Summary
Protokol, bir poli (N-ISO-propylacrylamide) etkili bir yakalama ve canlı dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC) arasında thermoresponsive salınması için (PIPAAm) kaplanmış mikro filtre sunulmaktadır kullanılması. Bu yöntem analizleri ve karakterizasyonu, aşağı off-çip kültürü için hastaların kan ve canlı CTC sonraki sürümünden CTC yakalanmasını sağlar.
Abstract
Bu alt-analiz ve / veya kültür için yonga bu hücrelerin serbest bırakılması ile birlikte, bütün kandan canlı dolaşımdaki tümör hücresi (CTC) boyutu esas yakalanması için bir yöntem ortaya koymaktadır. Strateji CTC ve yakalanan CTC thermoresponsive uygulanabilir serbest bırakılması için bir poli kaplama (N-ISO-propylacrylamide) (PIPAAm) yakalamak için yeni bir Parylene C membran yuvası gözenek mikrofiltre kullanımını kullanır. Canlı hücrelerin yakalama tipik filtrasyon işlemi ile ilgili makaslama stresi azaltmak belirli boyutlara sahip bir yuva gözenek geometrisi tasarımı yararlanarak etkindir. mikrofiltre yüksek yakalama verimliliği sergiler iken, bu hücrelerin serbest bırakma olmayan saçmadır. örneğin ters akım ya da hücre kazıma gibi teknikler kullanıldığında, genellikle, hücrelerin sadece küçük bir yüzdesi serbest bırakılır. Parylene Cı membrana bu epitelyal kanser hücrelerinin güçlü yapışma spesifik olmayan elektrostatik etkileşim atfedilebilir. th önlem olaraketkisi, biz PIPAAm kaplamanın kullanılması istihdam ve filtre hücreleri serbest bırakmak için termal duyarlı arayüz özelliklerinin kullandı. Kan önce oda sıcaklığında süzülür. 32 ° C'nin altında, PIPAAm hidrofiliktir. Bundan sonra, filtre, kültür ortamı ya da hidrofobik getirilmesi ve daha sonra elektro statik olarak bağlanmış hücreleri serbest PIPAAm sonuçlanır 37 ° C'de muhafaza edilen bir tampon ya yerleştirilir.
Introduction
Metastatik hastalık çoğu kanser ölümlerinin sorumludur. metastaz prognostik ve arkadaşı teşhis biyomarker gelişmekte kanser ve tedavisinde çok önemlidir. Dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC), tümör yayılması ve metastazında bir rol oynar. Ayrıca, 'sıvı biyopsi' belirteç olarak kolay erişilebilir olması, kanser hastalarının içinde CTC kanser biyomarkır araştırma yuva 'periferik kan bir şekilde artmaktadır.' 3 - CTC iyi meme, prostat ve kolorektal kanser 1 dahil olmak üzere çeşitli kanser ayarları prognostik belirteç olarak onaylanmıştır. Ancak, CTC alanındaki son gelişmeler girişimsel klinik çalışmalarda 4'te gösterildiği gibi bu nadir hücrelerin sadece numaralandırma, klinik yarar sınırlı olduğunu belirtti. Bu nedenle, CTC moleküler ve fonksiyonel karakterizasyon için izin teknolojileri için gelişmekte olan bir ihtiyaç vardır. Şu anda, sadece birkaç teknolojileri fo izin veren mevcutr olmayan antijen önyargılı, canlı yakalama ve CTC serbest bırakılması, sağlam aşağı moleküler ve fonksiyonel analiz 5,6 sağlayarak. Bu mikrofabrike cihaz çoğunluğu mikroakışkan platformlara birleştirilebilir ve bu şekilde 2-4 mi 7 arasında olduğu, işlenebilir kan miktarının, sınırlayıcı bir faktör sahiptir - 10. CTC büyük yakalama ve ilgi bu hücrelerin izole edilmesi olasılığını engeller, bu nedenle daha da işlenebilir kan miktarını azaltarak, kan alımı (7.5 mi) tek bir tüp içinde nadirdir.
