Summary
एक प्रोटोकॉल एक पाली (एन, आईएसओ-propylacrylamide) (PIPAAm) प्रभावी कब्जा है और व्यवहार्य घूम ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी) के thermoresponsive रिहाई के लिए लेपित Microfilter प्रस्तुत किया जाता है का उपयोग करने के लिए। इस विधि को नीचे की ओर बंद चिप संस्कृति के लिए मरीजों के रक्त और व्यवहार्य सीटीसी के बाद रिहाई से सीटीसी का कब्जा अनुमति देता है, का विश्लेषण करती है और लक्षण।
Abstract
हम पूरे रक्त से व्यवहार्य घूम ट्यूमर सेल (सीटीसी) के आकार के आधार पर कब्जा करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन बहाव के विश्लेषण और / या संस्कृति के लिए चिप से इन कोशिकाओं की रिहाई के साथ। रणनीति एक उपन्यास Parylene सी झिल्ली स्लॉट ताकना Microfilter के उपयोग सीटीसी और एक (PIPAAm) पर कब्जा कर लिया सीटीसी की thermoresponsive व्यवहार्य रिहाई के लिए पाली की कोटिंग (एन, आईएसओ-propylacrylamide) पर कब्जा करने के लिए कार्यरत हैं। जीवित कोशिकाओं का कब्जा विशिष्ट आयाम के साथ एक स्लॉट ताकना ज्यामिति के डिजाइन का लाभ आम तौर पर निस्पंदन प्रक्रिया के साथ जुड़े कतरनी तनाव को कम करने से सक्षम है। Microfilter एक उच्च कब्जा दक्षता दर्शाती है, वहीं इन कोशिकाओं की रिहाई गैर तुच्छ है। आमतौर पर, केवल कोशिकाओं का एक छोटा सा प्रतिशत जारी कर रहे हैं जब इस तरह रिवर्स प्रवाह या सेल स्क्रैप के रूप में तकनीक का इस्तेमाल कर रहे हैं। Parylene सी झिल्ली करने के लिए इन उपकला कैंसर की कोशिकाओं की मजबूत आसंजन गैर विशिष्ट इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत के कारण है। वें प्रतिक्रिया करने के लिएप्रभाव है, हम PIPAAm कोटिंग के उपयोग कार्यरत हैं और अपने थर्मल संवेदनशील इंटरफेसियल गुण फिल्टर से कोशिकाओं को रिहा करने का फायदा उठाया। रक्त पहले कमरे के तापमान पर फ़िल्टर किया जाता है। नीचे 32 डिग्री सेल्सियस, PIPAAm हाइड्रोफिलिक है। इसके बाद फिल्टर या तो संस्कृति मीडिया या एक बफर 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा है, जो PIPAAm में यह परिणाम हाइड्रोफोबिक मोड़, और बाद में electrostatically बाध्य कोशिकाओं को जारी करने में रखा गया है।
Introduction
Metastatic रोग ज्यादातर कैंसर से होने वाली मौतों के लिए जिम्मेदार है। मेटास्टेसिस के लिए शकुन और साथी नैदानिक बायोमार्कर का विकास कैंसर प्रबंधन और उपचार में महत्वपूर्ण है। परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी) ट्यूमर प्रसार और मेटास्टेसिस में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं। इसके अलावा, एक 'तरल बायोप्सी' बायोमार्कर के रूप में आसानी से सुलभ होने, कैंसर रोगियों में सीटीसी कैंसर बायोमार्कर अनुसंधान के लिए बड़ा केंद्र '' परिधीय रक्त एक के रूप में बढ़ रहा है '। 3 - सीटीसी अच्छी तरह से स्तन, प्रोस्टेट और कोलोरेक्टल कैंसर 1 सहित विभिन्न कैंसर सेटिंग्स, में एक शकुन बायोमार्कर के रूप में मान्य किया गया है। हालांकि, सीटीसी क्षेत्र में हाल के अग्रिमों संकेत दिया है कि इन दुर्लभ कोशिकाओं के मात्र गणन नैदानिक उपयोगिता सीमित है, के रूप में हस्तक्षेप क्लिनिकल परीक्षण 4 में दिखाया गया है। इस प्रकार, वहाँ प्रौद्योगिकियों कि सीटीसी की आणविक और कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देने के लिए एक उभरते की जरूरत है। वर्तमान में, केवल कुछ प्रौद्योगिकियों मौजूद है कि अनुमति देने के लिएआर गैर पक्षपातपूर्ण प्रतिजन, व्यवहार्य कब्जा है और सीटीसी की रिहाई, मजबूत नीचे की ओर आणविक और कार्यात्मक विश्लेषण 5,6 सक्षम करने से। इन microfabricated उपकरणों के बहुमत microfluidic प्लेटफार्मों के लिए मिलकर कर रहे हैं और इस प्रकार रक्त की मात्रा है कि कार्रवाई की जा सकती है, जो से 2-4 मिलीलीटर 7 पर्वतमाला में एक सीमित कारक है - 10। सीटीसी, (7.5 एमएल) रक्त ड्रा के लिए एक एकल ट्यूब में दुर्लभ घटनाओं रहे हैं इसलिए आगे खून है कि कार्रवाई की जा सकती की मात्रा को कम करने, बहुत पर कब्जा करने और ब्याज की इन कोशिकाओं को अलग-थलग करने की संभावना hinders।
