Summary
Um protocolo para utilizar um poli (N-iso-propilacrilamida) (PIPAAm) microfiltro revestido para captura e libertação eficaz thermoresponsive de células viáveis tumorais circulantes (CTC) é apresentada. Este método permite a captura de CTC de sangue dos pacientes e posterior liberação dos CTC viável para a cultura off-chip jusante, análises e caracterização.
Abstract
Nós demonstramos um método para captura com base tamanho de células de tumor circulantes viável (CTC) a partir de sangue total, juntamente com a libertação destas células a partir de chip para análise e / ou a jusante cultura. A estratégia emprega o uso de um novo Parylene C microfiltro ranhura membrana de poros para capturar CTC e um revestimento de poli (N-iso-propilacrilamida) (PIPAAm) para thermoresponsive libertação viável do CTC capturado. A captura de células vivas é activado, aproveitando a concepção de uma geometria de abertura de poros com dimensões específicas para reduzir a tensão de cisalhamento tipicamente associados com o processo de filtração. Enquanto o microfiltro exibe uma elevada eficiência de captura, a libertação destas células não é trivial. Tipicamente, apenas uma pequena percentagem de células são libertadas quando as técnicas tais como o fluxo reverso ou raspagem célula são utilizados. A forte adesão destas células de cancro epitelial da membrana Parylene C é atribuível à interacção electrostática não específica. Para contrariar thé efeito, aplicou-se o uso de revestimento PIPAAm e exploradas as suas propriedades interfaciais responsivos térmica para libertar as células do filtro. O sangue é filtrado em primeiro lugar, à temperatura ambiente. Abaixo de 32 ° C, PIPAAm é hidrofílica. Depois disso, o filtro é colocado em qualquer meio de cultura ou um tampão mantida a 37 ° C, o que resulta na PIPAAm transformando hidrófobo, e, subsequentemente, libertando as células electrostaticamente ligados.
Introduction
A doença metastática é responsável pela maioria das mortes por câncer. Desenvolvimento de biomarcador de diagnóstico e prognóstico companheiro para metástase é crucial na gestão e tratamento do câncer. As células tumorais em circulação (CTC) desempenham um papel central na disseminação de tumores e metástases. Além disso, sendo facilmente acessível como uma "biópsia líquida" biomarcador, CTC em pacientes com câncer 'sangue periférico tem vindo a aumentar como um "viveiro" para pesquisa com biomarcadores de câncer. CTC têm sido bem validado como um biomarcador prognóstico em várias configurações de câncer, incluindo mama, próstata e cancro colorectal 1-3. No entanto, avanços recentes no campo CTC indicou que a simples enumeração dessas células raras tem utilidade clínica limitada, como demonstrado em ensaios clínicos de intervenção 4. Assim, existe uma necessidade emergente para as tecnologias que permitem a caracterização molecular e funcional do CTC. Atualmente, existem apenas algumas tecnologias que permitem for não-antigénio tendenciosa, captura viável e lançamento do CTC, permitindo robusta 5,6 análise molecular e funcional jusante. A maioria destes dispositivos microfabricados são acoplados às plataformas de microfluidos e, assim, têm um factor limitante na quantidade de sangue que esta pode ser processado, o que varia de 2-4 ml 7-10. CTC são eventos raros em um único tubo de coleta de sangue (7,5 ml), portanto, reduzindo ainda mais a quantidade de sangue que pode ser processado, dificulta enormemente a possibilidade de capturar e isolar estas células de interesse.