Biz büyük tümör hücreleri ve daha küçük normal kan hücrelerinin 11,12 arasında boyut farklılıkları istismar CTC yakalanması için Parylene C membran mikrofiltre cihazları iki tür geliştirdik. Biz daha önce yuvarlak gözenek numaralandırma filtre bildirdi ve mikrofiltre CTC yakalama verimliliği üstün olduğu gösterilmiştir, bir FDA onaylı bir platform ile karşılaştırdık varkanser hastası kan numunelerinin 13,14 için. Ancak, yuvarlak filtre bir sınırlama filtrasyon öncesinde formaldehit esaslı fiksatif kullanmak için bir gerekliliktir. Bu süreç, filtreleme işlemi sırasında kesme stresi ve basınca dayanacak şekilde izin verirken hücre morfolojisi muhafaza eder. Sayım ve moleküler çalışmalar on-chip 13 yapılabilir iken, fiksatif fonksiyonel karakterizasyonu gerçekleştirmek için yeteneğini bozar. Bu sınırlama gidermek için, biz filtrasyon öncesinde hücreler (Şekil 1) düzeltmek için gerekliliğini ortadan bir yarık gözenek filtresi geliştirdi. yuva gözenek geometrisi (6 mikron genişlik x 40 mm uzunluk yuvası gözenekler) sadece kısmen hala diğer kan hücreleri için serbest geçiş izin ve hücre hasarına yol açacak basınç artışı hafifletilmesi böylece gözenek kapatılmasıy ve süre tümör hücrelerinin yakalanmasını sağlar ve nihai patlama 15,16 yuvası gözenek kartuş hangi sandviç 2 akrilik parçadan oluşmaktadırBir conta olarak polidimetilsiloksan (PDMS) oyunculuk ile üst ve alt parça arasında yuva gözenek filtresi bir sızıntı geçirmez conta 14,15 (Şekil 1) temin etmek.
Yuva gözenekli filtre yakalama verimliliği yüksek olsa da, (Tablo 1), çekilen CTC yerine yapışma 15 aracılı hücre dışı matrisin (ECM) güçlü özel olmayan elektrostatik etkileşimlerle Parylene Cı zara bağlıdır. örneğin ters akım veya hücre kazıyıcı kullanımı gibi yöntemler etkili filtreden hücreleri serbest ya da hücre hasarı ve hücre ölümüne neden başarısız. Biz bir salım stratejisi 15 formüle PIPAAm bir sıradışı kullanım araştırdı. PIPAAm 32 ° C'lik bir solüsyon ısısına C17 bir geri düşük kritik çözelti sıcaklığı (LCST'nin) faz geçişine maruz kalan bir polimerdir. Geleneksel olarak, PIPAAm bu özellik yaygın doku mühendisliği uygulamaları için incelenmiştir. Tipik olarak, hücrelerPIPAAm kültüre PIPAAm hidrofobik olduğu zaman, 37 ° C'de yüzeyleri kaplama. Kültür sıcaklığı PIPAAm kaplı yüzey hidratlanmış 17,18 olur 32 ° C'nin altında kaydırılır, hücreler daha sonra bir tabaka olarak ayrılabilir. Bu, oda sıcaklığına (32 ° C) bir filtrasyon işlemi gerçekleştirerek ve daha sonra 37 ° C'de muhafaza kültür ortamı filtre yerleştirilerek hücre serbest sağlayarak bu termal özelliği kullandı. Bu sıcaklıkta, PIPAAm polimer tabakası ve böylece elektro statik olarak bağlanmış hücreleri 15 (Şekil 1), serbest bırakma, hidrofobik hale gelir.
Sıcaklığa duyarlı bir yöntem yanı sıra diğer yöntemler başarılı 19 uygun bir CTC yakalama elde etmek ve serbest bırakmak için uygulanmıştır, ancak - bildirilen bu teknolojilerin tarafından paylaşılan 21, bir anahtar muhtemel bir mahsur da hepsi CTC yakalama için bir antijene bağımlı ilkesi uygulanır olmasıdır. Antijen temelli CTC yakalama, gösterildiği gibi previously, önyargılı CTC analiz 11,14 yol açabilir. Örneğin, çok sayıda afinite bazlı teknolojileri CTC yakalama EpCAM bağlanan antikor kullanır. Bununla birlikte, CTC, bu teknolojilerin EpCAM, düşük ve EpCAM negatif CTC ihmal yol EpCAM çeşitli düzeylerde eksprese gösterilmiştir. non-epitelyal kökenli CTC melanom ve sarkom ayarlarında gibi CTC gibi ilgi göstermektedir Ayrıca, sınırlamalar meydana gelebilir. Böylece, antijen bazlı yakalama tarafından tanıtıldı potansiyel önyargı olmadan yaşayabilir CTC yakalama ve serbest bırakılması için olanak sağlayan bir teknolojidir arzu edilmektedir.
