Summary
بروتوكول للاستفادة بولي (N--iso propylacrylamide) (PIPAAm) ميكروفلتر المغلفة لالتقاط فعالة وإطلاق thermoresponsive من قابلة للحياة تعميم الخلايا السرطانية (CTC) وتقدم. هذا الأسلوب يسمح القبض على رابع كلوريد الكربون من الدم المرضى والإفراج لاحقا من لجنة مكافحة الإرهاب قابلة للثقافة المصب خارج رقاقة وتحليل وتوصيف.
Abstract
ونحن لشرح طريقة لالتقاط أساس حجم قابلة للحياة تعميم الخلايا السرطانية (CTC) من الدم الكامل، جنبا إلى جنب مع الافراج عن هذه الخلايا من رقاقة لتحليل و / أو ثقافة المصب. وتوظف استراتيجية استخدام رواية Parylene C فتحة غشاء المسام ميكروفلتر للقبض على لجنة مكافحة الإرهاب وطلاء بولي (N--iso propylacrylamide) (PIPAAm) لthermoresponsive الإفراج قابلة للحياة من لجنة مكافحة الإرهاب التي تم التقاطها. يتم تمكين القبض على الخلايا الحية من خلال الاستفادة من تصميم هندسة فتحة المسام مع أبعاد محددة للحد من إجهاد القص التي ترتبط عادة مع عملية الترشيح. في حين أن ميكروفلتر يسلك كفاءة التقاط عالية، وإطلاق سراح من هذه الخلايا غير تافهة. عادة، يتم الافراج سوى نسبة صغيرة من الخلايا عندما يتم استخدام تقنيات مثل التدفق العكسي أو كشط الخلايا. التصاق قوي من هذه الخلايا السرطانية الظهارية للغشاء Parylene C يعزى إلى تفاعل كهرباء غير محددة. لمواجهة الهو الواقع، قمنا بتوظيف استخدام PIPAAm الطلاء واستغلال خصائصه استجابة الحرارية بينية للافراج عن الخلايا من مرشح. يتم تصفية الدم لأول مرة في درجة حرارة الغرفة. أقل من 32 درجة مئوية، PIPAAm هو ماء. بعد ذلك، يتم وضع فلتر في أي من وسائل الإعلام ثقافة أو منطقة عازلة الحفاظ على 37 درجة مئوية، مما يؤدي في PIPAAm تحول مسعور، وبالتالي الإفراج عن الخلايا المربوطة كهربية.
Introduction
المرض المنتشر هو المسؤول عن معظم وفيات السرطان. تطوير النذير ورفيق العلامات البيولوجية لتشخيص ورم خبيث أمر بالغ الأهمية في إدارة مرض السرطان وعلاجه. تعميم الخلايا السرطانية (CTC) تلعب دورا رئيسيا في نشر الورم والانبثاث. وعلاوة على ذلك، التي يمكن الوصول إليها بسهولة ك "السائل خزعة" العلامات البيولوجية، لجنة مكافحة الإرهاب في مرضى السرطان الدم المحيطي قد ارتفع ك "معقل" لأبحاث السرطان العلامات البيولوجية. لجنة مكافحة الإرهاب تم التحقق من صحتها فضلا عن العلامات البيولوجية النذير في إعدادات السرطان المختلفة، بما في ذلك الثدي والبروستات وسرطان القولون والمستقيم 1-3. ومع ذلك، التطورات الحديثة في مجال مكافحة الإرهاب وأشارت إلى أن مجرد تعداد هذه الخلايا النادرة محدودة فائدة سريرية، كما هو مبين في التجارب السريرية التدخلية 4. وبالتالي، هناك حاجة الناشئة عن التقنيات التي تسمح للالتوصيف الجزيئي وظيفي لجنة مكافحة الإرهاب. حاليا، قليل من التكنولوجيات فقط توجد تسمح FOص غير مستضد منحازة، القبض قابلة للحياة، والإفراج عن لجنة مكافحة الإرهاب، تمكن قوي المصب الجزيئية والوظيفية 5،6 التحليل. تقترن معظم هذه الأجهزة microfabricated إلى منصات ميكروفلويديك وبالتالي يكون عاملا يحد من كمية الدم التي يمكن معالجتها، والتي تتراوح 2-4 مل 7-10. لجنة مكافحة الإرهاب هي الأحداث النادرة في أنبوب واحد من سحب الدم (7.5 مل)، وبالتالي الحد من زيادة كمية الدم التي يمكن معالجتها، يعيق كثيرا من فرص التقاط وعزل هذه الخلايا من الفائدة.