Nós desenvolvemos dois tipos de dispositivos microfiltro de membrana Parylene C para a captura de CTC que exploram as diferenças de tamanho entre as células tumorais maiores e as células sanguíneas normais menores 11,12. Temos relatado anteriormente no filtro de poros enumeração rodada e comparou-o com uma plataforma de aprovado pela FDA, onde o micro filtro mostrou-se superior em CTC eficiência de capturapara amostras de cancro do sangue do paciente 13,14. No entanto, uma limitação do filtro redondo é a necessidade de usar um fixador à base de formaldeído antes da filtração. Este processo preserva a morfologia de células, permitindo-lhes resistir a tensão de cisalhamento e a pressão durante o processo de filtração. Enquanto enumeração e estudos moleculares podem ser realizados no chip 13, o fixador prejudica a capacidade de realizar uma caracterização funcional. Para resolver esta limitação, foi desenvolvido um filtro de poro de ranhura que nega a necessidade de fixar as células antes da filtração (Figura 1). A geometria da ranhura de poro (6 uM de largura x 40 ^ m de entalhe comprimento poros) permite que as células tumor a ser capturado quando a oclusão apenas parcialmente uma poro e, portanto, ainda permitindo a passagem livre para outras células de sangue e aliviar o aumento da pressão, que poderia levar a danos nas células e eventual rebentamento 15,16 O cartucho de slot de poros é composto por 2 peças de acrílico que sandwicho filtro de entalhe de poro entre a parte superior e na parte inferior com polidimetilsiloxano (PDMS), que actua como um vedante para proporcionar uma vedação à prova de fugas 14,15 (Figura 1).
Embora a eficiência da captação do filtro de entalhe de poro é alta, (Tabela 1), o CTC capturado estão ligadas à membrana Parylene C por fortes interacções electrostáticas não-específicos, em vez de matriz extracelular (ECM) 15 adesão mediada. Métodos tais como o fluxo inverso ou a utilização de raspadores de células não conseguem libertar eficazmente as células do filtro, ou resultar em danos celulares e a morte celular. Nós exploramos um uso não convencional de PIPAAm para formular uma estratégia de liberação 15. PIPAAm é um polímero que sofre uma transição de fase reversível temperatura crítica inferior de solução (TCIS), a uma temperatura de solução de 32 ° C 17. Tradicionalmente, esta propriedade de PIPAAm tem sido amplamente explorada para aplicações de engenharia de tecidos. Tipicamente, as células sãosuperfícies cultivadas em PIPAAm revestidos a 37 ° C quando PIPAAm é hidrofóbico. As células podem então ser separado como uma folha, quando a temperatura da cultura é deslocada para abaixo de 32 ° C, onde a superfície revestida PIPAAm torna-se hidratado 17,18. Nós explorou essa propriedade térmica através da realização do processo de filtração à temperatura ambiente (inferior a 32 ° C) e, em seguida, permitindo libertação de células, colocando o filtro em meios de cultura mantida a 37 ° C. A esta temperatura, a camada de polímero se torna hidrofóbica PIPAAm, libertando assim a células electrostaticamente ligados 15 (Figura 1).
Embora o método sensível à temperatura, bem como outros métodos têm sido aplicadas com sucesso para atingir captação CTC viável e libertar 19-21, uma desvantagem potencial chave partilhada por estas tecnologias relatados é que todos eles empregam um princípio dependente de antigénio para a captura do CTC. Antigen baseada captura de CTC, p, como mostradoreviously, pode levar a tendenciosa análise 11,14 CTC. Por exemplo, muitas tecnologias baseadas em afinidade empregar anticorpo que se liga EpCAM para a captura do CTC. No entanto, tem sido demonstrado CTC para expressar vários níveis de EpCAM, levando a omissão de EpCAM e EpCAM baixo CTC negativa por estas tecnologias. Além disso, as limitações podem ocorrer quando CTC de origem não epitelial é de interesse, tais como CTC em ambientes de melanoma e sarcoma. Assim, uma tecnologia que permite a captura viável CTC e liberação sem potencial viés introduzido por captura com base antígeno é altamente desejável.