Önemlisi, mikrofiltre yakalama cihazı tamamen dayalı büyüklükte ve bırakma stratejisi belli yüzey belirteçlerinin varlığı agnostik mesafesindedir. Biz PIPAAm kaplı mikro filtre istihdam etkin ve verimli bir yakalama ve alt analizler için CTC serbest bırakmak için yeteneği sağlayarak, metastatik sürecinin anlayışımızı genişletmek için yardımcı olacağına inanıyoruz. güçlü Bu mayısially kolaylıkla izlenebilir ve kanser hastası yönetiminde yardım edilebilir bir biyobelirteç sağlamak gibi yeni hedefli sistemik tedaviler de yönlendirilebilir olabilir için yeni moleküller maruz kalmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Beyanı: insan deneklerin haklarını korumak için, kan örnekleri IRB 20150020 altında Miami kurumsal inceleme kurulları Üniversitesi tarafından onaylanan protokoller altında bilgilendirilmiş onam aşağıdaki elde edilmiştir.
NOT: CTC yakalamak için filtre edilecek Kan pıhtılaşmasını önlemek için bir EDTA tüp içinde toplanmalıdır.
1. Poli (N-izo-propylacrylamide) (PIPAAm) ile Mikrofiltre kaplanması
- butanol içinde bir% 10 ağırlık / hacim solüsyonu hazırlamak için PIPAAm tartılır. Çözelti berrak olana kadar bir vorteks ile karıştırın.
- Kesme plastik mikroskop makas veya keskin bıçak bir çift ile yaklaşık 12 mm x 12 mm kareler içine ya kayar. Alternatif olarak, bir giyotin kullanın.
NOT: Bu kareler spin kaplama işlemi sırasında filtreler için bir tutucu olarak görev yapacak. - düz kenar makas keskin çifti kullanılarak, 8 mm x 8 mm kareler halinde yuva gözenek mikrofiltre gofret kesti.
- Plastik squa üzerine kesme filtreleri emniyete bir poliimid film bant kullanarakres önce adım 1.3 kesti. filtre alanının en az 7 mm x 7 mm un kaplı bantla böylece sadece kenar ve filtre köşesine sürün.
Şekil 2:. PIPAAm Kaplama 8 mm x 8 mm mikrofiltre için mikro filtre Set-up Temsilcisi İllüstrasyon plastik mikroskop lamı 12 mm x 12 mm plastik kare kesim üzerine konumlandırılmış. Poliimid bant referans 15 izniyle kaplamaz PIPAAm.Reproduced dönmeye yerinde Mikrofiltreyi sabitlemek için kullanılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Spin-kaplayıcı vakum mandren üzerine, plastik meydanda sabitlenir Mikrofiltreyi yerleştirin.
- Başlat, 10 saniye boyunca 500 rpm, 6.000 r: Aşağıdaki tarifi spin-kaplayıcı Program60 saniye, 10 saniye, Stop için 500 rpm için pm.
- PIPAAm solüsyonu v tamamen standart bir plastik transfer pipet kullanarak mikrofiltre yüzeyini kaplayan ve sıkma kaplayıcı başlatmak için (1.1 hazırlanmış) w / yeterli% 10 koyun.
- Kaplama işlemi tamamlandıktan sonra spin-kaplayıcı gelen PIPAAm kaplı Mikrofiltreyi çıkarın. depolama sırasında plastik kareye bağlı filtreyi bırakın.
Not: Kaplanmış filtre kadar 3 ay boyunca oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.
PIPAAm Kaplı mikro filtreli ile Filtrasyon Kaset 2. Montaj
- Hala bir petri içine plastik meydanında güvenli Mikrofiltreyi koyarak oda sıcaklığında PIPAAm kaplı Mikrofiltreyi rehydrate. mikrofiltre tamamen batık kadar 1x PBS ekleyin ve 5 dakika bekletin.
- hidrasyon adımından sonra, makas bir çift kullanarak Polyimide film bandı keserek plastik meydanından filtreyi bırakın.