لقد قمنا بتطوير نوعين من الأجهزة غشاء ميكروفلتر Parylene C للقبض على لجنة مكافحة الإرهاب التي تستغل حجم الخلافات بين خلايا الورم أكبر وأصغر خلايا الدم العادية 11،12. لقد ذكرت سابقا في جولة التصفية المسام التعداد ومقارنة ذلك مع منصة وافقت ادارة الاغذية والعقاقير، حيث أظهرت ميكروفلتر لتكون متفوقة في لجنة مكافحة الإرهاب كفاءة التقاطلعينات سرطان الدم المريض 13،14. ومع ذلك، وجود قيود على مرشح الجولة هو ضرورة لاستخدام مثبت القائم على الفورمالديهايد قبل الترشيح. هذه العملية تحافظ على مورفولوجيا الخلايا مع السماح لهم لتحمل إجهاد القص والضغط أثناء عملية الترشيح. بينما التعداد والدراسات الجزيئية يمكن أن يؤديها على رقاقة 13، تثبيتي يضعف القدرة على أداء توصيف وظيفي. لمعالجة هذا القيد، وضعنا المسام مرشح الفتحة التي ينفي ضرورة إصلاح الخلايا السابقة للترشيح (الشكل 1). هندسة فتحة المسام (6 ميكرومتر عرض × 40 ميكرون فتحة طول المسام) تسمح للخلايا الورم ليتم القبض على حين تسد جزئيا فقط المسام، وبالتالي لا يزال السماح بالمرور الحر للخلايا الدم الأخرى والتخفيف من ارتفاع في الضغط من شأنه أن يؤدي إلى تلف الخلايا وانفجار في نهاية المطاف 15،16 يتكون خرطوشة فتحة المسام من 2 قطعة الاكريليك التي شطيرةمرشح فتحة المسام بين قطعة أعلى وأسفل مع ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) بصفتها طوقا لتوفير مانعة للتسرب ختم 14،15 (الشكل 1).
في حين أن الكفاءة القبض على مرشح فتحة المسام عالية، لا بد (الجدول 1)، لجنة مكافحة الإرهاب القبض على الغشاء Parylene C بواسطة تفاعلات قوية غير محددة كهرباء بدلا من المصفوفة خارج الخلية (ECM) بوساطة الالتصاق 15. أساليب مثل التدفق العكسي أو استخدام كاشطات خلية تفشل في إطلاق سراح نحو فعال الخلايا من مرشح، أو تؤدي إلى تلف الخلايا وموت الخلايا. بحثنا الاستخدام غير تقليدية من PIPAAm إلى صياغة استراتيجية الافراج عن 15. PIPAAm هو بوليمر أن يخضع لعكسها أقل حرجة درجة حرارة المحلول (LCST) المرحلة الانتقالية في درجة حرارة المحلول من 32 درجة مئوية (17). تقليديا، وقد تم اكتشاف نطاق واسع هذا العقار من PIPAAm لتطبيقات هندسة الأنسجة. عادة، الخلاياالسطوح مثقف على PIPAAm المغلفة عند 37 درجة مئوية عندما PIPAAm هو مسعور. ويمكن بعد ذلك الخلايا يمكن فصل كورقة عندما يتم إزاحة درجة حرارة الثقافة إلى أقل من 32 درجة مئوية، حيث يصبح سطح PIPAAm المغلفة رطب 17،18. نحن استغلال هذه الخاصية الحرارية عن طريق إجراء عملية الترشيح في درجة حرارة الغرفة (أقل من 32 درجة مئوية)، ومن ثم تمكينه الافراج عن خلية عن طريق وضع مرشح في وسائل الإعلام ثقافة الحفاظ على 37 درجة مئوية. عند هذه الدرجة، وطبقة البوليمر PIPAAm يصبح مسعور، وبالتالي الإفراج عن خلايا ملزمة كهربية 15 (الشكل 1).
على الرغم من أن طريقة استجابة درجة الحرارة فضلا عن أساليب أخرى تم تنفيذها بنجاح لتحقيق القبض على رابع كلوريد الكربون قابلة للحياة والافراج 19-21، عيب واحد محتمل رئيسي تتقاسمها هذه التكنولوجيات المبلغ هو أنهم جميعا في توظيف مبدأ تعتمد على مستضد لالتقاط جنة مكافحة الإرهاب. مستضد مقرها القبض على رابع كلوريد الكربون، ص كما هو مبينreviously، قد يؤدي إلى منحاز لجنة مكافحة الإرهاب تحليل 11،14. على سبيل المثال، العديد من التكنولوجيات القائمة على تقارب تستخدم الأجسام المضادة التي تربط EpCAM لالتقاط جنة مكافحة الإرهاب. ومع ذلك، فقد ثبت أن لجنة مكافحة الإرهاب في التعبير عن مستويات مختلفة من EpCAM، مما يؤدي إلى إغفال EpCAM منخفضة وEpCAM السلبية لجنة مكافحة الإرهاب من خلال هذه التقنيات. أيضا، قد يحدث القيود عند لجنة مكافحة الإرهاب من أصل غير الظهارية هو من مصلحة، مثل لجنة مكافحة الإرهاب في إعدادات سرطان الجلد وساركوما. وهكذا، فإن التكنولوجيا التي تسمح لالتقاط CTC قابلة للحياة والإفراج، دون التحيز المحتمل الذي عرضته التقاط مستضد أساس مرغوب فيه للغاية.
