Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.
Zebrafish मांसपेशियों के विकास अत्यधिक स्तनधारी उन्हें पेशी समारोह और बीमारी अध्ययन करने के लिए एक शानदार मॉडल बनाने प्रणालियों के साथ संरक्षित है। कई कंकाल की मांसपेशी समारोह को प्रभावित myopathies जल्दी और आसानी से embryogenesis के पहले कुछ दिनों में zebrafish में मूल्यांकन किया जा सकता है। द्वारा 24 घंटे बाद निषेचन (HPF), wildtype zebrafish अनायास उनके पूंछ मांसपेशियों अनुबंध और 48 HPF, zebrafish प्रदर्शनी नियंत्रित तैराकी व्यवहार के द्वारा। की आवृत्ति में कमी, या अन्य में परिवर्तन, इन आंदोलनों एक कंकाल की मांसपेशी में शिथिलता का संकेत हो सकता। तैराकी व्यवहार का विश्लेषण और जल्दी zebrafish विकास में पेशी प्रदर्शन का आकलन करने के लिए, हम दोनों स्पर्श पैदा भागने प्रतिक्रिया और हरकत assays का उपयोग।
टच पैदा भागने प्रतिक्रिया assays तेजी से चिकोटी मांसपेशी फाइबर के संकुचन से उत्पन्न छोटी फट आंदोलनों के दौरान मांसपेशियों में प्रदर्शन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक बाह्य प्रेरणा है, जो इस मामले में पर एक नल है के जवाब मेंसिर, 2 दिन बाद निषेचन (DPF) पर wildtype zebrafish आम तौर पर एक शक्तिशाली फट तैरना, तेजी से बदल जाता के साथ दिखा रहे हैं। हमारे विधि एक फट तैराकी प्रस्ताव के दौरान अधिकतम त्वरण मापने, त्वरण सीधे बल मांसपेशियों के संकुचन द्वारा उत्पादित करने के लिए आनुपातिक द्वारा किया जा रहा कंकाल की मांसपेशी समारोह quantifies।
इसके विपरीत, जल्दी zebrafish लार्वा विकास के दौरान हरकत assays मांसपेशियों की गतिविधि की निरंतर अवधि के दौरान मांसपेशियों में प्रदर्शन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। तैराकी व्यवहार पर नजर रखने के लिए एक ट्रैकिंग प्रणाली का उपयोग करते हुए, हम 6 दिन पुरानी zebrafish में गतिविधि और दूरी की आवृत्ति की एक स्वचालित गणना, उनके कंकाल की मांसपेशी समारोह को प्रतिबिंबित करता प्राप्त करते हैं। तैराकी प्रदर्शन की माप रोग मॉडल और म्यूटेशन या रासायनिक उपचार कंकाल की मांसपेशी समारोह को प्रभावित करने के उच्च throughput स्क्रीनिंग के प्ररूपी मूल्यांकन के लिए मूल्यवान हैं।
पिछले एक दशक में तेजी से zebrafish मांसपेशी कोशिका जीव विज्ञान और बीमारी अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। zebrafish भ्रूण, अपनी ऑप्टिकल स्पष्टता के साथ मिलकर तेजी से बाहरी विकास, मांसपेशियों गठन, विकास, और समारोह के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है। मांसपेशियों के विकास की प्रक्रिया अत्यधिक zebrafish में संरक्षित है और इस पेशी अपविकास और जन्मजात myopathies 1-8 सहित मांसपेशियों की बीमारियों की एक श्रृंखला के सफल मॉडलिंग अनुमति दी गई है। Zebrafish मॉडल की विस्तृत जांच के लिए न केवल इन शर्तों के pathobiology में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है, लेकिन यह भी उपयुक्त उपचारों 6,9-13 के परीक्षण के लिए एक मंच प्रदान किया।
