Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.
Sebrafisk muskelutvikling er sterkt konservert med pattedyrsystemer som gjør dem til et utmerket modell for å studere muskelfunksjon og sykdom. Mange myopatier påvirker skjelettmuskelfunksjon kan raskt og enkelt vurderes i sebrafisk i løpet av de første dagene av embryogenese. Ved 24 timer etter befruktning (HPF), hvete sebrafisk spontant kontrakt sine halen muskler og ved 48 HPF, sebrafisk utstilling kontrollert svømme atferd. Reduksjon i hyppigheten av, eller andre endringer i, kan disse bevegelsene indikere en skjelettmuskel dysfunksjon. Å analysere svømmeatferd og vurdere muskel ytelse tidlig i sebrafisk utvikling, bruker vi både berørings fremkalt rømnings respons og locomotion analyser.
Touch-fremkalt rømnings respons analyser kan brukes til å vurdere muskel ytelse under korte serie bevegelser som følge av sammentrekning av raske muskelfibre. Som svar på en ekstern stimulus, som i dette tilfelle er et trykk påhodet, villtype sebrafisk 2 dager etter befruktning (DPF) vanligvis viser en kraftig utbrudd svømmetur, ledsaget av skarpe svinger. Vår metode kvantifiserer skjelettmuskelfunksjonen ved å måle maksimal akselerasjon i løpet av en burst svømming bevegelse, akselerasjon er direkte proporsjonal med kraften som produseres av muskelkontraksjon.
I kontrast er locomotion analyser i løpet av tidlig sebrafisk larveutvikling brukes til å vurdere muskel ytelse under vedvarende perioder med muskelaktivitet. Ved hjelp av et sporingssystem for å overvåke svømmeatferd, får vi en automatisk beregning av hyppigheten av aktivitet og avstand i 6 dager gamle sebrafisk, gjenspeiler deres skjelettmuskelfunksjon. Målinger av svømming ytelse er verdifulle for fenotypiske vurdering av sykdomsmodeller og high-throughput screening av mutasjoner eller kjemiske behandlinger som påvirker skjelettmuskelfunksjon.
I løpet av det siste tiåret sebrafisk har blitt stadig mer brukt til å studere muskelcellebiologi og sykdom. Den raske utviklingen av ytre sebrafisk embryo, kombinert med optisk klarhet, tillater direkte visualisering av muskeldannelse, vekst og funksjon. Prosessen med muskelutvikling er sterkt konservert i sebrafisk og dette har gjort en vellykket modellering av en rekke muskelsykdommer inkludert muskeldystrofier og medfødte myopatier 1-8. Detaljert undersøkelse av sebrafisk-modeller har ikke bare gitt ny innsikt i patobiologi av disse forholdene, men også gitt en plattform for testing av egnede behandlinger 6,9-13.
Analysen av sebrafisk modeller av muskelsykdommer er avhengig av pålitelige og reproduserbare analyser for å måle muskel ytelse. Tidligere studier har blitt målt den kraft som frembringes av et sebrafisk stammen muskelen i fisk mellom 3 og 7 DPF avelektrisk å stimulere sammentrekning av et immobilisert fisk festet til en kraft transduksjon system 14. Dette kan gi detaljerte målinger av kraft, men er ikke ideelt for høyere gjennomstrømning eksperimenter, og det er fordeler med å måle muskel ytelse under svømming. På to DPF sebrafisk muskelen er fullt funksjonell og fisken kan lokke fram burst svømmebevegelser som respons på stimuli. Den berøringsfremkalle fluktrespons analysen anvendes for å måle akselerasjon i løpet av en burst svømming bevegelse, som kan brukes som et mål på kontraktil kraft.
Et av de mest benyttet målinger av muskelfunksjonen i myopati pasienter er 6 min gangtest, som registrerer totaldistanse på en hard flat overflate 15,16. Vi har brukt en tilsvarende test for å måle muskelfunksjon i seks dpf sebrafisk larver, hvor vi overvåke den totale distansen svømt, og det totale antall bevegelser gjort av hver larve i løpet av en 10 minutters periode. Dette gjøresved hjelp av et automatisert system for sporing, som gir pålitelige og high-throughput målinger av muskel ytelse. Begge muskel testene er svært reproduserbare, og har blitt brukt til å kvantifisere forskjeller i muskel ytelse i sebrafisk myopati modeller 8.