الأهم من ذلك، هو حجم جهاز الالتقاط ميكروفلتر بحتة على أساس واستراتيجية الإصدار هو الملحد إلى وجود بعض علامات سطح. ونحن نعتقد أن العمل من ميكروفلتر المغلفة PIPAAm سيساعد على توسيع فهمنا للعملية المتنقل، من خلال توفير القدرة على التقاط الصور والافراج عن لجنة مكافحة الإرهاب لتحليل المصب بفعالية وكفاءة. وهذا قد قويةially كشف الجزيئات الجديدة التي قد تكون موجهة رواية المستهدفة العلاجات الشاملة فضلا عن توفير العلامات البيولوجية التي يمكن رصدها بسهولة والمساعدة في سرطان التعامل مع المرضى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الأخلاق بيان: لحماية حقوق الرعايا الإنسان، وقد تم الحصول على عينات دم بعد الموافقة المسبقة تحت البروتوكولات المعتمدة من قبل جامعة ميامي مجالس المراجعة المؤسسية تحت IRB 20150020.
ملاحظة: الدم لتتم تصفيته لالتقاط جنة مكافحة الإرهاب يجب أن تجمع في أنبوب EDTA لمنع تجلط الدم.
1. طلاء على ميكروفلتر مع بولي (N-ISO-propylacrylamide) (PIPAAm)
- تزن خارج PIPAAm لإعداد 10٪ ث / الحل الخامس في بيوتانول. مزيج باستخدام الدوامة حتى حل واضح.
- المجهر قطع بلاستيكية الشرائح إلى ما يقرب من 12 ملم × 12 ملم الساحات إما مع زوج من مقص أو شفرة حادة. بدلا من ذلك استخدام المقصلة.
ملاحظة: هذه الساحات بمثابة حامل للمرشحات في أثناء عملية تدور طلاء. - باستخدام زوج حادة من مقص حافة مستقيمة، وقطع فتحة المسام ميكروفلتر يفر إلى 8 ملم × 8 ملم الساحات.
- باستخدام شريط الفيلم بوليميد تأمين قطع المرشحات على squa البلاستيكالدقة قطع سابقا في الخطوة 1.3. تطبيق هذا الفيلم فقط إلى حافة وركن من مرشح بحيث لا يقل عن 7 مم X 7 ملم من ناحية التصفية يتنافى مع تغطيها الشريط.
يتم وضع توضيحات ممثل ميكروفلتر مجموعة المتابعة لPIPAAm طلاء 8 ملم × 8 ملم ميكروفلتر على 12 ملم × 12 ملم البلاستيك قطع مربعة من شريحة المجهر البلاستيكية: الرقم 2. ويستخدم الشريط بوليميد لتأمين ميكروفلتر في مكان تدور معطف PIPAAm.Reproduced بإذن من المرجع 15. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
- وضع ميكروفلتر التي تم تأمينها في الساحة البلاستيك، على تشوك فراغ تدور المغطي.
- البرنامج تدور المغطي لهذه الوصفة: ابدأ، 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثانية، 6000 صمساء لمدة 60 ثانية، و 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثانية، وإيقاف.
- الاستغناء يكفي 10٪ ث / ت حل PIPAAm (المعد في 1.1) لتغطية كامل سطح ميكروفلتر باستخدام معيار نقل البلاستيك ماصة وبدء المغطي تدور.
- إزالة ميكروفلتر PIPAAm المغلفة من زيادة ونقصان المغطي بعد الانتهاء من عملية الطلاء. ترك مرشح تعلق على الساحة البلاستيك أثناء التخزين.
ملاحظة: يمكن تخزين التصفية المغلفة في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 3 أشهر.
2. جمعية الترشيح كاسيت مع ميكروفلتر PIPAAm المغلفة
- ترطيب PIPAAm ميكروفلتر المغلفة في درجة حرارة الغرفة عن طريق وضع ميكروفلتر لا يزال تأمين على الساحة البلاستيك في طبق بتري. إضافة برنامج تلفزيوني 1X حتى يتم غمر ميكروفلتر تماما واسمحوا الوقوف لمدة 5 دقائق.
- بعد الخطوة الماء، والإفراج عن مرشح من الساحة البلاستيك عن طريق قطع شريط الفيلم بوليميد باستخدام زوج من مقص.