Importantemente, o dispositivo de captura é puramente microfiltro dimensionada com base e a estratégia de liberação é agnóstico à presença de certos marcadores de superfície. Acreditamos que o emprego do microfiltro revestido PIPAAm vai ajudar a expandir a nossa compreensão do processo metastático, através do fornecimento a capacidade de capturar e liberar CTC para as análises a jusante de forma eficaz e eficiente. Isto pode potenteei ra me expor novas moléculas para as quais novas terapias direcionadas sistêmicas pode ser dirigidas, bem como fornecer um biomarcador que pode ser monitorado de forma fácil e ajuda na gestão do paciente com câncer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Declaração de Ética: Para proteger os direitos dos seres humanos, amostras de sangue foram obtidas na sequência de um consentimento informado ao abrigo de protocolos aprovados pela Universidade de Miami conselhos de revisão institucional sob IRB 20.150.020.
NOTA: Sangue a ser filtrada para captura de CTC deve ser coletado em um tubo de EDTA para impedir a coagulação.
1. Revestimento do microfiltro com poli (N-iso-propilacrilamida) (PIPAAm)
- Pesar PIPAAm para preparar uma solução a 10% w / v em butanol. Misturar utilizando um vortex até a solução ficar clara.
- microscópio de corte de plástico desliza em cerca de 12 mm x 12 mm quadrados ou com uma tesoura ou lâmina afiada. Como alternativa, use uma guilhotina.
NOTA: Estes quadrados irá servir como um suporte para os filtros, durante o processo de revestimento por centrifugação. - Usando uma tesoura afiada borda reta, cortar o slot poros microfiltro wafer em 8 milímetros x 8 quadrados mm.
- Utilizando uma fita de filme de poliimida proteger os filtros de corte na Squa plásticores previamente cortado no passo 1.3. Aplicar a película apenas para a borda e o canto do filtro de modo a que pelo menos, 7 mm x 7 mm de área de filtragem é un-coberta pela fita.
Figura 2:. Ilustração Representante da Microfilter Set-up para PIPAAm Coating 8 mm x 8 milímetros micro-filtro é posicionado sobre o 12 mm x 12 mm plástico corte quadrado de uma lâmina de microscópio de plástico. Poliimida fita é usada para fixar o micro-filtro no lugar para girar o revestimento do PIPAAm.Reproduced com a permissão de referência 15. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Coloque o micro-filtro que é garantido na praça de plástico, para o mandril de vácuo do spin-coater.
- Programar o spin-coater com a seguinte receita: Iniciar, 500 rpm por 10 segundos, 6.000 rpm para 60 seg, 500 rpm por 10 segundos, em Parar.
- Dispensar suficiente 10% w / v solução PIPAAm (preparado em 1.1) para cobrir completamente a superfície do microfiltro usando uma pipeta de transferência de plástico padrão e iniciar o revestidor de rotação.
- Remover o microfiltro PIPAAm revestido do spin-coater após o processo de revestimento está concluído. Deixe o filtro ligado ao quadrado de plástico durante o armazenamento.
NOTA: O revestido-filtro pode ser armazenado à temperatura ambiente durante até 3 meses.
2. Montagem de Filtração cassete com Microfilter PIPAAm Revestido
- Rehidratar PIPAAm microfiltro revestidos à temperatura ambiente colocando o micro-filtro ainda fixada ao quadrado de plástico para uma placa de Petri. Adicionar 1x PBS até que o micro-filtro está totalmente submersa e deixe descansar por 5 min.
- Após o passo de hidratação, libertar o filtro do quadrado de plástico cortando a fita de película de poliimida usando um par de tesoura.
NOTA: Tome nota de que lado do filtro temo revestimento PIPAAm. - Montar o micro filtro na cassete de filtração, imprensando o microfiltro entre a peça de acrílico superior e inferior, juntamente com as peças 2 polidimetilsiloxano (PDMS) atuando como uma junta / vedação. Fixar o cassete de acrílico com grampos para fixar o filtro e fornecer um selo apertado.