हम सीटीसी का कब्जा है जो बड़ा ट्यूमर कोशिकाओं और छोटे सामान्य रक्त कोशिकाओं 11,12 के बीच आकार मतभेद का फायदा उठाने के लिए Parylene सी झिल्ली Microfilter उपकरणों के दो प्रकार विकसित किया है। हम पहले दौर ताकना गणन फिल्टर पर सूचना दी और एक एफडीए को मंजूरी दी मंच है, जहां Microfilter सीटीसी कब्जा दक्षता में बेहतर होना दिखाया गया था के साथ यह तुलना में हैकैंसर रोगी के रक्त के नमूने लिए 13,14। हालांकि, गोल फिल्टर की एक सीमा आवश्यकता छानने का काम करने से पहले एक formaldehyde आधारित लगानेवाला का उपयोग करने के लिए है। इस प्रक्रिया कोशिकाओं आकृति विज्ञान, जबकि उन्हें निस्पंदन प्रक्रिया के दौरान कतरनी तनाव और दबाव का सामना करने के लिए अनुमति बरकरार रखता है। गणन और आणविक पढ़ाई पर चिप 13 से प्रदर्शन किया जा सकता है, लगानेवाला कार्यात्मक लक्षण वर्णन प्रदर्शन करने की क्षमता को बाधित। इस सीमा को संबोधित करने के लिए, हम एक स्लॉट ताकना फिल्टर है कि आवश्यकता छानने का काम करने से पहले कोशिकाओं (चित्रा 1) ठीक करने के लिए नकारती विकसित की है। स्लॉट ताकना ज्यामिति (6 माइक्रोन चौड़ाई x 40 माइक्रोन लंबाई स्लॉट pores) ट्यूमर कोशिकाओं जबकि केवल आंशिक रूप से एक ताकना occluding और इस प्रकार अभी भी अन्य रक्त कोशिकाओं के लिए मुफ्त यात्रा की अनुमति देने और दबाव में वृद्धि है कि सेल की क्षति के लिए नेतृत्व करेंगे को समाप्त करने के लिए अनुमति देता कब्जा किया और अंततः फोड़ 15,16 स्लॉट ताकना कारतूस 2 एक्रिलिक टुकड़े जो सैंडविच से बना हैएक गैसकेट के रूप में साथ polydimethylsiloxane (PDMS) अभिनय ऊपर और नीचे टुकड़ा के बीच स्लॉट ताकना फिल्टर एक लीक सबूत मुहर 14,15 (चित्रा 1) प्रदान करने के लिए।
जबकि स्लॉट ताकना फिल्टर का कब्जा दक्षता उच्च है, (1 टेबल) पर कब्जा कर लिया सीटीसी बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) की मध्यस्थता आसंजन 15 की बजाय मजबूत गैर विशिष्ट बातचीत electrostatic द्वारा Parylene सी झिल्ली के लिए बाध्य कर रहे हैं। इस तरह रिवर्स प्रवाह या सेल स्क्रेपर्स के उपयोग के तरीके के रूप में प्रभावी ढंग से, फिल्टर से कोशिकाओं को रिलीज या सेल नुकसान और कोशिका मृत्यु में परिणाम के लिए असफल। हम PIPAAm की एक अपरंपरागत उपयोग एक रिलीज की रणनीति तैयार करने के लिए 15 का पता लगाया। PIPAAm एक बहुलक है कि 32 डिग्री के समाधान तापमान 17 पर एक प्रतिवर्ती कम महत्वपूर्ण समाधान तापमान (LCST) चरण संक्रमण की प्रक्रिया से गुजरते है। परंपरागत रूप से, PIPAAm की इस संपत्ति के लिए व्यापक रूप से ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए लगाया गया है। आमतौर पर, कोशिकाओं रहे हैंPIPAAm पर संवर्धित 37 डिग्री सेल्सियस पर लेपित सतहों जब PIPAAm हाइड्रोफोबिक है। जब संस्कृति तापमान 32 डिग्री सेल्सियस से नीचे है, जहां PIPAAm लेपित सतह हाइड्रेटेड 17,18 हो जाता है स्थानांतरित कर दिया है कोशिकाओं तो एक चादर के रूप में अलग किया जा सकता है। हम कमरे के तापमान (नीचे 32 डिग्री सेल्सियस) पर निस्पंदन प्रक्रिया के प्रदर्शन और उसके बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा संस्कृति मीडिया में फिल्टर रखकर सेल रिहाई को सक्षम करने से इस थर्मल संपत्ति का फायदा उठाया। इस तापमान पर, PIPAAm बहुलक परत हाइड्रोफोबिक हो जाता है, जिससे electrostatically बाध्य कोशिकाओं 15 (चित्रा 1) जारी है।
