Abstract
Obstáculos presentes no DNA, incluindo proteínas firmemente ligados e várias lesões, pode inibir seriamente a progressão da maquinaria de replicação da célula. O retardamento de um replissoma pode levar a sua dissociação do cromossoma, em parte ou a sua totalidade, levando ao colapso do garfo de replicação. A recuperação a partir deste colapso é uma necessidade para que a célula completa com precisão a duplicação cromossómica e subsequentemente se dividem. diversos mecanismos Portanto, quando ocorre o colapso, a célula tem evoluído que tomam lugar para restabelecer a forquilha de ADN e permitir a replicação para ser preenchido com alta fidelidade. Anteriormente, estas vias de reparação de replicação em bactérias, foram estudados utilizando os danos UV, o que tem a desvantagem de não ser localizada a um local conhecido. Este manuscrito descreve um sistema que utiliza um sistema de fluorescência repressor Operator (FROS) para criar um bloco de proteína específica do local que podem induzir a estagnação e colapso da replicação forks em Escherichia coli. Protocolos detalhe como o estado de replicação podem ser visualizados em células vivas individuais usando microscopia de fluorescência e de replicação de ADN intermediários podem ser analisados por electroforese em gel de agarose a 2-dimensional. Temperatura mutantes sensíveis de componentes réplisome (por exemplo DnaBts) pode ser incorporada no sistema para induzir um colapso síncrona dos garfos de replicação. Além disso, as funções das proteínas de recombinação e helicases que estão envolvidas nestes processos podem ser estudados utilizando knockouts genéticas dentro deste sistema.
Introduction
Durante a replicação do DNA, o replisome enfrenta obstáculos no DNA que prejudicar a sua progressão. Danos no ADN incluindo lesões e as lacunas assim como estruturas aberrantes pode impedir a replissoma de prosseguir 1. Recentemente, verificou-se que as proteínas ligadas ao ADN são a fonte mais comum de impedimento à replicação progressão forquilha 2. O conhecimento dos eventos após o encontro do replissoma com um bloco de nucleoproteína foi previamente limitada pela incapacidade de induzir uma tal bloco no cromossoma de uma célula viva no local conhecido. Análise in vitro aumentou a nossa compreensão do comportamento cinético de um replissoma activo quando se encontra com uma nucleoproteína bloqueio 3, bem como os detalhes mecanísticos da própria replissoma 4,5. Entendimento atual da reparação de replicação é geralmente realizada com UV como o agente prejudicial e estudada usando DNA plasmídeo in vivo 6-8 in vivo são geralmente entendidos a partir destes estudos, se existem variações nos eventos moleculares no interior das vias de reparação devido à causa distinta no bloco de replicação é ainda contudo estar determinado.
Aqui, descrevemos um sistema que permite que um bloco de nucleoproteína a ser criada em um local específico do cromossoma utilizando um repressor Sistema Operador Fluorescente (FROS). Nós utilizamos uma cepa de E. coli, que teve uma matriz de 240 locais tetO incorporados no cromossoma 9. Cada local tetO dentro da matriz tem uma sequência aleatória de 10 pb flanqueando-o a aumentar a estabilidade do conjunto, impedindo que a recombinação mediada por RecA-dentro da matriz. Esta matriz, e variações do mesmo, foram originalmente usado para entender E. coli dinâmica cromossómicas 10,11 mas foram depois adaptadas para PreveNT replicação in vivo 12. A matriz foi encontrado para ser mantida de forma estável e para bloquear perto de 100% de garfos de replicação quando ligado por TetR 10,12. A utilização da matriz de lacO semelhante in vitro descobriu tão poucos como 22 locais foram suficientes para bloquear 90% da replicação, embora esta gama mais curto foi menos eficaz in vivo 13. Para se adaptar a matriz para criar um bloqueio nucleoproteína, a proteína repressora deve ser altamente overproduced em condições otimizadas, onde então se liga à matriz para criar um obstáculo. A formação do bloqueio, e a sua subsequente libertação, pode ser controlada através da utilização de microscopia de fluorescência, se uma variante fluorescente etiquetado do repressor Tet é usado. O estado de replicação em cada célula está indicado pelo número de focos visto, em que um único ponto focal significa apenas uma cópia da matriz está presente no interior da célula e múltiplos focos são indicativos de replicação activa. Esta re ativaplicação é activado quando o bloqueio nucleoproteína é revertida pela adição do indutor gratuito que diminui a afinidade de ligação para o local de TetR operador suficientemente para replissoma para prosseguir através da matriz. A proteína repressora é ainda capaz de se ligar ao ADN com uma afinidade suficientemente alta que os agora múltiplas cópias da matriz pode ser visualizado.
Detalhes mais intrincados dos eventos no bloqueio nucleoproteína pode ser descoberto usando eletroforese em gel neutro neutro bidimensional agarose e hibridação Southern 14-16. Estas técnicas permitem a análise das estruturas de ADN através da população. Os intermediários de replicação que são formados durante o evento, e potencialmente permanecer não reparado, pode ser visualizada. Através da variação da enzima de restrição e da sonda utilizada, os intermediários podem ser visualizados não só na região da matriz, mas também a montante da matriz, quando o garfo de replicação regride 17,18. oregressão tenham ocorrido depois da dissociação replisome; os fios de condução e de retardamento nascentes separar a partir das cadeias molde e emparelham com uns aos outros como os cordões de modelo simultaneamente re-recozimento que resulta em uma estrutura de ADN de quatro vias (uma junção Holliday).