NOT: sahip filtrenin hangi tarafı dikkat edinPIPAAm kaplama. - 2 polidimetilsiloksan (PDMS) adet, bir conta / mühür olarak hareket ile birlikte üst ve alt akrilik parça arasında Mikrofiltreyi sandviç ile, filtrasyon kaset içine Mikrofiltreyi birleştirin. Filtreyi güvence altına almak ve sıkı bir mühür sağlamak için kliplerle akrilik kaseti Kelepçe.
Not: Örnek süzülür olarak, hücreler filtrenin (Şekil 1) PIPAAm kaplanmış yüzeyi üzerine çekilecek olan şekilde PIPAAm kaplama yukarı bakacak şekilde olmalıdır.
Mikro filtreli gelen yakalama ve CTC Release Kan Örneğinin 3. Filtrasyon
- Her şırınga pompası marka kendi kullanıcı arayüzü var gibi, pompanın kullanım kılavuzuna bakın ve 75ml / saat hızında akış ve 20 ml seviyesini ayarlamak için şırınga pompası programlayın.
- McCoy (ticari olarak temin edilebilir) hücre kültür ortamının Sıcak 3 mi, 37 ° C (% 10 Fetal Sığır Serumu ve% 1 penisilin ve streptomisin içinde ilave edilerek hazırlanır).
- 7.5 ml kan örnek ticari olarak temin edilebilir Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS), 7.5 ml ilave edilir ve 25 ml'lik bir şırınga içine Bu seyreltilmiş kan aspire.
1 seyreltme: 10 ml kan kullanılırsa, daha sonra 1 elde etmek için 10 ml eşit hacimde HBSS ile karıştırmak HBSS, mesela 1:. Not: kan örneği 1 eşit hacimde seyreltilmiştir için HBSS hacmi ayarlayın. - şırınga ile filtrasyon kasetini Engage ve şırınga pompası üzerine yerleştirin. aracılığıyla akışını toplamak ve pompayı çalıştırmak için alt 50 ml'lik tüp yerleştirin.
NOT: filtrasyon kabaca 10- 12 dakika sürer. Tüm filtreleme adımlarından yapılacak olanAdım 3.8 de dahil olmak üzere normal oda sıcaklığında (20-25 ° C) dışarı - filtrasyon işlemi tamamlandıktan sonra, hangi tarafın PIPAAm kaplı bir yüzeye yakalanan hücreleri vardır üst olduğunu filtrasyon kaset alma notu boşa. Aspire, yeni bir şırınganın içine ılık kültür ortamı 1 ml.
- ortamı içeren şırınga ile filtrasyon kaseti yeniden meşgul, ama filtre PIPAAm kaplı yüzey uzakta şırınga bakacak şekilde şu anda kasetin alt ucunu meşgul.
NOT: Bu nazik ters akışı uygulanmak suretiyle yuva gözeneklerin içine gömülü olabilecek hücreleri serbest olacaktır. - geri şırınga pompası üzerine şırınga yerleştirin ve sağ filtrasyon kaset altında küçük bir petri veya 6-plaka tutun. 100 ml / saat akış hızını ayarlamak ve pompayı çalıştırın.
- filtre ile tüm medya Pass ve akış yoluyla petri toplamak. tüm medya geçmek için bekleyin ve daha sonra pompayı durdurun ve şırınga a çıkarmakpompadan ND filtrasyon kaseti.
- şırınga filtrasyon kaseti ayırın ve kaset filtreyi almak için açın. PIPAAm yüzey gözenekleri hücreleri serbest zaman ters akışı toplamak için kullanılan aynı petri içine aşağı bakacak şekilde filtreyi yerleştirin. Sıcak medyanın geri kalanını ekleyin ve 37 ° C'de ayarlanmış bir kültür inkübatör içine petri yerleştirin.
- 30 dakika sonra tüm hücreleri filtreden çıkacak. Bununla birlikte, tüm hücreleri ayırmak sağlamak için en fazla 24 saat için bir petri filtre bırakın.
NOT: Alternatif olarak, serbest hücreler mikrosantrifüj tüp içine toplanabilir birkaç örnek isim PCR, ELISA, Western Blot gibi diğer aşağı analiz yapmak için. - Kültür içerisinde 24 saat sonra, dikkatli bir şekilde forseps kullanılarak mikro filtre çıkarın.