Mange forskjellige dyremodeller, inkludert mus, hunder, sebrafisk, fluer og ormer har bidratt til vår forståelse av genetiske og molekylære grunnlaget for muskelsykdommer, og bistått i utviklingen av terapeutiske tilnærminger for å bekjempe dem. Sebrafisk har flere fordeler for studiet av muskelsykdommer. Sebrafisk gir et genetisk manipulere system for å vurdere kompleks muskel mønster i en passende fysiologisk miljø, noe som ikke er mulig i in vitro kultursystemer. I motsetning til andre virveldyr dyremodeller, det store antall fisk som produseres, sammen med dens optisk klarhet, letter hurtig, high-throughput in vivo kjemisk og genetisk screening.
Her beskriver vi utviklingen av sebrafisk bevegelse analyser for å gi en høy gjennomstrømming og automatisert metode for å vurdere muskel ytelse under sebrafisk embryogenese. For begge analysene må det erkjennes at døgnrytme ogytre miljømessige stimuli vil påvirke sebrafisk svømmeatferd 17,18. Gjentatt testing av den samme sebrafisk vil også føre til tilvenning forårsaker en reduksjon i respons til det taktile stimuli 23. Derfor, for å oppnå reproduserbare resultater mellom eksperimenter hver sebrafisk embryo skal bare testes en gang, den tiden av døgnet og lysforhold bør være standardisert, og vanntemperaturen må være strengt regulert.
Bruke berørings fremkalt analyse på to dpf vi kan direkte måle maksimal akselerasjon av en burst svømming handling, som er proporsjonal med muskelkraft. Tidligere teknikker i sebrafisk har undersøkt muskelstyrken ved å binde begge ender av embryoene som eksperimentelt utstyr hvor muskelkontraksjon stimuleres ved hjelp av et elektrisk felt og den kraftgenererende evne av muskelen 14 blir målt. Mens denne metoden måler kraften av produksjonsevnen av than larve muskel, betyr det ikke måle den virkelige kraften som genereres av larve muskelen under svømming. Vi har derfor utviklet en metode for indirekte å vurdere den kraft som dannes under den normale larvesvømme bevegelse for å gi en samlet grad av muskel helse. Den høyhastighets video system, kan ta opp enkeltsebrafisk bevegelser på en bildefrekvens på 1000 bilder / sek kan brukes til å identifisere små, men signifikante forskjeller i muskelfunksjon, som ikke er direkte gjenkjennelig ved øyet. Det vil være av interesse å se hvordan tidligere rapportert endringer i elektrisk stimulert kraft generasjon korrelerer med endringer i svømming ytelse.
I tillegg er den berørings fremkalt respons-assays kan også brukes til å vurdere svømme kinematikk, slik som formen og hastigheten av legemet bølge under bading bevegelse 24, for å gi en kvantitativ måling av motorisk oppførsel.
På grunn av den spontane bevegelse av zebrafish larver etter tre dpf, var vi ikke i stand til å utføre de berøringsfremkalle analyser for å måle muskelfunksjon. Motsatt har vi målt muskel ytelse over en lengre periode ved å bestemme avstand svømt av sebrafisk larver på 6 dpf. Denne testen, selv om et indirekte mål på muskelfunksjonen, kan brukes til å identifisere fisk som viser nedsatt muskelyteevne 8 eller neurodegenerering 25,26. Denne testen gir ikke bare en måling som er analog med den 6 min gange test, men er også egnet for automatisert high-throughput in vivo medikament eller mutagenese-skjermer.
The authors have nothing to disclose.
We thank Viewpoint for their kind sponsorship of this manuscript. This work was funded by an Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant (APP1010110).
21G X 1' Blunt Needle | Terumo/Admiral Medical Supplies | TE2125 | |
48-well plates | Sigma | M8937 | |
90mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S90001 | |
High Speed Camera | Baumer | HXC20 | |
http://www.randomization.com | N/A | Steps 1.1.2, 2.1.3 | |
Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
Plastic Pipette | VWR | 16001-188 | |
StreamPix5 | NorPix | Step 1.2.3 | |
Temperature Control Unit | Viewpoint | ||
Tweezers, style 8 | ProSciTech | T04-821 | |
Zebrabox System | Viewpoint | ||
Zebralab | Viewpoint | Steps 1.3.1, 2.2.1 |