Utilizando este sistema, foi demonstrado que o garfo de replicação não é estável quando se encontra presente 18 bloco. Além disso, os derivados de componentes sensíveis à temperatura réplisome pode ser utilizada para impedir a recarga do garfo de replicação, uma vez que entrou em colapso. Uma vez que um bloco é estabelecida, a tensão pode ser deslocada para uma temperatura não permissiva para assegurar uma desactivação síncrona do replissoma e uma prevenção controlada de recarga. Esta desativação induzida pela temperatura garante todos os garfos dentro da população entraram em colapso em um determinado momento e permite a avaliação do que acontece quando o replisome entra em colapso, como o DNA é processado, eo que é necessário para reiniciar o processo de replicação do ADN.
Uma vantagem do sistema descrito aqui é que o bloco de nucleoproteína é totalmente reversível; portanto, a capacidade das células para se recuperar a partir do bloco nucleoproteína é capaz de ser seguido. A adição de anidrotetraciclina para as células irão aliviar a forte ligação do repressor, permitindo um garfo de replicação para prosseguir através da célula e para o restabelecimento da viabilidade. O relevo do bloqueio pode ser visualizada por electroforese em gel de agarose bidimensional neutro neutro depois de 5 min, e por microscopia dentro de 10 min. Além disso, a análise de viabilidade pode revelar a capacidade da estirpe para se recuperar a partir do bloqueio da replicação e continuam a proliferar.
Ao alterar o fundo genético das estirpes utilizadas no procedimento experimental descrito aqui, as vias de reparação para este tipo de bloqueio pode ser elucidado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bloqueio de replicação com FROS
- Induzindo a replicação de bloqueio
- Dilui-se uma cultura durante a noite fresca de uma E. coli estirpe transportando uma matriz tetO e pKM1 18 a OD 600nm = 0,01 em um meio complexo diluído (0,1% de triptona, 0,05% de extracto de levedura, 0,1% de NaCl, 0,17 M de KH 2 PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4), com antibióticos conforme requerido para selecção.
Nota: Não adicione tetraciclina para a seleção, uma vez que não é compatível com este sistema. Completar o volume de cultura equivalente a 10 ml por amostra necessário. Por exemplo, o volume de cultura para o desenho experimental na Figura 1 é de 60 ml. - Crescer a 30 ° C com agitação até DO600 nm = 0,05-0,1. Retirar uma amostra de 10 ml para servir como controlo não induzido e adiciona-se 0,1% de arabinose a restante cultura para induzir a produção de TetR-YFP de pKM1. Continuar a crescer tanto a não induzido e induzidoculturas. Depois de 1 hora, para verificar a presença de um único ponto focal dentro de cada célula da cultura induzida usando microscopia de fluorescência (ver secção 2).
- Se as células induzidas são confirmadas bloqueado (mais de 70% das células têm um único foco), registrar a 600nm OD e tirar uma amostra de 7,5 ml para análise por gel 2-D (ver secção 3). Tome uma amostra equivalente a partir da cultura de controlo não induzido.
- Dilui-se uma cultura durante a noite fresca de uma E. coli estirpe transportando uma matriz tetO e pKM1 18 a OD 600nm = 0,01 em um meio complexo diluído (0,1% de triptona, 0,05% de extracto de levedura, 0,1% de NaCl, 0,17 M de KH 2 PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4), com antibióticos conforme requerido para selecção.
- Liberando a replicação de bloqueio
- Para libertar o bloco para a replicação, adiciona-se 100 ng mL -1 de anidrotetraciclina o indutor gratuito (NA) a uma amostra das células bloqueadas 10 ml. Continuar a crescer a 30 ° C durante 10 minutos e recolher amostras de densidade celular (1 ml), A análise por microscopia (10 ul) e geles de agarose a 2-dimensionais neutro-neutras (7,5 mL).
- Induzindo Colapso da replissoma
- Se as células contêm um alelo sensível à temperatura, tais como TS dnaB ou TS dnaC que requer deactivação, mover o frasco contendo as células bloqueadas a 42 ° C. Retirar amostras para análises em pontos de tempo necessário (por exemplo, 1 hora, após incubação). Depois as células foram incubadas a 42 ° C durante 1 h, deslocar as células a 30 ° C durante 10 minutos (ver Figura 1).
Nota: As células podem ser deslocada para 30 ° C para análise de reinicialização.
- Se as células contêm um alelo sensível à temperatura, tais como TS dnaB ou TS dnaC que requer deactivação, mover o frasco contendo as células bloqueadas a 42 ° C. Retirar amostras para análises em pontos de tempo necessário (por exemplo, 1 hora, após incubação). Depois as células foram incubadas a 42 ° C durante 1 h, deslocar as células a 30 ° C durante 10 minutos (ver Figura 1).
