R., Dowling, J. J., Brooks, S. V. Force measurement during contraction to assess muscle function in zebrafish larvae. J Vis Exp. (77), (2013).
- McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. The 6-minute walk test as a new outcome measure in Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve. 41 (4), 500-510 (2010).
- McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. The 6-minute walk test and other clinical endpoints in duchenne muscular dystrophy: reliability, concurrent validity, and minimal clinically important differences from a multicenter study. Muscle Nerve. 48 (3), 357-368 (2013).
- Hurd, M. W., Debruyne, J., Straume, M., Cahill, G. M. Circadian rhythms of locomotor activity in zebrafish. Physiol Behav. 65 (3), 465-472 (1998).
- MacPhail, R. C., Brooks, J., Hunter, D. L., Padnos, B., Irons, T. D., Padilla, S. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).
- Berger, J., Berger, S., Jacoby, A. S., Wilton, S. D., Currie, P. D. Evaluation of exon-skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing dystrophin-deficient zebrafish. J Cell Mol Med. 15 (12), 2643-2651 (2011).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochem Bioph Res Co. 423 (4), 785-788 (2012).
- Ravenscroft, G., Jackaman, C., et al. Mouse models of dominant ACTA1 disease recapitulate human disease and provide insight into therapies. Brain. 134 (4), 1101-1115 (2011).
- Ravenscroft, G., Wilmshurst, J. M., et al. A novel ACTA1 mutation resulting in a severe congenital myopathy with nemaline bodies, intranuclear rods and type I fibre predominance. Neuromuscular Disord. 21 (1), 31-36 (2011).
- Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci. 108 (37), 15468-15473 (2011).
- Müller, U. K., van Leeuwen, J. L. Swimming of larval zebrafish: ontogeny of body waves and implications for locomotory development. J Exp Biol. 207 (Pt 5), 853-868 (2004).
- Cheng, W., Tian, J., Burgunder, J. M., Hunziker, W., Eng, H. L. Myotonia congenita-associated mutations in chloride channel-1 affect zebrafish body wave swimming kinematics. PLoS ONE. 9 (8), e103445 (2014).
- Moggio, M., Colombo, I., et al. Mitochondrial disease heterogeneity: a prognostic challenge. Acta Myol. 33 (2), 86-93 (2014).