NOTA: O revestimento PIPAAm deve ser virada para cima, de modo que a amostra é filtrada através de, as células serão capturados no PIPAAm superfície revestida do filtro (Figura 1).
3. A filtração da amostra de sangue com a captura e libertação de CTC do Microfilter
- Como cada marca bomba de seringa tem sua própria interface de usuário, consulte o manual do usuário da bomba e programar a bomba de seringa a fluir a uma taxa de 75 ml / hr e ajustar o volume para 20 ml.
- Aqueça 3 ml de meio (disponível comercialmente) de cultura de células de McCoy (preparada por adição de 10% de Soro fetal bovino e 1% de penicilina e estreptomicina) a 37 ° C.
- Adicionar 7,5 mL de Solução Salina Equilibrada de Hank comercialmente disponível (HBSS) à amostra 7,5 ml de sangue e aspire o sangue diluído em uma seringa de 25 ml.
NOTA: Ajustar o volume de HBSS a fim de que a amostra de sangue é diluída com igual volume de 1: 1 com HBSS Por exemplo, se 10 ml de sangue é usado, em seguida misturar com um volume igual de 10 ml de HBSS para atingir o 1:. Diluição 1. - Envolver a cassete de filtração com a seringa e coloque-a na bomba de seringa. Coloque um tubo de 50 ml, no fundo, para recolher o fluxo através de e ligar a bomba.
NOTA: A filtração deve levar cerca de 10 a 12 min. Todas as etapas de filtração devem ser executadasà temperatura ambiente normal (20-25 ° C), incluindo a etapa 3.8 - Após a filtração é completa, desengatar a tomar nota cassete filtração qual lado é o topo que tem as células capturadas na superfície PIPAAm-revestido. Aspirar 1 ml de meio de cultura quente para uma nova seringa.
- Re-engatar a cassete de filtração com a seringa que contém os meios de comunicação, mas, desta vez se engatar na extremidade inferior da cassete de forma a que o PIPAAm revestidos na superfície do filtro está virada para fora da seringa.
NOTA: Esta será a liberar quaisquer células que podem ser incorporados nos poros de fenda através da aplicação de fluxo reverso suave. - Coloque a seringa de volta para a bomba de seringa e mantenha uma pequena placa de Petri ou placa de 6 poços direito sob a cassete de filtração. Definir a taxa de fluxo de 100 ml / hr e ligar a bomba.
- Passe todos os meios de comunicação através do filtro e recolher o flow-through na placa de Petri. Aguarde até que todos os meios de comunicação para passar e, em seguida, parar a bomba e retire a seringa umND cassete de filtração a partir da bomba.
- Desengatar a cassete de filtração a partir da seringa e abri-lo para recuperar o filtro a partir da cassete. Colocar o filtro com a superfície da PIPAAm virado para baixo na mesma placa de Petri utilizada para recolher o fluxo inverso ao liberar as células dos poros. Adicionar o resto dos meios de comunicação quentes e colocar a placa de petri em uma incubadora de cultura ajustado a 37 ° C.
- Depois de 30 minutos todas as células irão ser libertados a partir do filtro. No entanto, deixar de filtro na caixa de Petri durante 24 horas para assegurar que todas as células separar.
NOTA: Como alternativa, as células libertadas pode ser recolhido para um tubo de microcentrífuga para efectuar mais análises a jusante, tais como PCR, ELISA, Western Blot para nomear alguns exemplos. - Depois de 24 horas em cultura, remova cuidadosamente o micro filtro usando uma pinça.
NOTA: O filtro pode ser descartada neste momento, como as células foram liberados a partir dele. - Pipeta suavemente o meio de cultura para cima e para baixo, usando um 1000 & #181; l pipeta, para voltar a suspender os eritrócitos e células mononucleares do sangue periférico (PBMC) que são capturados no filtro e liberado para a placa com o CTC. Executar essa ação com cuidado e com cuidado para não separar as células cancerosas fracamente ligados. Remova cuidadosamente o meio inteiro contendo os eritrócitos ressuspensas e PBMC, deixando para trás as células cancerosas em anexo e substituir com meio fresco pré-aquecido a 37 ° C.