ملاحظة: خذ علما أي جانب من مرشح لديهاطلاء PIPAAm. - تجميع ميكروفلتر إلى الكاسيت والترشيح، والتي يقحم ميكروفلتر بين العلوي والسفلي قطعة الاكريليك مع 2 ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) قطع بمثابه طوقا / الختم. المشبك كاسيت الاكريليك مع لقطات لتأمين مرشح وتوفير ختم ضيق.
ملاحظة: طلاء PIPAAm يجب متجهة لأعلى، حتى يتم تصفية عينة من خلال، سوف يتم القبض على الخلايا على PIPAAm السطح المطلي للمرشح (الشكل 1).
3. الترشيح من عينة الدم مع التقاط والإفراج عن لجنة مكافحة الإرهاب من ميكروفلتر
- حيث أن كل علامة تجارية ضخ حقنة لديه واجهة المستخدم الخاصة به، راجع دليل المستخدم للمضخة وبرنامج ضخ حقنة لتدفق بمعدل 75ML / ساعة وضبط مستوى الصوت إلى 20 مل.
- الحارة 3 مل من وسائل الاعلام (متوفر تجاريا) ثقافة خلية مكوي إلى 37 درجة مئوية (من خلال إضافة 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ البنسلين والستربتوميسين أعدت).
- إضافة 7.5 مل من المتاحة تجاريا هانك في محلول الملح المتوازن (HBSS) إلى 7.5 مل من الدم عينة ونضح هذا الدم المخفف إلى حقنة 25 مل.
ملاحظة: ضبط حجم HBSS بحيث يتم تخفيف عينة من الدم مع حجم مساو من 1: 1 مع HBSS على سبيل المثال إذا تم استخدام 10 مل من الدم، ثم تخلط مع حجم مساو من 10 مل HBSS لتحقيق 1: التخفيف 1. - إشراك كاسيت الترشيح مع حقنة وضعه على ضخ حقنة. وضع أنبوب 50 مل في أسفل لجمع التدفق من خلال وتبدأ المضخة.
ملاحظة: الترشيح يجب أن تأخذ ما يقرب من 10- 12 دقيقة. وسيتم تنفيذ جميع الخطوات الترشيحفي درجة حرارة الغرفة العادية (20-25 درجة مئوية) بما في ذلك خطوة 3.8 - بعد الترشيح اكتمال، فك الارتباط الترشيح كاسيت تدوين الملاحظات الجانب الذي هو أعلى الذي يحتوي على خلايا القبض على السطح المطلي PIPAAm. نضح 1 مل من وسائل الإعلام ثقافة الحارة إلى حقنة جديدة.
- إعادة إشراك كاسيت الترشيح مع حقنة تحتوي على وسائل الإعلام، ولكن في هذه المرة إشراك نهاية الجزء السفلي من الكاسيت بحيث PIPAAm المغلفة سطح مرشح يواجه بعيدا عن حقنة.
ملاحظة: سوف يكون هذا الإفراج عن أي الخلايا التي قد تكون جزءا لا يتجزأ في المسام فتحة من خلال تطبيق التدفق العكسي لطيف. - وضع حقنة مرة أخرى على ضخ حقنة وعقد طبق بتري صغيرة أو لوحة 6 جيدا الحق تحت كاسيت الترشيح. ضبط معدل تدفق إلى 100 مل / ساعة وتبدأ المضخة.
- تمرير جميع وسائل الإعلام من خلال تصفية وجمع من خلال تدفق في طبق بتري. انتظر جميع وسائل الإعلام لتمرير من خلال وثم توقف المضخة وإزالة حقنة لالثانية الترشيح كاسيت من المضخة.
- فك الارتباط بين تلك كاسيت الترشيح من حقنة وفتحه لاسترداد مرشح من الكاسيت. وضع مرشح مع سطح PIPAAm لأسفل في نفس طبق بتري المستخدمة في جمع التدفق العكسي عند الافراج عن الخلايا من المسام. تضاف بقية وسائل الإعلام دافئة ووضع طبق بتري في حاضنة الثقافة وضعت في 37 درجة مئوية.
- بعد 30 دقيقة سوف يتم الافراج عن الخلايا من مرشح. ومع ذلك، ترك مرشح في طبق بتري لمدة تصل إلى 24 ساعة لضمان جميع الخلايا فصل.
ملاحظة: بدلا من ذلك، فإن الخلايا صدر يمكن جمعها في أنبوب microcentrifuge لأداء المزيد من التحليل المصب مثل PCR، ELISA، ويسترن وصمة عار على سبيل المثال لا أمثلة قليلة. - بعد 24 ساعة في الثقافة، وإزالة بعناية ميكروفلتر باستخدام ملقط.