Figura 1:. Overview of the Block and Release Procedimento Experimental FROS replicação E. estirpes de E. coli que transportam a matriz tetO são cultivadas a 30 ° C. Quando as células atingem uma OD 600nm de 0,05 acima, a produção de TetR-YFP é induzida com arabinose (ara; 0,1%). Continuar a crescer uma subpopulação de células não induzidas para actuar como controlos a 30 ° C. Uma amostra das células induzidas é analisada através de microscopia de fluorescência após 1-2 horas (ver 2.1). Se a replicação éconfirmou a ser bloqueado, são tomadas amostras para análise em gel 2-D indicada pelos tubos de ensaio (ver 3.1) e para testes de viabilidade (opcional). O bloqueio de replicação pode ser removido com anidrotetraciclina (AT; 0,1 ug / ml) e analisadas células 10 minutos mais tarde. Se as células portadores de um alelo sensível à temperatura (por exemplo, dnaB ts), isso pode ser inactivado por deslocar as células bloqueadas a 42 ° C para análise apropriada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Microscopia por fluorescência
- Prepara-se uma almofada de agarose por pipetagem de 500 ul de agarose fundida (1% em água) sobre uma lâmina de microscópio; sobrepor a lamela imediatamente antes das solidifica agarose. Armazenar as lâminas (s) em tecidos molhados, a 4 ° C até ser necessário.
- Quando a agarose foi solidificada, retirar a lamela do bloco de agarose e pipeta 10 ul de bacterianacultura para o centro do teclado para impedir o movimento de células durante a visualização. Uma vez que a amostra foi seca (aproximadamente 5 minutos), substitua a lamela. Coloque uma gota de óleo de imersão para a lamela e colocar a corrediça sob ótica.
- Visualize as células usando Fase Microscopia de 100x.
- Na caixa de diálogo Adquirir dentro do software de imagem, definir o tempo de exposição a 100 ms. Capturar a imagem selecionando Adquirir. Não mova o palco. Na caixa de diálogo Adquirir, selecione YFP como a iluminação para o Shutter externa relacionada com a Câmara. Defina o tempo exporsure a 1.000 ms. Desligue a luz palco. Capturar a imagem de fluorescência, selecionando Adquirir.
Nota: O tempo pode variar de acordo com fonte de luz, microscópio e câmera utilizada. - Para sobrepor a fase e imagens fluorescentes, selecione Cor Combine a partir do menu Display. Na caixa de diálogo Cor Combine, selecione a imagem YFP como o componente verde e a imagem de fase como o blue componente. Clique na cor combinar. Determinar se a população tinha replicação bloqueada com sucesso por estabelecer se a maioria das células têm um foco por célula.
Nota: comparação com uma amostra de controlo sem a adição de arabinose é útil para identificar visualmente a diferença na produção de EYFP.
- Na caixa de diálogo Adquirir dentro do software de imagem, definir o tempo de exposição a 100 ms. Capturar a imagem selecionando Adquirir. Não mova o palco. Na caixa de diálogo Adquirir, selecione YFP como a iluminação para o Shutter externa relacionada com a Câmara. Defina o tempo exporsure a 1.000 ms. Desligue a luz palco. Capturar a imagem de fluorescência, selecionando Adquirir.
3. Extração de DNA / agarose Plugs
- Adicionar azeto de sódio (concentração final de 0,1%) para as amostras de cultura de 7,5 ml a partir de passos 1.1.3 e 1.2.1. Incubar em gelo durante pelo menos 5 min.
Nota: A azida de sódio é extremamente tóxico. Consulte a Ficha de Segurança antes de iniciar o trabalho e não lidar com isso até que todas as precauções de segurança tenham sido lidas e compreendidas. - Centrifugar as células 5000 xg durante 10 min para sedimentar as células. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de tampão Pett IV (PIV) (10 mM de Tris: HCl (pH 8,0), NaCl 1 M). Microcentrífuga (13, 000 xg durante 2 min) para sedimentar as células. diScard o sobrenadante. Neste estágio, o processo os peletes ainda mais ou armazenar a -20 ° C.
- Ressuspender as células com a densidade celular mais baixo em 50 ul de PIV e colocar a 50 ° C. Para todas as outras amostras, ajustar os volumes de PIV assim a densidade celular final é a mesma em cada um dos tubos (por exemplo, amostra 1 (OD 600 nm = 0,128) ressuspenso em 50 ul; Amostra 2 (OD 600 nm = 0,138) ressuspenso em 54 ul).
- Adicionar um volume igual de solução recém-preparada de agarose a 0,8% em PIV (concentração final de 0,4%;. Por exemplo, uma amostra de 50 ul, 54 ul de amostra 2). Certifique-se de que as amostras, de agarose e PIV são acima de 50 ° C para impedir a solidificação.
- Tratar uma lâmina de microscópio com 40 mL de uma solução de vidro repelente de água ou silicone apropriado. Esfregue o slide com um lenço de papel até que esteja seco.
Nota: Isto pode ser feito com antecedência e as lâminas tratadas armazenado a longo prazo à temperatura ambiente. - Coloque 20 gotas ul de tEle suspensão de células / agarose no slide para produzir plugs que são hemisférica.