NOT: Filtre şu anda atılabilir hücreler ondan serbest bırakıldı gibi. - Yavaşça yukarı ve bir 1000 & # kullanarak aşağı kültür ortamı pipetle181; l pipet, eritrosit ve yeniden askıya periferik kan mononükleer hücre filtresine yakaladı ve CTC ile plaka salınan (hücre). gevşek bağlı kanser hücrelerini ayrılmakta önlemek için dikkatli ve yavaşça bu eylemi gerçekleştirmek. Dikkatle taze ortam önceden ısıtılmış 37 ° C ile bağlı kanser hücreleri ve yerine geride bırakarak yeniden süspansiyon haline eritrositleri ve PBMC içeren tüm orta kaldırmak.
NOT: Aşırı eritrositler tek yıkamadan sonra varsa Bu adım bir kez tekrar edilebilir.
4. CTC Canlılık Değerlendirilmesi
- Canlı / Ölü Assay 8 kullanarak kültürlü CTC canlılığı değerlendirmek.
NOT: Çok sayıda canlı / Ölü tahliller piyasada bulunmaktadır. Üreticinin protokolü takip yüksek tavsiye edilir. Bu deney için kullanılan ticari deney kiti için malzemeler / reaktif maddeler listesine bakınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sağlıklı donörlerin kan kullanılarak (bir aydınlatılmış onam aşağıdaki Miami IRB 20150020 Üniversitesi tarafından onaylanan bir protokol çerçevesinde elde edilen) kültür kanser hücrelerinin, canlı dolaşan tümör hücrelerinin (CTC), elde edilen yakalama, serbest bırakılması ve alma verimliliği serbest bırakılması için thermoresponsive tekniği ile çivili % 94 ±% 9,% 82 ±% 5 ve% 77 ±% 5 (Tablo 1) 15. Karşılaştırıldığında, kaplanmamış filtrelerin bırakma ve alma verimliliği önemli ölçüde daha düşük (% 7 ± 1% bırakma verimliliği ve% 6 ± 1% alma verimliliği) (Tablo 1) 15 idi. filtreden serbest kapalı zaman eğrilerinin uygulanabilirliğini değerlendirmek amacıyla, ~ 1.000 SK-BR-3 hücreleri, PIPAAm kaplanmış yuva filtre içinden filtre edildi ve yukarıda tarif edilen yöntem kullanılarak serbest sağlıklı donörün kanındaki 7.5 ml tutturuldu. A Canlı / Ölü tahlil kana başak önce hücre canlılığını değerlendirmek için yapılmıştırve serbest bırakıldıktan sonra. Ön başak canlılığı% 98 (592 602 sayılan hücre dışına) ve yakalanır ve kandan serbest hücrelerin canlılığı% 95 (sayılır 540 567 üzerinden hücreler) 15 (Şekil 3A) idi. Buna paralel olarak, hücreler yakalanıp McCoy'un 5A kültür ortamı içinde kültürlenmiştir kan örneğinden sonrası filtrasyon yayınladı. Şekil 3B gösterildiği gibi Görüntüler Gün 3 ve Gün 10. alındı, filtreden çıkan hücreler sadece canlı kaldı, ama böylece canlılık sonrası filtrasyon kuran, kültür hızla genişledi.