ملاحظة: مرشح يمكن التخلص منها في هذا الوقت حيث تم الافراج عن الخلايا من ذلك. - ماصة بلطف مستنبت صعودا وهبوطا باستخدام 1000 & #181؛ ل ماصة، لاعادة تعليق الكريات الحمراء والطرفية خلية الدم وحيدات النوى (PBMC) أن يتم القبض على مرشح وأفرج عنه في لوحة مع لجنة مكافحة الإرهاب. تنفيذ هذا الإجراء بعناية وبلطف لتجنب فصل الخلايا السرطانية فضفاضة يعلق. إزالة بعناية المتوسط بأكمله يحتوي على إعادة علقت كريات الدم الحمراء وPBMC مخلفا وراءه الخلايا المرفقة للسرطان والبديل مع متوسطة جديدة قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية.
ملاحظة: هذه الخطوة يمكن أن يتكرر مرة واحدة إذا كريات الدم الحمراء المفرطة موجودة بعد غسل واحد.
4. قابلية تقييم لجنة مكافحة الإرهاب
- تقييم لجنة مكافحة الإرهاب الجدوى مثقف باستخدام لايف / الفحص الميت 8.
والعديد من لايف / المقايسات الميت المتاحة تجاريا: ملاحظة. بعد بروتوكول الشركة المصنعة ينصح بشدة. يرجى الرجوع إلى قائمة المواد / الكواشف لعدة فحص التجارية المستخدمة لهذه التجربة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عن طريق الدم المتبرعين الأصحاء "(تم الحصول عليها بموجب بروتوكول المعتمدة من قبل جامعة ميامي IRB 20150020 بعد الموافقة المسبقة) ارتفعت مع الخلايا السرطانية مثقف، وتقنية thermoresponsive من أجل إطلاق سراح قابلة للحياة تعميم الخلايا السرطانية (CTC)، القبض على تحقيقه، وإطلاق سراح وكفاءة استرجاع من 94٪ ± 9٪، 82٪ ± 5٪ و 77٪ ± 5٪ على التوالي (الجدول 1) 15. وعلى سبيل المقارنة، فإن إطلاق واسترجاع كفاءة المرشحات غير المصقول بشكل ملحوظ أقل (7٪ ± 1٪ كفاءة والافراج عن 6٪ ± 1٪ كفاءة الاسترجاع) (الجدولين 1) 15. من أجل تقييم جدوى CTCs صدر من مرشح، ~ وارتفع 1000 SK-BR-3 الخلايا في 7.5 مل من الدم متبرع سليم، وتصفيتها من خلال PIPAAm مرشح فتحة المغلفة وأفرج عنه باستخدام الطريقة الموصوفة أعلاه. أجري لايف / فحص الميت لتقييم قابلية الخلية قبل ارتفاع في الدموبعد الافراج عنهم. وكانت الجدوى ما قبل ارتفاع 98٪ (592 من أصل 602 خلايا تحصى) والجدوى من الخلايا والقبض والإفراج عن الدم كان 95٪ (540 من أصل 567 خلايا تحصى) 15 (الشكل 3A). في موازاة ذلك، الخلايا اعتقلت وأفرج عنه بعد الترشيح من عينة الدم كانت تربيتها في مستنبت 5A مكوي و. واتخذت صورة في يوم 3 ويوم 10. كما هو مبين في الشكل 3B، والخلايا التي صدرت من مرشح لم تبق فقط قابلة للحياة، ولكن توسعت بسرعة في الثقافة، وبالتالي تأسيس لمرحلة ما جدوى الترشيح.