Nota: A primeira amostra (ressuspenso em 50 pi PIV) irá produzir 5 fichas em um slide. - Quando os tampões de ter solidificado, deslizar com suavidade em um tubo de microcentrífuga e adicionar 1 ml de tampão de lise celular (10 mM de Tris-HCl [pH 8], 1 M de NaCl, 100 ácido etilenodiaminotetracético mM (EDTA), 0,2% de desoxicolato de sódio, 0,5% sal de N-lauroilsarcosina de sódio (sarcosil), 100 ug ml de lisozima - 1, 50 ng mL - 1 de RNase A). Incubar a 37 ° C durante 2 h.
- Remover o tampão de lise de células e adicionar Sarcosil / proteinase K (ESP) solução de 1 ml de EDTA / (0,5 M de EDTA, sal de sódio a 1% de N-lauroilsarcosina (Sarcosil), 1 mg mL - 1 de proteinase K). Incubar a 50 ° C durante a noite ou até que as fichas são transparentes. Se uma segunda incubação durante a noite se necessário, substituir a solução com tampão de ESP fresco depois de aproximadamente 18 horas.
- Remova oESP tampão e lava-se os tampões de 5 vezes com 12 ml de Tris-EDTA (TE) de tampão (10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM, pH 8,0), permitindo um equilíbrio de 30 min com cada lavagem. Armazenar a 4 ° C em 1 ml de tampão TE.
4. Neutral neutro 2-Dimensional eletroforese em gel
- Transferir uma ficha de agarose do passo 3.8 para um tubo de microcentrífuga fresco e adicionar 150 ul de tampão de enzima de restrição (1x concentração). Adicionar 25-100 unidades de enzima de restrição (por exemplo, 60 unidades de EcoRV; (ver Figura 3A)). Digerir a 37 ° C durante 6-8 h.
- A 4 ° C, verter um gel de agarose a 0,4% (300 ml) em 1x Tris / borato / EDTA (TBE) para um tabuleiro de gel de cerca de 25 x 25 cm. Inserir um pente para poços de fazer aproximadamente a mesma largura que o diâmetro do bujão. Quando o gel é fixado, remover o pente e mover o gel até à temperatura ambiente.
- Deslize um dos tampões de agarose digerida em um poço, posicionar a lâmina plana do encaixe de encontro ao lado do poço onde tADN que vai entrar no gel. Inserir um único plug da mesma maneira em cada segundo poço.
- Pipetar 0,4% de agarose fundida nas cavidades para selar as fichas em posição.
- Carga escada de DNA de 1 kb num poço vazio, mais uma vez deixando um intervalo entre a escada e amostras, e executar o gel durante a noite (16 horas, 55 V) em TBE 1x, à temperatura ambiente.
- Corar o gel num banho de água contendo brometo de etídio (0,3 ug mL-1) durante 20 min.
Nota: O brometo de etídio é considerado um agente mutagénico potente e uma toxina. Consulte a Ficha de Segurança antes de iniciar o trabalho e não lidar com isso até que todas as precauções de segurança tenham sido lidas e compreendidas. - Visualizar o DNA com um transiluminador de UV de onda longa e cortar cada pista com um fragmento linear, mesmo cortado, minimizando a inclusão de excesso de agarose em ambos os lados da pista.
Nota: Por exemplo, se o fragmento de interesse é de 5,5 kb, cortado um fragmento de 7,5 centímetros para incluir os fragmentos de ADN a partir de 5 kb a approximately 12 kb (ver Figura 3A). - Coloque a pista de gel excisado num tabuleiro de gel a 90 ° em direcção da migração de DNA.
Nota: Duas fileiras de 3 fragmentos de gel pode caber em um tabuleiro de gel 25 x 25 2 cm. A primeira linha de pistas de gel está na parte superior do tabuleiro, a segunda fileira de 12,5 cm. - Preparar 300 ml de agarose para o segundo gel dimensão (0,9% em 1 x TBE com 0,3? G ml -1 de brometo de etídio). Quando a agarose é arrefecida a 50 ° C, pipetar a agarose fundida em torno das fatias de gel para solidificar a sua posição. Verta a agarose restantes na bandeja a uma profundidade que é pelo menos o nível com as fatias de gel.
- Uma vez que o gel é solidificado, electroforese a 4 ° C em TBE 1x contendo 0,3 ug mL1 brometo de etidio a 220 V até que o ADN tenha migrado cerca de 10 cm.
Nota: 4 horas é suficiente para um fragmento de 5,5 kb, mas um fragmento mais pequeno será necessário menos tempo. - Extirpar os blocos onde o DNA genómico está presente ucantar a borda de uma régua de metal, incluindo o gel acima, para incluir o ADN que não é visível (ver a Figura 3C).
5. Hibridação Southern
- Preparação de Soluções
- Preparar tampão despurinação (solução 0,125 M de HCl).
Nota: Este tampão pode ser reutilizado e que é estável à temperatura ambiente durante até um mês. - Preparar tampão de desnaturação (NaCl a 1,5 M, NaOH a 0,5 M).
Nota: tampão de desnaturação pode ser reutilizada uma vez e é estável até 3 meses à temperatura ambiente. - Preparar tampão de neutralização (NaCl 1,5 M, Tris 0,5 M). Ajustar a pH 7,5 com HCl.