Şekil 1:. PIPAAm Yakalama Yuvası Filtreler Kaplamalı ve Yayın Blood gelen dolaşan tümör hücrelerinin (Üst panel) (A) PIPAAm kaplı yuva filtre aydınlık görüntü; CTC yakalama için tam kan (B) süzülmesi. T (C) şematikO, PIPAAm kaplı yuva filtre üst ve alt kaset arasında sıkışmış kaseti mikrofiltre. Işlemin (Alt panel) (D) şematik PIPAAm kaplı yuvası filtrelerinden CTC yakalanan serbest bırakılmasına karar verdi. Referans 15 izniyle yayınlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Yakalama, Canlı Tümör Hücreleri Yayın ve Kültür Meme kanseri hücreleri (SKBR-3) ele geçirildi, normal donör kanda çivili ve bir PIPAAm kaplı Mikrofiltreyi kullanarak yayınladı. Hücreler canlı sonrası serbest kalmış ve hızla kültürde genişledi. (A) Canlı-cansız tahlil filtresinden çıkan hücreler üzerinde yapıldı. Hücrelerin% 95 (sayılan 567 hücre 540 üzerinden) uygulanabilir olmasını gösterdiaçıklamasında şu (yeşil). Ölü hücreler, kırmızı etiketlenmiştir. (B) PIPAAm kaplı yuvası filtresinden çıkan hücrelerin gün 10 kültür yoluyla Gün 3. Hücreler canlı ve kültür genişletilmiş kalmıştır. Ölçek çubuğu = 100 referans 15 izni ile μm.Reproduced. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Gözenek parametreler, ön ve Post PIPAAm Kaplamanın ölçüm yuvası filtre (A), ön ve (B) sonrası PIPAAm kaplamanın aydınlık ve görüntüler.. PIPAAm kaplama ve gözenek genişliği PIPAAm kaplamadan sonra% 5.6 ±% 15,3 oranında azaldığı tespit edildi (C) Gözenek uzunluğu 2.1 ±% 7.3% oranında azalmıştır. Referans 15 izniyle yayınlanmıştır.Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: eritrositler ve lökositlerin kirleticiler nazik yıkaması ile kaldırıldı ve yaklaşık olarak 1.000 SKBR-3 hücrelerinin PIPAAm kaplanmış yuva filtre ile kandan elde edildi ve 48 oyuklu bir plaka üzerinde kaplandı.. (A), kültür içinde 16 saat sonra apoptotik eritrositler ve lökositlerden ise, kültür plakasının (yeşil oklar) yapıştırılır SKBR-3 tümör hücreleri, aynı zamanda plaka (kırmızı oklar) altındaki yerleşme. (B) yıkama sonrası, yapışmayan hücreler plaka (yeşil oklar) yapışık tümör hücreleri bırakarak uzaklaştırılmıştır. Referans 15 izniyle yayınlanmıştır. LütfenBu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Tablo 1:. Yakalama, Yayın ve PIPAAm Kaplı slot Filtreler Alım Etkinliği verimliliğini Yakalama = bırakma / hücre sayıları önce filtre üzerinde yakalanan hücre sayıları kana çivili. yayınlanmadan önce filtre yakalanan filtre / hücre sayıları salınan verimlilik = hücre sayıları bırakın. Alma verimlilik = filtre / hücre sayıları salınan hücre sayıları referans 15 izniyle blood.Reproduced içine çivili.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
tam kandan canlı CTC yakalamak ve mikro filtre onları bırakmadan süreci oldukça basittir; ancak birkaç kritik noktalar kayda değer bulunmaktadır. Nesnenin steril bir durumda tüm süreç boyunca korunur Tüm hücre kültürü gibi, zorunludur. filtreden hücrelerin serbest tekniği için temel PIPAAm sıcaklık duyarlı arayüz özelliklerinin istismar dayalı olarak PIPAAm filtreyi kaplanması ilk adımı, kritik öneme sahiptir. Filtre etkili kaplanmış temin kaplamadan önce, bir mikroskop altında filtre üzerinde bir gözenek (slot gözenek genişliği ve uzunluğu) boyutunu ölçmek ve daha sonra tekrar bir gözenek boyutu sonrası kaplama ölçmek için. Gözenek boyutu genişliği ve uzunluğu (Şekil 4) hem de 1 mikrona azalarak edilmelidir. belirtildiği gibi, etkin bir CTC yakalarken yuva filtresi de bununla birlikte, bu hücreler, yapışmayan hücreler ve böylece Duri olan bazı büyük PBMC hücreleri yakalarng adım 3.13 yapışık kanser hücrelerinin geride bırakarak kültür (Şekil 5) kaldırılır.
viskozitesi çok yüksek olduğunda, kan farklı miktarlar örneklerde veya filtre edilecek ise protokol küçük değişiklikler gerekli olabilir. HBSS: 1 protokolü de belirtildiği gibi, kan 1 seyreltilmesi için çok önemlidir. Kan viskozitesi Ancak çoğunlukla bu filtrasyon etkilemez, hastadan hastaya farklılık gösterir. viskozitesi çok yüksektir ve büyük pıhtıları, bu durumda bir şırınga pompası filtre içinden kan zorlamak için mümkün olmayacaktır, mevcut olduğunda, belirli durumlar olacaktır. Şırınga pompası durdurmak şırınga kaseti boşa, kasetin üst kısmını açmak, ama yine de alt kısmına takılı filtre bırakmak için bu durumlarda tavsiye edilir. Büyük kan pıhtıları filtre kolayca görünür olacaktır. hafif bir ang de kaseti tutarak yavaşça filtre üzerine HBSS 1 ml pipetle pıhtı yıkayın izin vermek için. pıhtı kaldırıldıktan sonra, kaseti kapatmak şırınga onu yeniden yapmaya ve filtrasyon devam edin.