الشكل 1: PIPAAm المغلفة المرشحات فتحة لالتقاط والإصدار تعميم الخلايا السرطانية من الدم (لوحة الأعلى) (A) Brightfield صورة PIPAAm مرشح فتحة المغلفة. (ب) الترشيح من الدم الكامل للقبض على لجنة مكافحة الإرهاب. (ج) رسم تخطيطي للرانه ميكروفلتر كاسيت حيث تقع على، مرشح فتحة PIPAAm المغلفة بين الجزء العلوي والسفلي كاسيت. (أسفل لوحة) (D) تخطيطي لعملية الإفراج استولي عليه لجنة مكافحة الإرهاب من المرشحات فتحة PIPAAm المغلفة. مستنسخة بإذن من المرجع 15. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: القبض على الإصدار والثقافة من الخلايا السرطانية قابلة للحياة خلايا سرطان الثدي (SKBr-3) ارتفعت في أسروا الدم المانحة العادي وأفرج عنه باستخدام ميكروفلتر PIPAAm المغلفة. ظلت خلايا قابلة للحياة بعد الإفراج وتوسعت في الثقافة بسرعة. (أ) فحص لايف ميت تنفيذها على الخلايا التي صدرت من مرشح. وأظهر 95٪ (540 من أصل 567 خلايا تحصى) من الخلايا لتكون قابلة للحياة(الأخضر) بعد الافراج عنهم. وصفت الخلايا الميتة باللون الأحمر. (ب) يوم 3 إلى يوم 10 الثقافة من الخلايا الإفراج عن مرشح فتحة PIPAAm المغلفة. ظلت خلايا قابلة للحياة وتوسعت في الثقافة. شريط مقياس = 100 μm.Reproduced بإذن من المرجع 15. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (4): قياس المسام المعلمات قبل وبعد PIPAAm طلاء الصور Brightfield مرشح فتحة (A) قبل و(ب) مرحلة ما بعد PIPAAm طلاء. وقد انخفض طول (C) المسام بنسبة 7.3٪ ± 2.1٪ بعد أن انخفضت PIPAAm الطلاء والمسام العرض بنسبة 15.3٪ ± 5.6٪ بعد PIPAAm الطلاء. مستنسخة بإذن من المرجع 15.الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تتم إزالة تلويث الكريات الحمر والكريات البيضاء التي كتبها جنتل يغسل تم انتشال ما يقرب من 1000 SKBr-3 خلايا من الدم عن طريق تصفية فتحة PIPAAm المغلفة وكانت مطلية على لوحة 48-جيدا: الرقم 5. (أ) في 16 ساعة في الثقافة، والخلايا SKBr 3 ورم انضمت إلى لوحة الثقافة (الأسهم الخضراء)، في حين أن كريات الدم الحمراء أفكارك وكريات الدم البيضاء واستقر أيضا في الجزء السفلي من لوحة (الأسهم الحمراء). (ب) بعد غسل، وإزالة الخلايا غير ملتصقة، وترك الخلايا السرطانية ملتصقة على لوحة (الأسهم الخضراء). مستنسخة بإذن من المرجع 15. من فضلكانقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: القبض على الإصدار واسترجاع كفاءة PIPAAm فتحة المغلفة المرشحات القبض على كفاءة = أعداد الخلايا القبض على مرشح قبل إطلاق سراح أعداد / خلية ارتفعت في الدم. إطلاق سراح أعداد الخلايا كفاءة = صدر من الأرقام مرشح / خلية القبض على مرشح قبل الافراج عنهم. كفاءة الاسترجاع = أعداد الخلايا أفرج عنه من أرقام مرشح / خلية ارتفعت إلى blood.Reproduced بإذن من المرجع 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عملية التقاط قابلة للحياة رابع كلوريد الكربون من الدم الكامل والإفراج عنهم من ميكروفلتر هي بسيطة نسبيا. لكن بعض النقاط الهامة التي تستحق الذكر. ومن الضروري، كما هو الحال مع كل ثقافة الخلية التي حافظت على حالة معقمة من خلال العملية برمتها. الخطوة الأولى من طلاء فلتر مع PIPAAm أمر بالغ الأهمية، لأنه يقوم على أساس تقنية الافراج عن الخلايا من مرشح على استغلال حرارة خصائص بينية استجابة PIPAAm ل. لضمان تم المغلفة مرشح على نحو فعال، وقياس حجم المسام (عرض وطول المسام فتحة) على مرشح تحت المجهر قبل الطلاء، ثم مرة أخرى قياس طلاء حجم المسام آخر. يجب أن انخفض حجم المسام من 1μm على كل من العرض والطول (الشكل 4). كما ذكرنا، مرشح فتحة أثناء التقاط جنة مكافحة الإرهاب بكفاءة، كما يلتقط بعض الخلايا PBMC كبيرة، لكن هذه الخلايا هي خلايا غير ملتصقة وبالتالي الدوريتتم إزالة نانوغرام خطوة 3.13 من الثقافة تاركا وراءه الخلايا السرطانية ملتصقة (الشكل 5).
قد تكون هناك حاجة إلى إدخال تعديلات طفيفة على بروتوكول إذا أحجام مختلفة من الدم لتتم تصفيته أو في الحالات اللزوجة عالية جدا. كما ورد في البروتوكول، فمن الأهمية بمكان لتمييع الدم 1: 1 مع HBSS. لزوجة الدم تختلف من مريض لآخر، ولكن بالنسبة للجزء الأكبر هذا لن يؤثر على الترشيح. سيكون هناك بعض الحالات عندما اللزوجة عالية جدا أو جلطات كبيرة موجودة، وفي هذه الحالة سوف ضخ حقنة لن تكون قادرة على إجبار الدم من خلال التصفية. ينصح في هذه الحالات إلى توقف ضخ حقنة، فك الارتباط الكاسيت من الحقنة، فتح الجزء العلوي من الكاسيت، ولكن ترك مرشح لا تزال تعلق على الجزء السفلي. والجلطات الدموية الكبيرة تكون مرئية بسهولة على التصفية. ماصة بلطف 1 مل من HBSS على مرشح في حين عقد الكاسيت في آنج طفيفلو السماح للتجلط ليغسل. وبمجرد إزالة الجلطة، أغلق كاسيت، إعادة إشراك لحقنة ويستمر الترشيح.