मांसपेशियों की बीमारियों के zebrafish मॉडल का विश्लेषण विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य assays पर निर्भर करता है मांसपेशियों के प्रदर्शन को मापने के लिए। पिछले अध्ययनों सफलतापूर्वक 3 और 7 के बीच मछली में zebrafish ट्रंक मांसपेशियों द्वारा DPF के बल पैदा करने की क्षमता मापा हैविद्युत एक स्थिर एक शक्ति के पारगमन प्रणाली 14 से जुड़ी मछली के संकुचन उत्तेजक। इस बल की विस्तृत माप प्रदान कर सकते हैं लेकिन आदर्श उच्च throughput प्रयोगों के लिए अनुकूल नहीं हैं और वहाँ तैराकी के दौरान मांसपेशियों प्रदर्शन को मापने के लिए लाभ कर रहे हैं। 2 zebrafish पेशी DPF पर पूरी तरह कार्यात्मक है और मछली उत्तेजनाओं के जवाब में फट तैराकी आंदोलनों बटोर सकते हैं। स्पर्श आह्वान भागने प्रतिक्रिया परख एक फट तैराकी गति है, जो सिकुड़ा बल के एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता दौरान त्वरण को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है।
मायोपथी रोगियों में पेशी समारोह का सबसे अधिक इस्तेमाल उपायों में से एक 6 मिनट की पैदल दूरी परीक्षण है, जो रिकॉर्ड कुल दूरी एक कठिन फ्लैट सतह 15,16 पर चला गया है। हम zebrafish लार्वा DPF 6 में पेशी समारोह को मापने के लिए एक तुलनीय परीक्षा आवेदन किया है, जिससे हम कुल दूरी swum की निगरानी, और एक 10 मिनट की अवधि में प्रत्येक लार्वा द्वारा किए गए आंदोलनों की कुल संख्या। यह किया जाता हैएक स्वचालित ट्रैकिंग प्रणाली है, जो मांसपेशियों के प्रदर्शन के विश्वसनीय और उच्च throughput मापन प्रदान करता है का उपयोग कर। दोनों की मांसपेशी परीक्षण अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं और zebrafish मायोपथी मॉडल 8 में पेशी प्रदर्शन में अंतर यों इस्तेमाल किया गया है।
चूहों, कुत्तों, zebrafish, मक्खियों और कीड़े सहित कई अलग अलग पशु मॉडल मांसपेशियों की बीमारियों के आनुवंशिक और आणविक आधार के बारे में हमारी समझ की दिशा में योगदान दिया, और चिकित्सकीय दृष्टिकोण उन्हें मुकाबला करने के विकास में सहायता प्रदान की है। zebrafish मांसपेशियों की बीमारी के अध्ययन के लिए कई फायदे भी हैं। Zebrafish एक उपयुक्त मनोवैज्ञानिक वातावरण है, जो इन विट्रो संस्कृति प्रणालियों में संभव नहीं है में जटिल पेशी patterning आकलन करने के लिए एक आनुवंशिक रूप से manipulable प्रणाली प्रदान करता है। अन्य कशेरुकी पशु मॉडल के विपरीत, उत्पादित मछली की एक बड़ी संख्या है, एक साथ अपनी ऑप्टिकल स्पष्टता के साथ, की सुविधा विवो रासायनिक और जेनेटिक स्क्रीनिंग में तेजी, उच्च throughput।
यहाँ हम zebrafish आंदोलन assays के विकास का वर्णन एक उच्च throughput और स्वचालित विधि zebrafish embryogenesis दौरान मांसपेशियों में प्रदर्शन का आकलन करने के लिए प्रदान करते हैं। दोनों assays के लिए यह स्वीकार किया जाना चाहिए कि circadian लय औरबाहरी पर्यावरण उत्तेजनाओं काफी zebrafish तैराकी व्यवहार 17,18 को प्रभावित करेगा। एक ही zebrafish की दोहराया परीक्षण भी स्पर्श के जवाब में कमी के कारण उत्तेजना 23 आदी होना करने के लिए नेतृत्व करेंगे। इसलिए, क्रम में प्रयोगों के बीच प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्रत्येक zebrafish भ्रूण प्राप्त करने के लिए केवल एक बार परीक्षण किया जाना चाहिए, दिन और प्रकाश व्यवस्था की स्थिति के समय मानकीकृत किया जाना चाहिए, और पानी का तापमान कसकर विनियमित किया जाना चाहिए।