NOTA: Este passo pode ser repetido uma vez se eritrócitos excessivas estão presentes após uma lavagem.
4. Avaliação Viabilidade CTC
- Avaliar a viabilidade CTC cultivadas utilizando um / Dead Ensaio Live 8.
Observação: Vários ensaios Vivo / Morto estão disponíveis comercialmente. Seguindo o protocolo do fabricante é altamente recomendado. Por favor, consulte a lista de materiais / reagentes para o kit de ensaio comercial utilizado para esta experiência.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Usando sangue de dadores saudáveis (obtido no âmbito de um protocolo aprovado pela Universidade de Miami IRB 20.150.020 sequência de um consentimento informado) enriquecida com células cancerígenas cultivadas, a técnica thermoresponsive para a liberação de células viáveis circulantes do tumor (CTC), a captura alcançado, liberação e eficiência na recuperação de 94% ± 9%, 82% ± 5% e 77% ± 5%, respectivamente (Tabela 1) 15. Por comparação, a eficiência de recuperação de libertação e de filtros não revestidos foram significativamente inferiores (7% ± 1% de eficiência de libertação e 6% ± 1% de eficiência de recuperação) (Tabelas 1) 15. A fim de avaliar a viabilidade da CTC libertados a partir do filtro, ~ 1.000 células SK-BR-3 foram misturados em 7,5 ml de sangue de dadores saudáveis, filtrada através de filtro de entalhe a PIPAAm revestida e libertada utilizando o método descrito acima. Um ensaio Live / Morto foi realizada para avaliar a viabilidade celular antes de pico em sanguee após o lançamento. A viabilidade pré-pico foi de 98% (592 de 602) células contadas e a viabilidade das células capturadas e libertadas a partir de sangue foi de 95% (540 567 células contadas para fora) 15 (Figura 3A). Em paralelo, as células capturado e libertado pós-filtração a partir da amostra de sangue foram cultivadas em meio de cultura de McCoy 5A. As imagens foram recolhidas no dia 3 e o dia 10. Tal como mostrado na Figura 3B, as células libertadas a partir do filtro, não só permaneceram viáveis, mas expandiu-se rapidamente em cultura, estabelecendo, assim, a sua viabilidade pós filtração.
Figura 1:. PIPAAm Revestido de Slot Filtros de captura e liberação de circulação células tumorais de Sangue (painel superior) (A) imagem Brightfield de PIPAAm filtro de entalhe revestido; (B) filtração do sangue total para a captura de CTC. (C) Esquema de tele microfiltro cassete onde a, filtro de entalhe PIPAAm revestido é colocado entre a parte superior e inferior da cassete. (Painel inferior) (D) Esquema do processo para liberar capturado CTC de filtros de entalhe PIPAAm revestidos. Reproduzido com permissão de referência 15. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Cancro da mama células Capture, lançamento e Cultura de células tumorais viáveis (SKBR-3) cravado no sangue dador normal foram capturados e libertados usando um microfiltro PIPAAm revestido: Figura 3.. As células permaneceram liberação pós viável e expandidas em cultura rapidamente. (A) ensaio de Vivo-morto realizada nas células libertadas a partir do filtro. 95% (540 de 567 células contadas) das células mostrou-se viável(Verde) após o lançamento. As células mortas são rotulados em vermelho. (B) o dia 3 até ao dia 10 de cultura das células libertadas a partir de filtro de entalhe PIPAAm revestido. As células permaneceram viáveis e expandidas em cultura. Barra de escala = 100 μm.Reproduced com a permissão de referência 15. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Medida da poro Parâmetros pré- e pós-PIPAAm revestimento imagens de campo claro de filtro ranhura (a) antes e (B) de revestimento pós-PIPAAm.. Comprimento (C) do poro foi reduzida de 7,3% ± 2,1% após a largura do revestimento e dos poros PIPAAm foi reduzida de 15,3% ± 5,6% após o revestimento PIPAAm. Reproduzido com permissão de referência 15.