في حين يجوز المرشحات PIPAAm المغلفة على دفعات، وتخزينها لاستخدامها لاحقا، وجدنا أن العمر الافتراضي لهذه المرشحات المغلفة قبل حوالي 3 أشهر. قد تكون انخفضت القبض والإفراج عن خلايا فعالة ويرجع ذلك جزئيا إلى مهينة PIPAAm مع مرور الوقت.
واحد من العوامل التي تحد من تأسيس ثقافة من المرضى جنة مكافحة الإرهاب سوف تقع في عدد من لجنة مكافحة الإرهاب أن تكون موجودة في عينة الدم. وأعداد قليلة من المرجح أن تجعل القدرة على توسيع الخلايا في غاية الصعوبة إن لم يكن مستحيلا. ومع ذلك، عزل عينة مع انخفاض عدد الخلايا في مناطق ثقافة الصغيرة قد تساعد، كما هو الحال في بئر واحدة من 96 لوحة جيدا بدلا من لوحة 6 جيدا. تحديد وسائل الإعلام والثقافة، أو تعديل وسائل الإعلام المتاحة تجاريا، التي من شأنها توفير البيئة المثلى FOص هذه الخلايا في النمو تحد آخر سوف يتعين التغلب عليها.
وتقدم التحليلات الجزيئية والخلوية للجنة مكافحة الإرهاب معلومات قيمة لتشخيص السرطان ويمكن أن تساعد في محرك الدقة الطب 15. الجدوى من الخلايا التي صدرت من تصفية التقاط هي عنصر أساسي للتنمية نحو القدرة على ثقافة المريض رابع كلوريد الكربون لحساسية المخدرات وفحص الاختبارات. كان من المعروف منذ فترة طويلة أن لجنة مكافحة الإرهاب تميل إلى تختلف عن الورم الرئيسي، وبالتالي ضرورة لعلاج كلا وفقا لذلك. وكمثال على ذلك، Schneeweiss وآخرون. وذكرت أنه في سرطان الثدي النقيلي (MBC)، وملامح المستضد من الأنسجة النقيلي والورم الرئيسي تختلف في ما يصل إلى 20٪ من المرضى. إعادة تقييم علامات التنبؤية، بما في ذلك نمو البشرة البشري مستقبلات عامل 2 التعبير (HER2)، قد يساعد على تحسين العلاج MBC. في حين أخذ العينات الأنسجة الغازية وصعبة لتكرار كثير من الأحيان، وتحليل لجنة مكافحة الإرهاب يتطلب سوى عينة من الدم ويمكن أن توفر وسيلة سهلة لتكرار، في الوقت الحقيقي & #34؛ خزعة السائل نهج "22.
وأهمية كبرى لهذه التقنية تكمن في حقيقة أنه في حين أن العديد من المنصات التي يشيع استخدامها في القبض على رابع كلوريد الكربون والتحليلات تقتصر في التحليلات الجزيئية والخلوية كما هو ضروري لمعالجة العينة تثبيتي، أو يجمد لجنة مكافحة الإرهاب على المنصة. وعلاوة على ذلك، الأنظمة المستندة إلى تقارب، والتي تسمح لالتقاط CTC قابلة للحياة والإفراج عنهم، من المحتمل أن يكون متحيزا باختيار المستضد الهدف (15). بدلا من ذلك، مرشح فتحة مع طلاء PIPAAm يوفر تسمية منبرا حرا هو فعالية وكفاءة في القبض والإفراج عن لجنة مكافحة الإرهاب قابلة للحياة من الدم الكامل. وهذه الطريقة توفر القدرة لمزيد من توصيف لجنة مكافحة الإرهاب قابلة للحياة، بما في ذلك المظهرية خلية واحدة والتحليل الجيني وكذلك فيفو السابقين الثقافة لجنة مكافحة الإرهاب.