हालांकि तापमान उत्तरदायी विधि के साथ-साथ अन्य तरीकों सफलतापूर्वक व्यवहार्य सीटीसी कब्जा प्राप्त करने और 19 को रिहा करने के लिए लागू किया गया है - 21, एक प्रमुख संभावित दोष इन प्रौद्योगिकियों सूचना से साझा किया है कि वे सभी सीटीसी को पकड़ने के लिए एक प्रतिजन निर्भर सिद्धांत को रोजगार है। एंटीजन आधारित सीटीसी कब्जा, के रूप में दिखाया पीreviously, पक्षपाती सीटीसी विश्लेषण 11,14 करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, कई समानता आधारित प्रौद्योगिकियों एंटीबॉडी कि सीटीसी को पकड़ने के लिए EpCAM बांधता है रोजगार। हालांकि, सीटीसी EpCAM के विभिन्न स्तरों व्यक्त करने के लिए, इन प्रौद्योगिकियों द्वारा EpCAM कम और EpCAM नकारात्मक सीटीसी की चूक के लिए अग्रणी दिखाया गया है। इसके अलावा, सीमाओं हो सकता है जब गैर उपकला मूल से सीटीसी ऐसे सीटीसी के रूप में ब्याज, मेलेनोमा और सार्कोमा सेटिंग्स में से एक है। इस प्रकार, एक तकनीक है कि व्यवहार्य सीटीसी को पकड़ने और रिहाई के लिए संभावित पूर्वाग्रह प्रतिजन आधारित कब्जा द्वारा शुरू की बिना अनुमति देता अति आवश्यक है।
महत्वपूर्ण बात है, Microfilter कब्जा डिवाइस विशुद्ध रूप से आधारित आकार है और रिहाई रणनीति निश्चित सतह मार्कर की उपस्थिति के लिए नास्तिक है। हम मानते हैं कि PIPAAm लेपित Microfilter के रोजगार को प्रभावी ढंग से और कुशलता से कब्जा और नीचे की ओर विश्लेषण के लिए रिलीज सीटीसी करने की क्षमता प्रदान करने के माध्यम मेटास्टेटिक प्रक्रिया के बारे में हमारी समझ का विस्तार करने के लिए, मदद मिलेगी। यह मई प्रबलially नए अणुओं जिसके लिए लक्षित उपन्यास प्रणालीगत चिकित्सा के रूप में अच्छी तरह से निर्देशित किया जा सकता है के रूप में एक बायोमार्कर है कि आसानी से नजर रखी जा सकती है और कैंसर रोगी प्रबंधन में सहायता उपलब्ध कराने का पर्दाफाश।
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Protocol
आचार कथन: मानव विषयों के अधिकारों की रक्षा करने के लिए, रक्त के नमूने आईआरबी 20150020 के तहत मियामी संस्थागत समीक्षा बोर्ड के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत एक सूचित स्वीकृति के बाद प्राप्त किया गया।
नोट: रक्त सीटीसी को पकड़ने के लिए फ़िल्टर की जमावट को रोकने के लिए एक EDTA ट्यूब में एकत्र किया जाना चाहिए।
1. पाली (एन आईएसओ propylacrylamide) (PIPAAm) के साथ Microfilter कोटिंग
- PIPAAm वजन एक 10% w / butanol में v समाधान तैयार करने के लिए। एक भंवर का उपयोग जब तक समाधान स्पष्ट है मिलाएं।
- कट प्लास्टिक माइक्रोस्कोप मोटे तौर पर 12 मिमी x 12 मिमी वर्गों या तो कैंची या तेज ब्लेड की एक जोड़ी के साथ में स्लाइड। वैकल्पिक रूप से एक गिलोटिन का उपयोग करें।
नोट: इन वर्गों के स्पिन कोटिंग की प्रक्रिया के दौरान फिल्टर के लिए एक धारक के रूप में काम करेगा। - सीधे बढ़त कैंची की एक तेज जोड़ी का उपयोग, 8 मिमी x 8 मिमी वर्गों में स्लॉट ताकना Microfilter वेफर काटा।
- प्लास्टिक squa पर सुरक्षित कटौती फिल्टर एक Polyimide फिल्म टेप का प्रयोगसंसाधन और अन्य विभागों में पहले से 1.3 चरण में कटौती। केवल धार और फिल्टर के कोने में फिल्म लागू करें ताकि कम से कम 7 मिमी X 7 फ़िल्टर क्षेत्र की मिमी संयुक्त राष्ट्र के कवर टेप कर रहा है।
चित्रा 2:। PIPAAm कोटिंग 8 मिमी x 8 मिमी Microfilter के लिए Microfilter सेट-अप के प्रतिनिधि चित्रण एक प्लास्टिक खुर्दबीन स्लाइड से 12 मिमी x 12 मिमी प्लास्टिक वर्ग में कटौती पर तैनात है। Polyimide टेप जगह में Microfilter को सुरक्षित करने के संदर्भ में 15 से अनुमति के साथ कोट स्पिन करने के लिए PIPAAm.Reproduced प्रयोग किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
- Microfilter है कि स्पिन coater के निर्वात चक पर, प्लास्टिक वर्ग पर सुरक्षित रखें।
- कार्यक्रम के बाद नुस्खा के लिए स्पिन coater: प्रारंभ, 10 सेकंड के लिए 500 आरपीएम, 6000 r60 सेकंड, 10 सेकंड, बंद करो के लिए 500 rpm के लिए PM।