Nota: tampão de neutralização pode ser reutilizada uma vez e é estável até 3 meses à temperatura ambiente. - Prepare 10x Solução salina de citrato de sódio (SSC) tampão (citrato 0,15 M Tri-sódio, 1,5 M de NaCl, pH é 7-8), para utilização em passos 5.2.4 e 5.2.6. A partir deste tampão, faça um estoque SSC 2x (para uso no passo 5.2.9).
Nota: 10x SSC e 2 x SSC umre estável à temperatura ambiente durante 3 meses. - Preparar tampão 19 de modificação Church e Gilbert hibridação (tampão fosfato 0,5 M [pH 7,2], 7% (w / v) de sulfato de dodecilo de sódio (SDS), EDTA 10 mM). Deixar a 65 ° C para dissolver completamente antes de usar.
- Preparar tampão despurinação (solução 0,125 M de HCl).
- Transferir
- Lavar os blocos de gel excisados em solução depurinação durante 10 min à temperatura ambiente num agitador rotativo ou agitador orbital. Mantenha a velocidade de agitação baixa para evitar danificar os blocos de agarose.
- Lavar os blocos de gel brevemente com água destilada e depois com tampão de desnaturação durante 30 min. Lavar novamente brevemente em água destilada e, em seguida, incubar os blocos de gel em tampão de neutralização, durante 30 min com agitação suave à temperatura ambiente.
- Cortar uma membrana de nylon para a dimensão exacta do gel (s). Corte um nick no canto superior direito para ajudar a orientar a membrana em etapas futuras.
Nota: Dois blocos de gel (6 amostras) pode ser visualizado em uma membrana. - Pour suficiente 10x SSC em uma de trAy de modo que não vai secar durante a noite. Criar uma plataforma de cerca de 5 cm acima do nível do tampão. Saturar 3 folhas de 3mm de papel para cromatografia com 10x SSC e coloque sobre a plataforma. Cortar o papel de cromatografia de modo que é suficientemente longo para ser imersa em tampão em ambas as extremidades e de largura suficiente para encaixar o gel na membrana.
- Colocar o gel (s) na parte superior do papel cromatográfico saturado. Enquadrar o gel com película de plástico para evitar que o tampão de by-passar o gel durante a transferência. Cuidadosamente colocar a membrana de corte no topo do gel (s). Retirar as bolhas de ar entre a membrana e o gel por laminagem uma garrafa ou pipeta serológica suavemente através da membrana.
- Corte três folhas de papel 3MM cromatograf ia com o mesmo tamanho como a membrana. Saturar as folhas de papel de cromatografia com 10x SSC e colocar na parte superior da membrana. Remova as bolhas de ar que se formaram.
- Pilha toalhas de papel, pelo menos, 5 cm de altura em cima do papel mata-borrão seguido por um suporte sólido (apropeso ximate de 1 kg para uma membrana de 23 x 16 cm). Permitir que a transferência prosseguir durante a noite.
- Expor a membrana (ADN lado para cima) a 1200 J / m2 de UV para reticular o ADN à membrana. Não enxaguar antes desta etapa.
- Lavar a membrana completamente em SSC 2x para evitar elevado ruído de fundo nas imagens blot. Use a mancha imediatamente para hibridação (ver 5.3) ou secá-lo à temperatura ambiente, embrulhe em filme plástico e armazenar a 4 ° C.
- hibridização
- Pré-aqueça o forno de hibridação e os frascos a 55 ° C.
- Adicionar 100? G ml -1 de albumina de soro bovino (BSA) e 10? G ml -1 de ADN não específico (por exemplo, ADN de esperma de salmão) ao tampão de hibridação pré-aquecida.
- Para permitir uma cobertura uniforme do tampão de hibridação, quando a membrana é enrolado, coloque a mancha sobre um quadrado de tamanho similar de malha de nylon com o lado ligado ao ADN da membrana virada para cima. Role a blot ao longo de sua borda longa. Deslizara mancha / mesh dentro de uma garrafa de hibridização. Adicionar uma quantidade apropriada de tampão de hibridação pré-aquecida para desenrolar o blot (por exemplo 30 ml para uma membrana de 23 x 16 cm2).
- Incubar em um forno pré-aquecido, girando os frascos, durante 1 h.
- Preparar a sonda através da mistura de 50 ng de produto de PCR purificado homóloga à região de interesse, 150 ng de iniciadores de hexâmero aleatório, para tamponar o fragmento de Klenow e H 2 O para fazer um volume de 13 ul. Ferver durante 3 min, em seguida, colocar imediatamente em gelo. Adicionar 1 ml de 1 mM de dCTP / dGTP / dTTP mistura, 1 ul de fragmento de Klenow (5 U) e 50 uCi de desoxiadenosina-trifosfato marcado radioactivamente 5'no fosfato alfa (α 32 P-dATP).
- Incubar à temperatura ambiente durante 1 h. Adicionar 1 ml de 1 dNTP mM misturar e 1 ml de fragmento de Klenow. Incubar 20 min a RT.