يجري العمل حاليا على توظيف هذه التقنية للتطبيقات السريرية. القدرة على نحو فعال ثقافة جنة مكافحة الإرهاب من patienسوف عينات ر يؤدي إلى صياغة أفواج العلاج فعالة على مريض إلى أساس، تكشف عن أهداف دواء جديد، ويؤدي إلى تطوير المعالجة الكيميائية الفعالة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slot Filter | Circulogix Inc. | MSF-01 | Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com) |
| poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) | Ploysciences Inc. | 21458 | Non-Hazardous. Store at room temp. |
| 1-Butanol | Sigma Aldrich | B7906 | Use in well ventilated area |
| Plastic Microscope Slides | Cole-Parmer | 48510-30 | Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square |
| Spin Coater | Specialty Coating Systems | SCS G3 Spin Coater | Instrument |
| Polyimide Tape | Uline | S-7595 | Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com) |
| HBSS- Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Falcon Petri dishes 35 x 10 mm | VWR | 25373-041 | |
| Microfilter Cassette | Circulogix Inc. | FC-01 | Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine |
| Syringe 20 ml | BD Scientific | 302830 | |
| Syringe Pump | KD scientific | 78-0100V | Any syringe pump capable of holding a 25 ml syringe may be used |
| Cellstar 50 ml Centrifuge tube | VWR | 82050-322 | |
| Greiner Bio One 6 well plate | VWR | 89131-688 | Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant |
| SKBR3 Cells | ATCC | HTB-30 | |
| Live Dead Assay | Life Technologies | L3224 | Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work |
| Cell Culture Incubator | VWR | 98000-368 | Any incubator that can be used for cell culture will suffice |
References
- Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N Engl J Med. 351 (8), 781-791 (2004).
- de Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
- Cohen, S. J., Punt, C. J. a, et al. Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).
- Smerage, J. B., Barlow, W. E., et al. Circulating Tumor Cells and Response to Chemotherapy in Metastatic Breast Cancer: SWOG S0500. J. Clin. Oncol. 32 (31), 3483-3490 (2014).
- Mach, A. J., Kim, J. H., Arshi, A., Hur, S. C., Di Carlo, D. Automated cellular sample preparation using a Centrifuge-on-a-Chip. Lab chip. 11 (17), 2827-2834 (2011).
- Ozkumur, E., Shah, A. M., et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Sci. Transl. Med. 5 (179), 179 (2013).
- Nagrath, S., Sequist, L. V., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Hosokawa, M., Kenmotsu, H., et al. Size-Based Isolation of Circulating Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Microcavity Array System. PLoS ONE. 8 (6), (2013).
- Bhagat, A. A. S., Hou, H. W., Li, L. D., Lim, C. T., Han, J. Pinched flow coupled shear-modulated inertial microfluidics for high-throughput rare blood cell separation. Lab on a chip. 11 (11), 1870-1878 (2011).
- Tan, S. J., Lakshmi, R. L., Chen, P., Lim, W. -T., Yobas, L., Lim, C. T. Versatile label free biochip for the detection of circulating tumor cells from peripheral blood in cancer patients. Biosens. Bioelectron. 26 (4), 1701-1705 (2010).
- Vona, G., Sabile, A., et al. Isolation by size of epithelial tumor cells a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulatingtumor cells. Am. J. Pathol. 156 (1), 57-63 (2000).
- Marrinucci, D., Bethel, K., et al. Case study of the morphologic variation of circulating tumor cells. Human pathology. 38 (3), 514-519 (2007).
- Lin, H. K., Zheng, S., et al. Portable filter-based microdevice for detection and characterization of circulating tumor cells. Clin. Cancer Res. 16 (20), 5011-5018 (2010).
- Williams, A., Rawal, S., et al. Clinical translation of a novel microfilter technology Capture, characterization and culture of circulating tumor cells. PHT. , 220-223 (2013).
- Ao, Z., Parasido, E., et al. Thermoresponsive release of viable microfiltrated Circulating Tumor Cells (CTCs) for precision medicine applications. Lab Chip. 15, 4277-4282 (2015).
- Xu, T., Lu, B., Tai, Y. C., Goldkorn, A. A cancer detection platform which measures telomerase activity from live circulating tumor cells captured on a microfilter. Cancer Res. 70 (16), 6420-6426 (2010).
- Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release. J. Control. Release. 11 (1-3), 255-265 (1990).
- Yamada, N., Okano, T., Sakai, H., Karikusa, F., Sawasaki, Y., Sakurai, Y. Thermo-responsive polymeric surfaces; control of attachment and detachment of cultured cells. Die Makromol. Chemie, Rapid Commun. 11 (11), 571-576 (1990).
- Deng, Y., Zhang, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci. Rep. 4, 7499 (2014).
- Hou, S., Zhao, H., et al. Capture and stimulated release of circulating tumor cells on polymer-grafted silicon nanostructures. Adv. Mater. 25 (11), 1547-1551 (2013).
- Xiao, Y., Zhou, H., et al. Effective and selective cell retention and recovery from whole blood by electroactive thin films. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (23), 20804-20811 (2014).
- Wallwiener, M., Hartkopf, A. D., et al. The impact of HER2 phenotype of circulating tumor cells in metastatic breast cancer: a retrospective study in 107 patients. BMC cancer. 15 (1), 403 (2015).
