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Cancer Research

Cattura e rilascio di vitali circolanti cellule tumorali del sangue

doi: 10.3791/54435 Published: October 28, 2016

Summary

Un protocollo di utilizzare un poli (N--ISO propylacrylamide) (PIPAAm) microfiltro rivestito per la cattura e il rilascio efficace thermoresponsive delle cellule tumorali circolanti vitali (CTC) è presentato. Questo metodo permette la cattura di CTC dal sangue dei pazienti e il successivo rilascio di valida CTC per la cultura a valle off-chip, analisi e caratterizzazione.

Abstract

Abbiamo dimostrato un metodo per la cattura dimensioni base di vitale cellule tumorali circolanti (CTC) da sangue intero, insieme con il rilascio di queste cellule dal circuito integrato di analisi e / o di cultura downstream. La strategia impiega l'uso di un romanzo Parylene C poro fessura membrana microfiltro per catturare CTC ed un rivestimento di poli (N--ISO propylacrylamide) (PIPAAm) per thermoresponsive rilascio praticabile della CTC catturato. La cattura di cellule vive è abilitata sfruttando la progettazione di una geometria dei pori dello slot con dimensioni specifiche per ridurre la sollecitazione di taglio tipicamente associati con il processo di filtrazione. Mentre il microfiltro presenta una elevata efficienza di cattura, il rilascio di queste cellule non è banale. Tipicamente, solo una piccola percentuale di cellule vengono rilasciati quando si utilizzano tecniche come flusso inverso o raschiatura cellulare. L'adesione di queste cellule tumorali epiteliali alla membrana parylene C è attribuibile alla interazione elettrostatica non specifico. Per contrastare °è effetto, abbiamo impiegato l'uso di rivestimento PIPAAm e sfruttato le sue proprietà interfacciali reattivi termiche per rilasciare le cellule dal filtro. Sangue viene prima filtrato a temperatura ambiente. Sotto 32 ° C, PIPAAm è idrofila. Successivamente, il filtro è posizionato o nel mezzo di coltura o un buffer mantenuta a 37 ° C, che determina la rotazione PIPAAm idrofobica, e successivamente rilasciare le cellule elettrostaticamente rilegati.

Introduction

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La malattia metastatica è responsabile per la maggior parte delle morti per cancro. Lo sviluppo di biomarker diagnostici prognostica e compagno di metastasi è cruciale nella gestione e trattamento del cancro. cellule tumorali circolanti (CTC) svolgono un ruolo centrale nella diffusione del tumore e metastasi. Inoltre, essendo facilmente accessibile come una 'biopsia liquida' biomarcatore, CTC nei pazienti affetti da cancro 'sangue periferico è in aumento come un' covo 'per la ricerca sul cancro biomarcatore. CTC sono stati ben convalidato come un biomarcatore prognostico in varie impostazioni di cancro, compresi seno, alla prostata e il cancro colorettale 1-3. Tuttavia, i recenti progressi nel campo CTC ha indicato che la mera enumerazione di queste rare cellule ha limitato utilità clinica, come dimostrato in studi clinici interventistici 4. Pertanto, vi è una necessità emergente di tecnologie che consentono la caratterizzazione molecolare e funzionale di CTC. Attualmente, solo alcune tecnologie esistenti che consentono FOR non antigene di parte, la cattura vitale e rilascio di CTC, consentendo robusto valle molecolare e funzionale analisi 5,6. Maggior parte di questi dispositivi microfabbricati sono accoppiati alle piattaforme microfluidica ed avere quindi un fattore limitante nella quantità di sangue che possono essere trasformati, che varia da 2-4 ml 7 - 10. CTC sono eventi rari in un singolo tubo di prelievo di sangue (7,5 ml), quindi riducendo ulteriormente la quantità di sangue che può essere elaborato, ostacola notevolmente le possibilità di catturare e isolare queste cellule di interesse.