PIPAAm kaplı filtreler gruplar olarak yapılmış ve daha sonra kullanılmak üzere depolanabilir birlikte, bu ön-kaplanmış filtre raf ömrü yaklaşık 3 ay olduğunu bulduk. etkili kapma ve hücrelerin serbest bırakma süresi içinde PIPAAm aynşan kısmen azaltılabilir.
sınırlayıcı faktörlerden biri kan örneğinde mevcut CTC sayısında yalan olur, hasta CTC bir kültürü oluşturmaktır. Düşük sayıda olası imkansız değilse son derece zor hücreleri arttırma yetisi, yapacaktır. Bununla birlikte, daha küçük bir kültür alanlara düşük hücre sayısı ile bir örnek kenetleme gibi 96 kuyulu bir levha yerine 6 plaka tek bir oyuk olarak, yardımcı olabilir. Kültür ortamı veya ticari olarak temin edilebilen ortamın modifikasyonu tanıtımı, FO uygun ortamı sağlayacakbüyümek için bu hücreleri r aşılması gereken başka bir sorundur.
CTC Moleküler ve hücresel analizler kanser prognoz için değerli bilgiler sağlar ve sürücü hassas ilaç 15 yardımcı olabilir. yakalama filtresinde salınan hücrelerin canlılığı ilaç duyarlılık ve tarama testleri için kültür hasta CTC yeteneği doğru önemli bir gelişmedir. Uzun CTC nedenle buna göre her iki tedavi etmek için gerekliliği primer tümörden farklılık eğiliminde olduğu bilinmektedir. Bir örnek olarak, Schneeweiss ve diğ. metastatik meme kanseri (MBC) metastatik doku ve primer tümör antijen profilleri hastaların% 20'ye kadar farklı olduğunu bildirmiştir. insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2) ifadesi de dahil olmak üzere tahmini belirteçler, Yeniden Değerlendirilmesi MBC tedavisini optimize etmek için yardımcı olabilir. Doku örnekleme invaziv ve sık sık tekrarlamak zor olsa da, CTC analiz sadece kan örneği gerektirir ve kolay-tekrar, gerçek zamanlı & # sağlayabilir34; sıvı biyopsi "yaklaşımı 22.
tekniğin büyük bir önemi çok platform genellikle CTC yakalama kullanılan sırasında sabitleyici numune için gerekli olan analizler, moleküler ve hücresel analizlerde sınırlıdır veya CTC platformu üzerinde immobilize edilir yatmaktadır. Bundan başka, uygun bir CTC yakalama ve serbest kalmasına imkan vermek afinite bazlı sistemler, potansiyel olarak hedef antijenin 15 seçimiyle bastırılmaktadır. Alternatif olarak, PIPAAm kaplama ile yuva filtre tam kandan yakalama ve canlı CTC serbest bırakılması etkili ve verimli bir etiket ücretsiz bir platform sağlar. Bu yöntem, tek hücre fenotipik ve genomik analiz yanı sıra ex vivo CTC kültürü de dahil olmak üzere canlı CTC daha karakterizasyonu için yeteneği sağlar.
Çalışma klinik uygulamalar için bu teknolojiyi kullanılması halen devam etmektedir. yetenek patien gelen etkin bir kültür CTC içint örnekleri, temel hasta yeni ilaç hedefleri ortaya koyması ve etkili kemoterapötiklerin gelişmesine yol bir hasta üzerinde etkili tedavi alayları formülasyonuna yol açacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slot Filter | Circulogix Inc. | MSF-01 | Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com) |
| poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) | Ploysciences Inc. | 21458 | Non-Hazardous. Store at room temp. |
| 1-Butanol | Sigma Aldrich | B7906 | Use in well ventilated area |
| Plastic Microscope Slides | Cole-Parmer | 48510-30 | Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square |
| Spin Coater | Specialty Coating Systems | SCS G3 Spin Coater | Instrument |
| Polyimide Tape | Uline | S-7595 | Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com) |
| HBSS- Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Falcon Petri dishes 35 x 10 mm | VWR | 25373-041 | |
| Microfilter Cassette | Circulogix Inc. | FC-01 | Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine |
| Syringe 20 ml | BD Scientific | 302830 | |
| Syringe Pump | KD scientific | 78-0100V | Any syringe pump capable of holding a 25 ml syringe may be used |
| Cellstar 50 ml Centrifuge tube | VWR | 82050-322 | |
| Greiner Bio One 6 well plate | VWR | 89131-688 | Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant |
| SKBR3 Cells | ATCC | HTB-30 | |
| Live Dead Assay | Life Technologies | L3224 | Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work |
| Cell Culture Incubator | VWR | 98000-368 | Any incubator that can be used for cell culture will suffice |
References
- Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N Engl J Med. 351 (8), 781-791 (2004).