- बांटना पर्याप्त 10% w / PIPAAm समाधान वी (1.1 में तैयार) को पूरी तरह से एक मानक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग Microfilter सतह को कवर किया और स्पिन coater शुरू करने के लिए।
- स्पिन coater से PIPAAm लेपित Microfilter हटाये कोटिंग की प्रक्रिया पूर्ण होने के बाद। फिल्टर भंडारण के दौरान प्लास्टिक वर्ग से जुड़ी छोड़ दें।
नोट: लेपित फिल्टर अप करने के लिए 3 महीने के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है।
PIPAAm लेपित Microfilter साथ छानने का कैसेट की 2. विधानसभा
- Microfilter अभी भी एक पेट्री डिश में प्लास्टिक वर्ग पर सुरक्षित रखकर कमरे के तापमान पर PIPAAm लेपित Microfilter rehydrate। 1x पीबीएस तक Microfilter पूरी तरह से डूबे हुए है जोड़ें और 5 मिनट के लिए खड़े हो जाओ।
- हाइड्रेशन कदम के बाद, Polyimide फिल्म कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर टेप को काटने से प्लास्टिक वर्ग से फिल्टर जारी।
नोट: के फिल्टर के पक्ष में है नोट ले लोPIPAAm कोटिंग। - निस्पंदन कैसेट में Microfilter इकट्ठा, 2 polydimethylsiloxane (PDMS) टुकड़े एक गैसकेट / मुहर के रूप में अभिनय के साथ-साथ ऊपर और नीचे एक्रिलिक टुकड़ा के बीच Microfilter sandwiching द्वारा। फिल्टर सुरक्षित और एक तंग सील प्रदान करने के लिए क्लिप के साथ एक्रिलिक कैसेट दबाना।
नोट: PIPAAm कोटिंग, ऊपर की ओर का सामना करना पड़ जाना चाहिए ताकि नमूना के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है, कोशिकाओं फिल्टर (चित्रा 1) के PIPAAm लेपित सतह पर कब्जा कर लिया जाएगा।
कैद और सीटीसी की रिलीज Microfilter से साथ रक्त नमूना 3. निस्पंदन
- प्रत्येक सिरिंज पंप ब्रांड अपने स्वयं के यूजर इंटरफेस है के रूप में, पंप के उपयोगकर्ता मैनुअल को देखें और सिरिंज पंप कार्यक्रम 75ml / घंटा की दर से प्रवाह और 20 मिलीलीटर मात्रा निर्धारित करने के लिए।
- मैककॉय के (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध) सेल संस्कृति मीडिया के गर्म 3 मिलीग्राम 37 डिग्री सेल्सियस (10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन में जोड़कर तैयार)।
- रक्त का 7.5 मिलीलीटर नमूने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (HbSS) के 7.5 मिलीलीटर जोड़ें और एक 25 मिलीलीटर सिरिंज में इस पतला खून aspirate।
नोट:। HBSS जैसे के साथ 1 यदि रक्त के 10 मिलीलीटर प्रयोग किया जाता है, तो 10 मिलीलीटर HBSS के बराबर मात्रा 1 को प्राप्त करने के साथ मिश्रण: 1 कमजोर पड़ने HBSS की मात्रा इतनी है कि खून का नमूना 1 के बराबर मात्रा के साथ पतला है समायोजित करें। - सिरिंज के साथ छानने का काम कैसेट संलग्न हैं और सिरिंज पंप पर जगह है। तल पर एक 50 मिलीलीटर ट्यूब जगह के माध्यम से प्रवाह को इकट्ठा करने और पंप शुरू करने के लिए।
नोट: छानने का काम मोटे तौर पर 10 12 मिनट लेना चाहिए। सभी निस्पंदन कदम किए जा रहे हैंपर सामान्य कमरे के तापमान (20-25 डिग्री सेल्सियस) 3.8 चरण सहित बाहर - छानने का काम पूरा हो गया है के बाद, निस्पंदन कैसेट नोट लेने जो पक्ष कोशिकाओं PIPAAm लेपित सतह पर पकड़ा गया है कि शीर्ष है छुड़ाना। महाप्राण एक नई सिरिंज में गर्म संस्कृति मीडिया के 1 मिलीलीटर।
- मीडिया वाले सिरिंज के साथ छानने का काम कैसेट पुनः संलग्न हैं, लेकिन इतना है कि फिल्टर का PIPAAm लेपित सतह सिरिंज से दूर का सामना करना पड़ रहा है इस समय कैसेट के नीचे अंत संलग्न हैं।
नोट: यह किसी भी कोशिकाओं है कि कोमल रिवर्स प्रवाह को लागू करने से स्लॉट pores में एम्बेड किया जा सकता है को रिहा करने के लिए किया जाएगा। - सिरिंज वापस सिरिंज पंप पर जगह और सही निस्पंदन कैसेट के तहत एक छोटा सा पेट्री डिश या 6 अच्छी तरह से थाली पकड़ो। 100 मिलीग्राम / घंटा के प्रवाह की दर निर्धारित करें और पंप शुरू करते हैं।