- Ferva sonda para 5 min e adicionar imediatamente para tubos de hibridização. Hibridar durante a noite a 55 ° C, com rotação.
- Decantar o prOBE de membrana.
Nota: A sonda é capaz de ser reutilizada uma vez. - Lavar a membrana rapidamente em pré-aquecido, tampão de lavagem de baixo rigor (2 x SSC, 0,1% (w / v) de SDS). Adicionar tampão fresco de baixo rigor na lavagem e incubar durante 5 min a 55 ° C com rotação. Repetir.
- Lavar duas vezes em tampão de lavagem de rigor médio (1x SSC, 0,1% (w / v) de SDS) durante 10 min a 55 ° C com rotação.
- Lavar duas vezes em tampão de lavagem de severidade elevada (0,1 x SSC, 0,1% (w / v) de SDS) durante 5 min a 55 ° C com rotação.
- Remover a membrana e DAB com tecido para remover o excesso de líquido. Embrulhe em filme plástico assegurando que não há umidade remanescente sobre o filme plástico e coloque na gaveta exposição com uma tela de armazenamento de fósforo pré-inibida. Fechar a cassete e expor durante pelo menos 2 horas antes de visualização usando um gerador de imagens de fósforo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O FROS é um bloco de nucleoproteína induzível, específica do local que permite intermediários de replicação para ser visualizado em células vivas 12,18. Um projeto experimental geral para células de amostragem é ilustrada na Figura 1. O momento da amostragem e variações no fundo genético tornar este um sistema versátil para estudar o reparo de um tal bloco. O esquema ilustra como mutantes sensíveis à temperatura, tais como TS e TS dnaB dnaC que têm sido utilizados previamente 18, pode ser utilizado neste sistema.
A indução dos FROS foi levada a cabo num E. estirpe de E. coli tal como mostrado na Figura 1 para as estirpes sensíveis não-temperatura. Para confirmar que um bloco de nucleoproteína tinha sido estabelecido, as células foram visualizadas por microscopia de fluorescência após 1 h de crescimento em 0,1% de arabinose. esteprazo é geralmente adequada para produzir o bloco em uma cepa do tipo selvagem, mas cepas mais exigentes podem requerer otimização. A maioria das células continha um foco (Figura 2A, + ARA), o que corresponde a uma única cópia da matriz no interior da célula, indicando desse modo a replicação tinha sido bloqueado. Os números de células com um foco, 2 focos ou mais do que 2 focos foram contados numa população de mais do que 100 células. 92% das células foram encontrados a ter um foco com os restantes 8% com 2 focos. Presumiu-se que as células que tiveram dois focos bem afastados, o que representa duas cópias do array, teria a próxima rodada de replicação bloqueada. As células com dois focos próximos uns dos outros significam que a matriz recentemente tenha sido replicada e o bloco de nucleoproteína ainda não tenha sido alcançada.
O bloco de nucleoproteína foi revertido pela adição de anidrotetraciclina (AT) e duplicação subsequente da matriz visualizado como aacumulação de células com múltiplos focos (Figura 2A, + ara / AT). Múltiplos focos dentro de uma célula visualizadas por microscopia de fluorescência significar a matriz tenha sido replicada com sucesso e tenha passado tempo suficiente para permitir que o loci para se separam, superar qualquer irmã cromossoma coesão que estava presente. Neste exemplo, a 10 minutos após a adição de pelo, 94% de células tinham 2 ou mais focos e até 8 focos por célula foram visualizados.
Para assegurar que o bloco de nucleoproteína efectivamente inibir a replicação, a viabilidade celular foi analisado (Figura 2B). As células que tenham tido replicação inibida pelos FROS mostram uma diminuição de aproximadamente 1.000 vezes em unidades formadoras de colónias comparativamente com as células que não foram cultivadas na presença de arabinose. As células que foram subsequentemente cultivadas na presença de anidrotetraciclina mostram reversão dessa inibição do crescimento. Se as células não foram capazes de reparar o DNA após o lançamentonucleoproteína do bloqueio, uma redução na viabilidade resultaria.
Para visualizar os intermediários de replicação, as células podem ser lisadas dentro tampões de agarose e a proteína e o ARN removido. O ADN pode então ser digerido com uma enzima de restrição apropriada para a região de interesse. ADN representado na Figura 3A foi digerido com EcoRV que corta o ADN imediatamente antes da matriz, dentro da matriz e depois a matriz para se obter 5,5 kb e 6,7 kb em fragmentos da região de interesse (Figura 3B). Os fragmentos são idealmente ~ 3-7 kb para o protocolo aqui descrito. Fragmentos fora desta gama pode exigir a alteração das concentrações de agarose utilizados e as condições de electroforese para conseguir uma boa separação. O ADN foi submetido a electroforese na primeira dimensão e visualizada (Figura 3A). Se o DNA foi digerido completamente, todas as pistas terão rodar de maneira uniforme e não haveráuma quantidade elevada de baixo peso molecular (menos do que cerca de 3 kb, dependendo da enzima de restrição). ADN presente no poço sugere lise celular incompleta e uma grande quantidade de ADN de elevado peso molecular (acima de 10 kb) implica a digestão incompleta do ADN.