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Contaminando eritrócitos e leucócitos são removidos por lavagens delicadas de aproximadamente 1000 células SKBR-3 foram recuperadas a partir do sangue pelo filtro de entalhe PIPAAm revestido e foram plaqueadas numa placa de 48 poços.. (A) a 16 h em cultura, as células tumorais SKBR-3 aderidas a placas de cultura (setas verdes), enquanto que os eritrócitos e os leucócitos também apoptóticas estavam se na parte inferior da placa (setas vermelhas). (B) Pós-lavagem, as células não aderentes foram removidas, deixando as células tumorais aderentes sobre a placa (setas verdes). Reproduzido com permissão de referência 15. Por favor,clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1:. Capture, lançamento e Recuperação Eficiência de PIPAAm entalhe Revestido filtros de captura de eficiência = número de células capturadas em filtro antes de números de liberação / celulares cravado em sangue. Solte eficiência = número de células libertadas a partir dos números de filtro / celulares capturados no filtro antes do lançamento. A eficiência de recuperação = número de células libertadas de números de filtro / celulares cravado em blood.Reproduced com a permissão de referência 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O processo de captura CTC viável do sangue total e liberando-os do microfiltro é relativamente simples; no entanto alguns pontos críticos são dignos de menção. É imperativo, como com toda a cultura de células que uma condição estéril é mantido através de todo o processo. O passo inicial de revestimento do filtro com PIPAAm é crítico, como a base para a técnica de libertar as células do filtro se baseia na exploração de temperatura propriedades interfaciais responsivos do PIPAAm. Para assegurar o filtro foi revestida de forma eficaz, medir o tamanho de um poro (largura e comprimento de uma ranhura de poro) no filtro sob um microscópio antes do revestimento e, em seguida, novamente medir um revestimento de pós de tamanho de poro. O tamanho dos poros deve ser diminuída por 1 uM, tanto a largura e o comprimento (Figura 4). Como mencionado, o filtro de entalhe durante a captura CTC eficiente, também captura algumas grandes células PBMC, no entanto, estas células são células não-aderentes e, assim, duri3,13 ng passo são removidos da cultura deixando para trás as células cancerosas aderentes (Figura 5).
Pequenas modificações no protocolo pode ser necessária se diferentes volumes de sangue devem ser filtrada ou nos casos em que a viscosidade é extremamente elevado. Como mencionado no protocolo, é crítico para diluir o sangue 1: 1 com HBSS. A viscosidade do sangue varia de paciente para paciente, no entanto, para a maior parte, isto não afectará a filtração. Haverá certos casos, quando a viscosidade é demasiado elevada ou grandes coágulos estão presentes, caso em que a bomba de seringa não será capaz de forçar o sangue através do filtro. Aconselha-se nestes casos para parar a bomba de seringa, desengatar a cassete da seringa, abrir a parte superior da cassete, mas deixe o filtro ainda ligado à parte inferior. Grandes coágulos de sangue será facilmente visível no filtro. Gentilmente pipeta 1 ml de HBSS para o filtro enquanto segura a cassete com uma ligeira angle para permitir que o coágulo de lavar. Uma vez que o coágulo foi removido, fechar a gaveta, re-acoplar-a na seringa e continuar filtração.
Enquanto os filtros PIPAAm revestidos podem ser feitos em lotes e armazenada para uso posterior, verificou-se que a vida útil destes filtros de pré-revestimento é cerca de 3 meses. A captura e libertação das células eficaz pode ser diminuída em parte devido ao degradante PIPAAm ao longo do tempo.