- de Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
- Cohen, S. J., Punt, C. J. a, et al. Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).
- Smerage, J. B., Barlow, W. E., et al. Circulating Tumor Cells and Response to Chemotherapy in Metastatic Breast Cancer: SWOG S0500. J. Clin. Oncol. 32 (31), 3483-3490 (2014).
- Mach, A. J., Kim, J. H., Arshi, A., Hur, S. C., Di Carlo, D. Automated cellular sample preparation using a Centrifuge-on-a-Chip. Lab chip. 11 (17), 2827-2834 (2011).
- Ozkumur, E., Shah, A. M., et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Sci. Transl. Med. 5 (179), 179 (2013).
- Nagrath, S., Sequist, L. V., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Hosokawa, M., Kenmotsu, H., et al. Size-Based Isolation of Circulating Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Microcavity Array System. PLoS ONE. 8 (6), (2013).
- Bhagat, A. A. S., Hou, H. W., Li, L. D., Lim, C. T., Han, J. Pinched flow coupled shear-modulated inertial microfluidics for high-throughput rare blood cell separation. Lab on a chip. 11 (11), 1870-1878 (2011).
- Tan, S. J., Lakshmi, R. L., Chen, P., Lim, W. -T., Yobas, L., Lim, C. T. Versatile label free biochip for the detection of circulating tumor cells from peripheral blood in cancer patients. Biosens. Bioelectron. 26 (4), 1701-1705 (2010).
- Vona, G., Sabile, A., et al. Isolation by size of epithelial tumor cells a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulatingtumor cells. Am. J. Pathol. 156 (1), 57-63 (2000).
- Marrinucci, D., Bethel, K., et al. Case study of the morphologic variation of circulating tumor cells. Human pathology. 38 (3), 514-519 (2007).
- Lin, H. K., Zheng, S., et al. Portable filter-based microdevice for detection and characterization of circulating tumor cells. Clin. Cancer Res. 16 (20), 5011-5018 (2010).
- Williams, A., Rawal, S., et al. Clinical translation of a novel microfilter technology Capture, characterization and culture of circulating tumor cells. PHT. , 220-223 (2013).
- Ao, Z., Parasido, E., et al. Thermoresponsive release of viable microfiltrated Circulating Tumor Cells (CTCs) for precision medicine applications. Lab Chip. 15, 4277-4282 (2015).
- Xu, T., Lu, B., Tai, Y. C., Goldkorn, A. A cancer detection platform which measures telomerase activity from live circulating tumor cells captured on a microfilter. Cancer Res. 70 (16), 6420-6426 (2010).
- Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release. J. Control. Release. 11 (1-3), 255-265 (1990).
- Yamada, N., Okano, T., Sakai, H., Karikusa, F., Sawasaki, Y., Sakurai, Y. Thermo-responsive polymeric surfaces; control of attachment and detachment of cultured cells. Die Makromol. Chemie, Rapid Commun. 11 (11), 571-576 (1990).
- Deng, Y., Zhang, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci. Rep. 4, 7499 (2014).
- Hou, S., Zhao, H., et al. Capture and stimulated release of circulating tumor cells on polymer-grafted silicon nanostructures. Adv. Mater. 25 (11), 1547-1551 (2013).
- Xiao, Y., Zhou, H., et al. Effective and selective cell retention and recovery from whole blood by electroactive thin films. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (23), 20804-20811 (2014).
- Wallwiener, M., Hartkopf, A. D., et al. The impact of HER2 phenotype of circulating tumor cells in metastatic breast cancer: a retrospective study in 107 patients. BMC cancer. 15 (1), 403 (2015).