Abbiamo sviluppato due tipi di dispositivi di microfiltri membrana parylene C per la cattura di CTC che sfruttano le differenze di dimensione tra cellule tumorali più grandi e più piccoli normali globuli 11,12. Abbiamo precedentemente riportato sul filtro pori enumerazione rotonda e lo ha confrontato con una piattaforma approvato dalla FDA, in cui il microfiltro ha dimostrato di essere superiore in CTC efficienza di catturaper i campioni di sangue dei pazienti di cancro 13,14. Tuttavia, una limitazione del filtro rotondo è la necessità di utilizzare un fissativo a base di formaldeide prima della filtrazione. Questo processo conserva la morfologia delle cellule, consentendo loro di resistere alla sollecitazione di taglio e pressione durante il processo di filtrazione. Mentre enumerazione e studi molecolari possono essere eseguite on-chip 13, il fissativo compromette la capacità di eseguire la caratterizzazione funzionale. Per far fronte a questa limitazione, abbiamo sviluppato un filtro pori slot che nega la necessità di fissare le cellule prima della filtrazione (Figura 1). La geometria dei pori di slot (6 micron di larghezza x 40 micron di slot lunghezza pori) permette alle cellule tumorali di essere catturati mentre solo parzialmente occlude un poro e quindi ancora permettere il libero passaggio per le altre cellule del sangue e alleviare l'aumento della pressione che porterebbe a danni cellulari ed eventuale scoppio 15,16 La cartuccia del poro slot è composto da 2 pezzi acrilico che paninoil filtro pori fessura tra la parte superiore e inferiore con Polidimetilsilossano (PDMS) fungente da guarnizione per fornire una perdita sigillo 14,15 (figura 1).

Mentre l'efficienza di cattura del filtro pori slot è elevata, (Tabella 1), il catturato CTC sono legati alla membrana Parylene C da forti non specifiche interazioni elettrostatiche invece di matrice extracellulare (ECM) adesione 15 mediata. Metodi come flusso inverso o l'uso di raschietti cellule non riescono a rilasciare efficacemente le cellule dal filtro, o provocare danno cellulare e morte cellulare. Abbiamo esplorato un uso non convenzionale di PIPAAm di formulare una strategia di rilascio 15. PIPAAm è un polimero che subisce una transizione di fase reversibile temperatura della soluzione critica più bassa (LCST) ad una temperatura della soluzione di 32 ° C 17. Tradizionalmente, questa proprietà di PIPAAm è stato ampiamente esplorato per applicazioni di ingegneria tissutale. Tipicamente, le cellule sonosuperfici coltivate su PIPAAm rivestito a 37 ° C quando PIPAAm è idrofoba. Le cellule possono quindi essere staccate come un foglio quando la temperatura coltura viene spostata al di sotto 32 ° C, dove la superficie rivestita PIPAAm diventa idratato 17,18. Abbiamo sfruttato questa proprietà termica eseguendo il processo di filtrazione a temperatura ambiente (inferiore a 32 ° C) e quindi consentire il rilascio delle cellule posizionando il filtro in terreni di coltura mantenuto a 37 ° C. A questa temperatura, lo strato di polimero PIPAAm diventa idrofobo, liberando così il cellule elettrostaticamente legato 15 (Figura 1).

Sebbene il metodo sensibile alla temperatura, nonché altri metodi sono stati implementati con successo per raggiungere cattura CTC vitali e rilasciare 19 - 21, una chiave potenziale svantaggio condivisa da queste tecnologie riportati è che tutti impiegano un principio antigene-dipendente per la cattura CTC. cattura CTC base di Antigen, come mostrato previously, può portare a parziale CTC analisi 11,14. Ad esempio, molte tecnologie di affinità basata impiegano anticorpo che si lega EpCAM per la cattura CTC. Tuttavia, CTC ha mostrato di esprimere diversi livelli di EpCAM, portando ad omissione di EpCAM bassa e EpCAM negativo CTC da queste tecnologie. Inoltre, le limitazioni possono verificarsi quando CTC di origine non epiteliale è di interesse, come ad esempio CTC nelle impostazioni di melanoma e sarcoma. Così, una tecnologia che permette di vitale cattura e rilascio CTC senza potenziale distorsione introdotta da antigene-capture based è altamente auspicabile.