- फिल्टर के माध्यम से सभी मीडिया के पास है और प्रवाह के माध्यम से पेट्री डिश में इकट्ठा। सभी मीडिया के माध्यम से पारित करने के लिए प्रतीक्षा करें और फिर पंप बंद करो और सिरिंज एक को दूरपंप से एन डी निस्पंदन कैसेट।
- सिरिंज से छानने का काम कैसेट छुड़ाना और इसे खोलने कैसेट से फिल्टर निकालते हैं। PIPAAm सतह जब pores से कोशिकाओं को रिहा रिवर्स प्रवाह इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल एक ही पेट्री डिश में नीचे का सामना करना पड़ के साथ फिल्टर रखें। गर्म मीडिया के बाकी जोड़ें और एक संस्कृति इनक्यूबेटर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट में पेट्री डिश जगह है।
- 30 मिनट के बाद सभी कोशिकाओं को फिल्टर से जारी किया जाएगा। हालांकि, यह सुनिश्चित करने के लिए सभी कोशिकाओं को अलग अप करने के लिए 24 घंटे के लिए पेट्री डिश में फिल्टर छोड़ दें।
नोट: वैकल्पिक रूप से, जारी की कोशिकाओं को एक microcentrifuge ट्यूब में एकत्र किया जा सकता ऐसे पीसीआर, एलिसा, वेस्टर्न ब्लाट के रूप में आगे बहाव के विश्लेषण करने के लिए कुछ उदाहरण नाम है। - संस्कृति में 24 घंटे के बाद, ध्यान से संदंश का उपयोग Microfilter को हटा दें।
नोट: फिल्टर इस समय खारिज किया जा सकता के रूप में कोशिकाओं से इसे जारी किया गया है। - धीरे संस्कृति के माध्यम से ऊपर है और एक 1000 & # का उपयोग कर नीचे पिपेट181, एल पिपेट, एरिथ्रोसाइट्स और फिर से निलंबित करने के लिए परिधीय रक्त mononuclear सेल (PBMC) कि फिल्टर पर पकड़ लिया और सीटीसी के साथ थाली में जारी कर रहे हैं। शिथिल संलग्न कैंसर की कोशिकाओं को अलग करने से बचने के लिए सावधानी से और धीरे इस कार्रवाई को पूरा करें। ध्यान से फिर से निलंबित एरिथ्रोसाइट्स और PBMC युक्त जबकि जुड़ी कैंसर कोशिकाओं और ताजा मध्यम पूर्व गरम करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के साथ स्थानापन्न के पीछे छोड़ने के पूरे मध्यम निकालें।
नोट: यह कदम एक बार दोहराया जा सकता है यदि अत्यधिक एरिथ्रोसाइट्स एक धोने के बाद मौजूद हैं।
4. सीटीसी व्यवहार्यता का मूल्यांकन
- मूल्यांकन सुसंस्कृत सीटीसी व्यवहार्यता एक लाइव / मृत परख 8 का उपयोग।
नोट: कई लाइव / मृत assays व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। निर्माता प्रोटोकॉल के बाद अत्यधिक की सलाह दी है। इस प्रयोग के लिए इस्तेमाल वाणिज्यिक परख किट के लिए सामग्री / अभिकर्मकों सूची को देखें।
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Representative Results
स्वस्थ दाताओं के खून का उपयोग करना (एक प्रोटोकॉल एक सूचित स्वीकृति के बाद मियामी आईआरबी 20150020 के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित के तहत प्राप्त) सुसंस्कृत कैंसर की कोशिकाओं, व्यवहार्य घूम ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी), हासिल किया कब्जा, रिहाई और पुनः प्राप्ति दक्षता की रिहाई के लिए thermoresponsive तकनीक के साथ नुकीला 94% ± 9%, 82% ± 5% और 77% की ± 5% क्रमशः (तालिका 1) 15। तुलना करके, uncoated फिल्टर की रिहाई और पुनः प्राप्ति दक्षता काफी कम (7% ± 1% रिहाई दक्षता और 6% ± 1% पुनर्प्राप्ति दक्षता) थे (टेबल्स 1) 15। आदेश फिल्टर से रिहा CTCs की व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए, ~ 1000 एस-BR-3 कोशिकाओं को स्वस्थ दाता के रक्त के 7.5 मिलीलीटर में नुकीला थे, PIPAAm लेपित स्लॉट फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर्ड है और ऊपर वर्णित विधि का उपयोग कर जारी किया। एक लाइव / मृत परख खून में कील से पहले सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए प्रदर्शन किया गया थाऔर रिलीज होने के