टच का उपयोग कर 2 में विश्लेषण पैदा DPF हम सीधे एक फट तैराकी कार्रवाई, जो मांसपेशियों की शक्ति के लिए आनुपातिक है की अधिकतम त्वरण उपाय कर सकते हैं। Zebrafish में पिछले तकनीकों प्रायोगिक उपकरण निम्नलिखित भ्रूण जो मांसपेशियों के संकुचन एक बिजली के क्षेत्र और मांसपेशियों 14 के बल पैदा क्षमता का उपयोग प्रेरित है मापा जाता है के दोनों सिरों बांधने से मांसपेशियों की शक्ति की जांच की है। नदीम इस विधि बल टी की क्षमता पैदा करने के उपायवह लार्वा मांसपेशियों, यह तैराकी के दौरान वास्तविक लार्वा पेशी द्वारा उत्पन्न बल उपाय नहीं है। इसलिए हम एक विधि परोक्ष रूप से बल सामान्य लार्वा तैराकी प्रस्ताव के दौरान उत्पन्न पेशी स्वास्थ्य का एक समग्र उपाय प्रदान करने के लिए आकलन करने के लिए विकसित की है। उच्च गति वीडियो प्रणाली, 1000 तख्ते की एक फ्रेम दर पर व्यक्तिगत zebrafish आंदोलनों रिकॉर्डिंग में सक्षम / सेक जो सीधे आंखों से अलग पहचाना नहीं हैं मांसपेशी समारोह में छोटी लेकिन महत्वपूर्ण मतभेद की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह देखने के लिए कि कैसे पहले से विद्युत प्रेरित बल पीढ़ी में परिवर्तन तैराकी प्रदर्शन में परिवर्तन के साथ संबंध स्थापित सूचना दी ब्याज की हो जाएगा।
इसके अलावा टच पैदा की प्रतिक्रिया assays भी इस तरह के आकार और तैराकी गति 24 के दौरान शरीर लहर की गति के रूप में तैराकी कीनेमेटीक्स, का आकलन करने के लिए, locomotory व्यवहार का एक मात्रात्मक माप देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
zebraf की सहज आंदोलन के कारणish लार्वा 3 DPF के बाद, हम मांसपेशी समारोह को मापने के लिए स्पर्श आह्वान assays प्रदर्शन करने में सक्षम नहीं थे। इसके विपरीत, हम 6 DPF पर zebrafish लार्वा से दूरी swum के निर्धारण से एक लंबी अवधि में पेशी प्रदर्शन मापा। इस परीक्षा में, हालांकि मांसपेशी समारोह के एक अप्रत्यक्ष उपाय, मछली बिगड़ा पेशी प्रदर्शन 8 या neurodegeneration 25,26 प्रदर्शित की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस परीक्षा में न केवल एक माप 6 मिनट की पैदल दूरी परीक्षण के अनुरूप प्रदान करता है, लेकिन यह भी विवो दवा या म्युटाजेनेसिस स्क्रीन में स्वचालित उच्च throughput के लिए उपयुक्त है।
The authors have nothing to disclose.
We thank Viewpoint for their kind sponsorship of this manuscript. This work was funded by an Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant (APP1010110).
21G X 1' Blunt Needle | Terumo/Admiral Medical Supplies | TE2125 | |
48-well plates | Sigma | M8937 | |
90mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S90001 | |
High Speed Camera | Baumer | HXC20 | |
http://www.randomization.com | N/A | Steps 1.1.2, 2.1.3 | |
Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
Plastic Pipette | VWR | 16001-188 | |
StreamPix5 | NorPix | Step 1.2.3 | |
Temperature Control Unit | Viewpoint | ||
Tweezers, style 8 | ProSciTech | T04-821 | |
Zebrabox System | Viewpoint | ||
Zebralab | Viewpoint | Steps 1.3.1, 2.2.1 |