O ADN de interesse em cada pista foi excisado. Na Figura 3A, o ADN acima de 5 kb foi incluído. A segunda dimensão subsequente do gel foi submetido a electroforese, resultante de uma diagonal de ADN linear (Figura 3C). O DNA matriz dentro deste gel foi então visualizadas por hibridização de Southern (Figura 3D). No desbloqueado (- amostra ARA), duas manchas pode ser visto, o que corresponde a 5,5 kb e 6,7 kb fragmentos da matriz, como era esperado. A amostra que havia replicação bloqueada (+ ara) mostrou uma diminuição do ponto de 5,5 kb em comparação e a adição de um sinal elíptica, o que indica uma acumulação de ADN em forma de Y na amostra. O sinal élocalizada em uma posição, significando os garfos de replicação estão prendendo em um lugar semelhante em toda a população. Por adição de anhydrotetracyline, o sinal em forma de Y de ADN já não pode ser visto. Um recente reinicialização é indicada pela presença de um sinal de todo o Y-arco, que descreve os garfos que migram através da região.
É importante para normalizar o ADN no interior de cada vela de agarose para garantir os sinais das amostras são mesmo. Os sinais podem ser quantificados com software de imagem apropriado. Outro intermediário comum visto é que indicando junção Holliday formação (HJ). Um HJ é visualizado como um sinal de cone no topo do Y de arco e um pico a partir do ADN linear no final do arco Y (Figura 3D).
Figura 2: microscopia de fluorescência e VIAB ility. (A) Um E. coli estirpe transportando a matriz tetO foi cultivada a 30 ° C na presença de 0,1% de arabinose (Ara +) durante 1 hora e, em seguida, anidrotetraciclina (AT) foi adicionado durante 10 min a uma subpopulação para libertar o bloco para a replicação. micrografias representativas estão apresentados para a produção de YFP (painel superior). Barra de escala = 2 uM. A proporção de células que transportam uma, duas ou mais do que 2 focos foram enumerados e são apresentados como uma percentagem (painel inferior). (B) As células cultivadas na ausência de arabinose (- ARA), com arabinose (+ ARA) e com ambos arabinose e anidrotetraciclina (NO; 10 min) foram diluídas em série de 10 vezes e, ou manchado ou espalhada sobre única ampicilina agar contendo ( - / + ara amostras) ou ampicilina com anidrotetraciclina (+ AT amostra) e cultivadas a 30 ° C para determinar a viabilidade celular. Top: placa representativa mostrando crescimento em diluições indicadas. Parte inferior: gráfico que mostra a média CFU / mL +/- SEM.ww.jove.com/files/ftp_upload/54434/54434fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
. Figura 3: A visualização do DNA Replication Intermediates Num bloco Nucleoproteína (A) O ADN genómico a partir de células (1, - ara; 2, + ara; 3, + ara / AT) que foram lisadas dentro tampões de agarose e digerido com a enzima de restrição EcoRV foi separada num gel de agarose 0,4% (55 V, 16 hr). 3 kb, 5 kb e 10 kb bandas são indicados. O ADN acima do marcador de 5 kb foi excisado como indicado pelas caixas brancas. (B) Esquema de EcoRV a digestão da região da matriz. garfos de replicação que entram na matriz a partir da origem ficar bloqueados dentro do fragmento de 5,5 kb quando as células foram cultivadas na presença de arabinose. Os locais de restrição utilizados estão indicados por setas e a ARraio é mostrado como uma caixa com linhas. (C) O ADN excisada foi rodado 90 ° e separados num gel de agarose a 0,8% (220 V, 4 h). A caixa branca indica a excisão do ADN após a separação. (D) A região matriz foi subsequentemente visualizado por análise de transferência de Southern utilizando uma sonda radioactiva a região da matriz. As células com um bloco de replicação nesta posição terá o sinal correspondente ao fragmento de 5,5 kb localizado no Y-arco. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | 16922 | Growth media component |
| Sodium Chloride | VWR | 27810.364 | Growth media component |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 92144 | Growth media component |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth media component; Potassium buffer component |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth media component; Potassium buffer component |
| L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | For induction of TetR-YFP production |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | Release of replication bloackage |
| Axioskop 2 Fluorescence microscope | Zeiss | 452310 | Visualization of cells |
| eYFP filter set | Chroma Technology | 41028 | Visualization of YFP |
| CCD camera | Hamamatsu | Orca-AG | Visualization of cells |
| MetaMorph Software (Molecular Devices) | SDR Scientific | 31282 | Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | For agarose plugs and gel electrophoresis |
| Original Glass Water Repellent (Rain-X) | Autobarn | DIO1470 | For agarose plug manufacture |
| TRIS | VWR | VWRC103157P | TE, TBE buffer component |
| Ethylene diaminetetraacetic acid | Ajax Finechem | AJA180 | 0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Bacteriostatic agent |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | TE buffer component |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Cell lysis buffer component |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl) | Sigma-Aldrich | L5125 | Cell lysis and ESP buffer component |
| Rnase A | Sigma-Aldrich | R6513 | Cell lysis buffer component |
| Lysozyme | Amresco | 6300 | Cell lysis buffer component |
| Proteinase K | Amresco | AM0706 | ESP buffer component |
| Sub-Cell Model 192 Cell | BioRad | 1704507 | Electrophoresis system |
| UV transilluminator 2000 | BioRad | 1708110 | Visualization of DNA |
| Ethidium Bromide | BioRad | 1610433 | Visualization of DNA |
| Boric acid | VWR | PROL20185.360 | TBE component |
| Hybond-XL nylon memrbane | Amersham | RPN203S | Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used |
| 3MM Whatman chromatography paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030690 | Southern blotting |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | 95-0031-01/02 | Crosslinking of DNA and hybridization |
| Deoxyribonucleic acid from salmon sperm | Sigma-Aldrich | 31149 | Hybridization buffer component |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | Denaturation buffer component |
| Trisodium citrate dihydrate | VWR | PROL27833.363 | Transfer buffer |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Amresco | 227 | Wash buffer component |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Hybridization buffer component |
| Random Hexamer Primers | Bioline | BIO-38028 | |
| Klenow fragment | New England BioLabs | M0212L | |
| dNTP Set | Bioline | BIO-39025 | |
| Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP | PerkinElmer | BLU502A | |
| Storage Phosphor Screen | GE Healthcare Life Sciences | GEHE28-9564-76 | BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35 cm x 43 cm screen |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9558-09 | Visualization of blot |
| Hybridization bottle | UVP | 07-0194-02 | 35 mm x 300 mm |
References
- Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. Replication fork stalling at natural impediments. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (1), 13-35 (2007).