बाद। पूर्व कील व्यवहार्यता 98% (592 602 कोशिकाओं की गिनती में से) और कब्जा कर लिया और खून से रिहा कोशिकाओं की व्यवहार्यता का 95% (540 567 बाहर गिना कोशिकाओं) 15 (चित्रा 3) था। समानांतर में, कोशिकाओं पर कब्जा कर लिया और मैककॉय के 5 ए संस्कृति के माध्यम में सुसंस्कृत थे खून के नमूने से पोस्ट-छानने का काम जारी की। छवियाँ 3 दिन और दिन से 10 पर ले जाया गया के रूप में चित्रा 3 बी में दिखाया गया है, फिल्टर से रिहा कोशिकाओं केवल व्यवहार्य नहीं बने रहे, लेकिन संस्कृति में तेजी से विस्तार किया है, इस प्रकार उनकी व्यवहार्यता पद निस्पंदन की स्थापना।
चित्रा 1:। PIPAAm लेपित स्लॉट फिल्टर पर कब्जा करने और रिलीज रक्त से परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं (शीर्ष पैनल) (ए) PIPAAm लेपित स्लॉट फिल्टर के Brightfield छवि; (बी) सीटीसी को पकड़ने के लिए पूरे रक्त का निस्पंदन। (सी) टी के योजनाबद्धवह कैसेट जहां, PIPAAm लेपित स्लॉट फिल्टर ऊपर और नीचे कैसेट के बीच sandwiched है Microfilter। (नीचे पैनल) (डी) की प्रक्रिया के योजनाबद्ध PIPAAm लेपित स्लॉट फिल्टर से सीटीसी पर कब्जा कर लिया जारी करने के लिए। संदर्भ 15 से अनुमति के साथ Reproduced। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3:। कब्जा, जारी है और व्यवहार्य ट्यूमर कोशिकाओं की संस्कृति के स्तन कैंसर की कोशिकाओं (SKBr-3) सामान्य रक्त दाता कब्जा कर लिया गया में नुकीला और एक PIPAAm लेपित Microfilter का उपयोग करते हुए जारी किया। कोशिकाओं व्यवहार्य पद रिहाई बना रहा है और तेजी से संस्कृति में विस्तार किया। (ए) लाइव मृत परख फिल्टर से रिहा कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया। 95% कोशिकाओं की (567 कोशिकाओं की गिनती के 540 में से) व्यवहार्य हो पता चला(हरा) रिहाई के बाद। मृत कोशिकाओं को लाल रंग में चिह्नित कर रहे हैं। (बी) PIPAAm लेपित स्लॉट फिल्टर से रिहा कोशिकाओं के दिन 10 संस्कृति के माध्यम से दिन 3। कोशिकाओं व्यवहार्य और संस्कृति में विस्तार बनी रही। स्केल बार = 100 संदर्भ में 15 से अनुमति के साथ μm.Reproduced। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: ताकना पैरामीटर पूर्व और बाद PIPAAm कोटिंग का मापन स्लॉट फिल्टर (ए) पूर्व और (बी) के बाद PIPAAm कोटिंग की Brightfield छवियों।। (सी) ताकना लंबाई ± 2.1% 7.3% की कमी हुई थी के बाद PIPAAm कोटिंग और ताकना चौड़ाई PIPAAm कोटिंग के बाद ± 5.6% 15.3% की कमी की गई थी। संदर्भ 15 से अनुमति के साथ Reproduced।यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: एरिथ्रोसाइट्स और leukocytes दूषित कोमल Washes से हटा रहे हैं लगभग 1,000 SKBr-3 कोशिकाओं PIPAAm लेपित स्लॉट फिल्टर द्वारा खून से लिया गया है और एक 48 अच्छी तरह से थाली पर चढ़ाया गया।। (ए) संस्कृति में 16 घंटा में SKBr -3 ट्यूमर कोशिकाओं, संस्कृति प्लेट (हरी तीर) का पालन किया apoptotic एरिथ्रोसाइट्स और ल्यूकोसाइट्स जबकि भी प्लेट (लाल तीर) के तल पर बसने थे। (बी) के बाद धोने, गैर पक्षपाती कोशिकाओं को हटा दिया गया, प्लेट (हरी तीर) पर पक्षपाती ट्यूमर कोशिकाओं को छोड़कर। संदर्भ 15 से अनुमति के साथ Reproduced। कृपयायह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका 1:। कब्जा, जारी है और PIPAAm लेपित स्लॉट फिल्टर की बहाली क्षमता दक्षता पर कब्जा = सेल नंबर रिलीज / सेल नंबर से पहले फिल्टर पर कब्जा कर लिया खून में नुकीला। दक्षता = सेल नंबर फिल्टर / सेल रिलीज होने से पहले फिल्टर पर कब्जा कर लिया संख्या से जारी रिलीज। रिट्रीवल दक्षता = फिल्टर / सेल नंबर से रिहा सेल नंबर संदर्भ में 15 से अनुमति के साथ blood.Reproduced में नुकीला।
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Discussion