Um dos factores limitadores para estabelecer uma cultura de paciente CTC está na quantidade de CTC que estão presentes na amostra de sangue. Números baixos, provavelmente, fazer a capacidade de expandir as células extremamente difícil, se não impossível. No entanto, sequestrando uma amostra com contagens de células baixas em áreas de cultivo menores podem ajudar, tal como num único poço de placa de 96 cavidades em vez de uma placa de 6 poços. A identificação dos meios de cultura, ou a modificação de meios disponíveis comercialmente, que irá fornecer o ambiente ideal for essas células para crescer é outro desafio que terão de ser superados.
Análises moleculares e celulares da CTC fornecer informações valiosas para o prognóstico do câncer e pode ajudar a precisão unidade medicina 15. A viabilidade das células liberadas do filtro de captura é um desenvolvimento chave para a capacidade de cultura paciente CTC para testes de sensibilidade de drogas e de triagem. tem sido desde há muito conhecido que CTC tendem a ser diferentes a partir do tumor primário e, assim, a necessidade de tratar tanto em conformidade. Como um exemplo, Schneeweiss et ai. relataram que no cancro da mama metastático (MBC), perfis de antigénio de tecido metastático do tumor primário e diferem em até 20% dos pacientes. Reavaliação dos marcadores preditivos, incluindo o receptor do factor de crescimento epidérmico humano 2 expressão (HER2), pode ajudar a otimizar o tratamento MBC. Enquanto amostragem de tecido é invasivo e muitas vezes difícil de repetir, a análise CTC requer apenas uma amostra de sangue e pode proporcionar uma fácil de repetir, em tempo real & #34; "abordagem biópsia líquida 22.
Um grande importância da técnica reside no facto de que, embora várias plataformas comumente usado na captura do CTC e análises são limitadas em análises moleculares e celulares como um fixador é necessária para o processamento da amostra, ou o CTC são imobilizados na plataforma. Além disso, os sistemas à base de afinidade, que permitem a captura e libertação CTC viável, pode, potencialmente, ser influenciado pela escolha do antigénio alvo 15. Alternativamente, o filtro de entalhe com o revestimento PIPAAm fornece uma plataforma livre rótulo que é eficaz e eficiente na captura e liberação de CTC viável a partir de sangue total. Este método proporciona a capacidade para a caracterização adicional do CTC viável, incluindo fenotípica celular única e a análise genómica, bem como ex vivo, a cultura do CTC.
Trabalho está em andamento para utilizar esta tecnologia para aplicações clínicas. A capacidade de efetivamente cultura CTC a partir patienamostras t levará a formulação de regimentos terapia eficaz em um paciente para paciente base, revelar novos alvos de drogas, e levar ao desenvolvimento de quimioterápicos eficazes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slot Filter | Circulogix Inc. | MSF-01 | Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com) |
| poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) | Ploysciences Inc. | 21458 | Non-Hazardous. Store at room temp. |
| 1-Butanol | Sigma Aldrich | B7906 | Use in well ventilated area |
| Plastic Microscope Slides | Cole-Parmer | 48510-30 | Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square |
| Spin Coater | Specialty Coating Systems | SCS G3 Spin Coater | Instrument |
| Polyimide Tape | Uline | S-7595 | Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com) |
| HBSS- Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Falcon Petri dishes 35 x 10 mm | VWR | 25373-041 | |
| Microfilter Cassette | Circulogix Inc. | FC-01 | Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine |
| Syringe 20 ml | BD Scientific | 302830 | |
| Syringe Pump | KD scientific | 78-0100V | Any syringe pump capable of holding a 25 ml syringe may be used |
| Cellstar 50 ml Centrifuge tube | VWR | 82050-322 | |
| Greiner Bio One 6 well plate | VWR | 89131-688 | Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant |
| SKBR3 Cells | ATCC | HTB-30 | |
| Live Dead Assay | Life Technologies | L3224 | Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work |
| Cell Culture Incubator | VWR | 98000-368 | Any incubator that can be used for cell culture will suffice |
References
- Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N Engl J Med. 351 (8), 781-791 (2004).