- Gupta, M. K., et al. Protein-DNA complexes are the primary sources of replication fork pausing in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7252-7257 (2013).
- McGlynn, P., Guy, C. P. Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro. J Mol Biol. 381 (2), 249-255 (2008).
- Tanner, N. A., et al. Single-molecule studies of fork dynamics in Escherichia coli DNA replication. Nat Struct Mol Biol. 15 (2), 170-176 (2008).
- Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis. Nature. 457 (7227), 336-339 (2009).
- Rudolph, C. J., Upton, A. L., Lloyd, R. G. Replication fork stalling and cell cycle arrest in UV-irradiated Escherichia coli. Genes Dev. 21 (6), 668-681 (2007).
- Jeiranian, H. A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. Inefficient replication reduces RecA-mediated repair of UV-damaged plasmids introduced into competent Escherichia coli. Plasmid. 68 (2), 113-124 (2012).
- Le Masson, M., Baharoglu, Z., Michel, B. ruvA and ruvB mutants specifically impaired for replication fork reversal. Mol Microbiol. 70 (2), 537-548 (2008).
- Wang, X., Liu, X., Possoz, C., Sherratt, D. J. The two Escherichia coli chromosome arms locate to separate cell halves. Genes Dev. 20 (13), 1727-1731 (2006).
- Lau, I. F., et al. Spatial and temporal organization of replicating Escherichia coli chromosomes. Mol Microbiol. 49 (3), 731-743 (2003).
- Gordon, G. S., et al. Chromosome and low copy plasmid segregation in E. coli: visual evidence for distinct mechanisms. Cell. 90 (6), 1113-1121 (1997).
- Possoz, C., Filipe, S. R., Grainge, I., Sherratt, D. J. Tracking of controlled Escherichia coli replication fork stalling and restart at repressor-bound DNA in vivo. EMBO J. 25 (11), 2596-2604 (2006).
- Payne, B. T., et al. Replication fork blockage by transcription factor-DNA complexes in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 34 (18), 5194-5202 (2006).
- Brewer, B. J., Fangman, W. L. The localization of replication origins on ARS plasmids in S. cerevisiae. Cell. 51 (3), 463-471 (1987).
- Jeiranian, H. A., Schalow, B. J., Courcelle, J. Visualization of UV-induced replication intermediates in E. coli using two-dimensional agarose-gel analysis. J Vis Exp. (46), (2010).
- Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol. 98 (3), 503-517 (1975).
- Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA damage-induced replication fork regression and processing in Escherichia coli. Science. 299 (5609), 1064-1067 (2003).
- Mettrick, K. A., Grainge, I. Stability of blocked replication forks in vivo. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Church, G. M., Gilbert, W. Genomic sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (7), 1991-1995 (1984).
- Michel, B., Grompone, G., Flores, M. J., Bidnenko, V. Multiple pathways process stalled replication forks. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12783-12788 (2004).
- Michel, B., Boubakri, H., Baharoglu, Z., LeMasson, M., Lestini, R. Recombination proteins and rescue of arrested replication forks. DNA Repair (Amst). 6 (7), 967-980 (2007).
- Carl, P. L. Escherichia coli mutants with temperature-sensitive synthesis of DNA. Mol Gen Genet. 109 (2), 107-122 (1970).
- Nawotka, K. A., Huberman, J. A. Two-dimensional gel electrophoretic method for mapping DNA replicons. Mol Cell Biol. 8 (4), 1408-1413 (1988).
- Cole, R. S., Levitan, D., Sinden, R. R. Removal of psoralen interstrand cross-links from DNA of Escherichia coli: mechanism and genetic control. J Mol Biol. 103 (1), 39-59 (1976).