पूरे रक्त से व्यवहार्य सीटीसी पर कब्जा करने और उन्हें Microfilter से जारी करने की प्रक्रिया अपेक्षाकृत सरल है; हालांकि कुछ महत्वपूर्ण बिंदुओं उल्लेख के लायक हैं। यह आवश्यक है, कि एक बाँझ हालत पूरी प्रक्रिया के माध्यम से बनाए रखा है सभी सेल संस्कृति के साथ के रूप में। के रूप में फिल्टर से कोशिकाओं को रिहा करने की तकनीक के लिए आधार PIPAAm के तापमान उत्तरदायी इंटरफेसियल गुण शोषण पर आधारित है PIPAAm के साथ फिल्टर कोटिंग की प्रारंभिक कदम है, महत्वपूर्ण है। यह सुनिश्चित करने के लिए फिल्टर प्रभावी रूप से लेपित किया गया है, कोटिंग करने से पहले एक खुर्दबीन के नीचे फिल्टर पर एक ताकना (चौड़ाई और एक स्लॉट ताकना की लंबाई) के आकार को मापने के लिए और उसके बाद फिर से एक छेद के आकार पद कोटिंग मापने। ताकना आकार दोनों चौड़ाई और लंबाई (चित्रा 4) पर 1μm से कम किया जाना चाहिए। के रूप में उल्लेख किया है, जबकि सीटीसी कुशलता से कब्जा स्लॉट फिल्टर, भी कुछ बड़े PBMC कोशिकाओं को दर्शाता है, लेकिन इन कोशिकाओं गैर पक्षपाती कोशिकाओं और इस तरह Duri हैंएनजी कदम 3.13 संस्कृति पक्षपाती कैंसर की कोशिकाओं को पीछे छोड़ रहा है (चित्रा 5) से हटा रहे हैं।
प्रोटोकॉल को मामूली संशोधनों यदि रक्त के विभिन्न संस्करणों के मामलों में फ़िल्टर किया जा करने के लिए या जब चिपचिपापन अत्यंत उच्च है जरूरत हो सकती है। HBSS के साथ 1: के रूप में प्रोटोकॉल में उल्लेख किया है, यह रक्त 1 को कमजोर करने के लिए महत्वपूर्ण है। खून की चिपचिपाहट, रोगी से रोगी को बदलता है लेकिन सबसे अधिक भाग के लिए इस छानने का काम प्रभावित नहीं होगा। वहाँ कुछ मामलों होगा जब चिपचिपापन बहुत अधिक है या बड़े थक्के, वर्तमान जो मामले में सिरिंज पंप फिल्टर के माध्यम से रक्त के लिए मजबूर करने में सक्षम नहीं होगा रहे हैं। यह सिरिंज पंप को रोकने के लिए, सिरिंज से कैसेट छुड़ाना, कैसेट के शीर्ष भाग खुला है, लेकिन अभी भी नीचे हिस्से से जुड़ी फिल्टर छोड़ इन मामलों में सलाह दी है। बड़े रक्त के थक्के फिल्टर पर आसानी से देखा जा सकेगा। धीरे फिल्टर पर HBSS के 1 एमएल पिपेट एक मामूली आंग पर कैसेट जबकि पकड़ेLe थक्का दूर धोने के लिए अनुमति देने के लिए। एक बार जब थक्का हटा दिया गया है, कैसेट बंद यह सिरिंज के लिए फिर से संलग्न हैं और छानने का काम जारी है।
PIPAAm लेपित फिल्टर बैचों में बनाया जा सकता है और बाद में उपयोग के लिए भंडारित किया, हमने पाया है कि इन पूर्व लेपित फिल्टर की शेल्फ जीवन लगभग 3 महीने है। प्रभावी कब्जा है और कोशिकाओं की रिहाई के समय के साथ PIPAAm अपमानजनक की वजह से भाग में कम किया जा सकता है।
सीमित कारकों में से एक मरीज को सीटीसी से एक संस्कृति स्थापित करने के लिए है कि रक्त के नमूने में मौजूद हैं सीटीसी की संख्या में झूठ होगा। कम संख्या होने की संभावना बहुत ही मुश्किल असंभव नहीं तो कोशिकाओं का विस्तार करने की क्षमता कर देगा। हालांकि, छोटे संस्कृति के क्षेत्रों में कम सेल की गिनती के साथ एक नमूना sequestering इस तरह के 96 अच्छी तरह से थाली के बजाय एक 6 अच्छी तरह से थाली का एक भी अच्छी तरह के रूप में, मदद मिल सकती है। संस्कृति मीडिया, या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मीडिया के संशोधन की पहचान, कि के लिए इष्टतम वातावरण प्रदान करेगाइन कोशिकाओं को विकसित करने के लिए अनुसंधान में एक और चुनौती को पार करना होगा है।