- de Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
- Cohen, S. J., Punt, C. J. a, et al. Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).
- Smerage, J. B., Barlow, W. E., et al. Circulating Tumor Cells and Response to Chemotherapy in Metastatic Breast Cancer: SWOG S0500. J. Clin. Oncol. 32 (31), 3483-3490 (2014).
- Mach, A. J., Kim, J. H., Arshi, A., Hur, S. C., Di Carlo, D. Automated cellular sample preparation using a Centrifuge-on-a-Chip. Lab chip. 11 (17), 2827-2834 (2011).
- Ozkumur, E., Shah, A. M., et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Sci. Transl. Med. 5 (179), 179 (2013).
- Nagrath, S., Sequist, L. V., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Hosokawa, M., Kenmotsu, H., et al. Size-Based Isolation of Circulating Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Microcavity Array System. PLoS ONE. 8 (6), (2013).
- Bhagat, A. A. S., Hou, H. W., Li, L. D., Lim, C. T., Han, J. Pinched flow coupled shear-modulated inertial microfluidics for high-throughput rare blood cell separation. Lab on a chip. 11 (11), 1870-1878 (2011).
- Tan, S. J., Lakshmi, R. L., Chen, P., Lim, W. -T., Yobas, L., Lim, C. T. Versatile label free biochip for the detection of circulating tumor cells from peripheral blood in cancer patients. Biosens. Bioelectron. 26 (4), 1701-1705 (2010).
- Vona, G., Sabile, A., et al. Isolation by size of epithelial tumor cells a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulatingtumor cells. Am. J. Pathol. 156 (1), 57-63 (2000).
- Marrinucci, D., Bethel, K., et al. Case study of the morphologic variation of circulating tumor cells. Human pathology. 38 (3), 514-519 (2007).
- Lin, H. K., Zheng, S., et al. Portable filter-based microdevice for detection and characterization of circulating tumor cells. Clin. Cancer Res. 16 (20), 5011-5018 (2010).
- Williams, A., Rawal, S., et al. Clinical translation of a novel microfilter technology Capture, characterization and culture of circulating tumor cells. PHT. , 220-223 (2013).
- Ao, Z., Parasido, E., et al. Thermoresponsive release of viable microfiltrated Circulating Tumor Cells (CTCs) for precision medicine applications. Lab Chip. 15, 4277-4282 (2015).
- Xu, T., Lu, B., Tai, Y. C., Goldkorn, A. A cancer detection platform which measures telomerase activity from live circulating tumor cells captured on a microfilter. Cancer Res. 70 (16), 6420-6426 (2010).
- Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release. J. Control. Release. 11 (1-3), 255-265 (1990).
- Yamada, N., Okano, T., Sakai, H., Karikusa, F., Sawasaki, Y., Sakurai, Y. Thermo-responsive polymeric surfaces; control of attachment and detachment of cultured cells. Die Makromol. Chemie, Rapid Commun. 11 (11), 571-576 (1990).
- Deng, Y., Zhang, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci. Rep. 4, 7499 (2014).
- Hou, S., Zhao, H., et al. Capture and stimulated release of circulating tumor cells on polymer-grafted silicon nanostructures. Adv. Mater. 25 (11), 1547-1551 (2013).
- Xiao, Y., Zhou, H., et al. Effective and selective cell retention and recovery from whole blood by electroactive thin films. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (23), 20804-20811 (2014).
- Wallwiener, M., Hartkopf, A. D., et al. The impact of HER2 phenotype of circulating tumor cells in metastatic breast cancer: a retrospective study in 107 patients. BMC cancer. 15 (1), 403 (2015).