सीटीसी की आणविक और सेलुलर विश्लेषण के कैंसर रोग का निदान के लिए बहुमूल्य जानकारी प्रदान करते हैं और ड्राइव सटीक दवा 15 मदद मिल सकती है। कब्जा फिल्टर से रिहा कोशिकाओं की व्यवहार्यता दवा संवेदनशीलता और स्क्रीनिंग टेस्ट के लिए संस्कृति रोगी सीटीसी करने की क्षमता की ओर एक महत्वपूर्ण विकास है। यह लंबे समय से ज्ञात किया गया है कि सीटीसी प्राथमिक ट्यूमर से आवश्यकता दोनों के हिसाब से इलाज के लिए अलग-अलग है और इस तरह करते हैं। एक उदाहरण के रूप में, Schneeweiss एट अल। खबर दी है कि metastatic स्तन कैंसर (अति पिछड़े वर्गों) में, मेटास्टेटिक ऊतक और प्राथमिक ट्यूमर के प्रतिजन प्रोफाइल रोगियों का 20% तक में मतभेद है। मानव epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर 2 (HER2) अभिव्यक्ति सहित भविष्य कहनेवाला मार्कर, के पुनर्मूल्यांकन के अति पिछड़े वर्गों के उपचार अनुकूलन करने के लिए मदद कर सकता है। जबकि ऊतक के नमूने आक्रामक और अक्सर दोहराने के लिए मुश्किल है, सीटीसी विश्लेषण केवल रक्त के नमूने की आवश्यकता है और एक आसान करने के लिए दोहराने, वास्तविक समय & # प्रदान हो सकता है34; तरल बायोप्सी दृष्टिकोण "22।
तकनीक का एक प्रमुख महत्व तथ्य यह है कि, जबकि कई प्लेटफार्मों आमतौर पर सीटीसी कब्जा में इस्तेमाल किया और विश्लेषण आणविक और सेलुलर विश्लेषण में सीमित कर रहे हैं के रूप में एक लगानेवाला नमूना प्रसंस्करण के लिए आवश्यक है, या सीटीसी मंच पर स्थिर रहे हैं में निहित है। इसके अलावा, समानता आधारित प्रणाली है, जो व्यवहार्य सीटीसी को पकड़ने और रिहाई के लिए अनुमति देने के संभावित लक्ष्य प्रतिजन 15 के चुनाव से पक्षपातपूर्ण हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, PIPAAm कोटिंग के साथ स्लॉट फिल्टर प्रभावी और कब्जा है और व्यवहार्य सीटीसी की रिहाई पूरे रक्त से करने में कुशल है कि एक लेबल मुक्त मंच प्रदान करता है। इस विधि व्यवहार्य सीटीसी के आगे लक्षण वर्णन, एकल कोशिका प्ररूपी और जीनोमिक विश्लेषण के साथ ही पूर्व vivo सीटीसी संस्कृति सहित के लिए क्षमता प्रदान करता है।
काम वर्तमान में नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए इस तकनीक को रोजगार के लिए चल रहा है। प्रभावी ढंग से Patien संस्कृति सीटीसी करने की क्षमताटी नमूने एक मरीज पर प्रभावी उपचार रेजिमेंटों के निर्माण के लिए नेतृत्व आधार रोगी, नई दवा लक्ष्यों को पता चलता है, और प्रभावी केमोथेरापी के विकास के लिए नेतृत्व करने के लिए होगा।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slot Filter | Circulogix Inc. | MSF-01 | Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com) |
| poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) | Ploysciences Inc. | 21458 | Non-Hazardous. Store at room temp. |
| 1-Butanol | Sigma Aldrich | B7906 | Use in well ventilated area |
| Plastic Microscope Slides | Cole-Parmer | 48510-30 | Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square |
| Spin Coater | Specialty Coating Systems | SCS G3 Spin Coater | Instrument |
| Polyimide Tape | Uline | S-7595 | Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com) |
| HBSS- Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Falcon Petri dishes 35 x 10 mm | VWR | 25373-041 | |
| Microfilter Cassette | Circulogix Inc. | FC-01 | Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine |
| Syringe 20 ml | BD Scientific | 302830 | |
| Syringe Pump | KD scientific | 78-0100V | Any syringe pump capable of holding a 25 ml syringe may be used |
| Cellstar 50 ml Centrifuge tube | VWR | 82050-322 | |
| Greiner Bio One 6 well plate | VWR | 89131-688 | Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant |
| SKBR3 Cells | ATCC | HTB-30 | |
| Live Dead Assay | Life Technologies | L3224 | Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work |
| Cell Culture Incubator | VWR | 98000-368 | Any incubator that can be used for cell culture will suffice |
References
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