È importante sottolineare che il dispositivo di cattura microfiltro è puramente dimensionato in base e la strategia di rilascio è agnostico per la presenza di alcuni marcatori di superficie. Noi crediamo che l'impiego del microfiltro rivestito PIPAAm aiuterà a espandere la nostra comprensione del processo metastatico, fornendo la capacità di catturare e rilasciare CTC per le analisi a valle in modo efficace ed efficiente. Questo può potenteesporre buona resa nuove molecole per le quali nuove terapie mirate sistemiche possono essere diretti, oltre a fornire un biomarker che può essere monitorato in modo semplice e aiuto nel cancro gestione del paziente.

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Protocol

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Etica Dichiarazione: Per proteggere i diritti dei soggetti umani, i campioni di sangue sono stati ottenuti a seguito di un consenso informato secondo protocolli approvati dalla University of Miami revisione istituzionale tavole sotto IRB 20.150.020.
NOTA: Il sangue da filtrare per la cattura CTC deve essere raccolto in un tubo EDTA per prevenire la coagulazione.

1. Rivestimento il microfiltro con Poli (N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)

  1. Pesare PIPAAm preparare un 10% w / v in butanolo. Mescolare con un vortice fino a quando la soluzione è chiara.
  2. microscopio Cut plastica scivola in circa 12 mm x 12 mm quadrati sia con un paio di forbici o lama affilata. In alternativa usare una ghigliottina.
    NOTA: Queste piazze serviranno come supporto per i filtri durante il processo di spin coating.
  3. Utilizzando un paio di forbici affilate regolo, tagliare lo slot pori microfiltro wafer in 8 millimetri x 8 mm quadrati.
  4. Utilizzando un nastro di pellicola poliimmide garantire i filtri di taglio sul squa plasticares precedentemente tagliato in fase 1.3. Applicare la pellicola solo il bordo e l'angolo del filtro in modo che almeno 7 mm x 7 mm di superficie filtrante è un-coperta dal nastro.

figura 2
Figura 2:. Rappresentante Illustrazione del microfiltro set-up per PIPAAm Coating 8 millimetri microfiltro x 8 mm deve essere posto sul 12 millimetri taglio x 12 mm plastica quadrato da un vetrino da microscopio di plastica. Nastro poliimmide viene utilizzato per fissare il microfiltro in atto per far girare il cappotto PIPAAm.Reproduced con il permesso di riferimento 15. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Posizionare il microfiltro che viene fissato sul quadrato di plastica, sul mandrino di vuoto dello spin-coater.
  2. Programmare lo spin-verniciatore per la seguente ricetta: Start, 500 rpm per 10 secondi, 6.000 giripm per 60 sec, 500 rpm per 10 secondi, Stop.
  3. Erogare abbastanza 10% w / v soluzione PIPAAm (preparato in 1.1) per coprire completamente la superficie microfiltro utilizzando una pipetta di trasferimento plastica standard e avviare il dispositivo a induzione di spin.
  4. Rimuovere il microfiltro PIPAAm rivestito dallo spin-verniciatore dopo il processo di rivestimento è stato completato. Lasciare il filtro attaccato al quadrato di plastica durante la conservazione.
    NOTA: Il rivestito-filtro può essere conservato a temperatura ambiente per un massimo di 3 mesi.

2. Montaggio di filtrazione a cassetta con Microfiltro PIPAAm Coated

  1. Reidratare PIPAAm microfiltro rivestito a temperatura ambiente posizionando il microfiltro ancora fissato sulla piazza di plastica in una capsula di Petri. Aggiungere 1x PBS fino a quando il microfiltro è completamente sommerso e lasciare riposare per 5 minuti.
  2. Dopo la fase di idratazione, rilasciare il filtro dalla piazza plastica tagliando il nastro poliimmide film utilizzando un paio di forbici.
    NOTA: Prendere nota di quale lato del filtro presentail rivestimento PIPAAm.
  3. Assemblare il microfiltro nella cassetta filtrazione, sovrapponendoli il microfiltro tra il pezzo acrilico superiore e inferiore insieme con i pezzi 2 polidimetilsilossano (PDMS) agisce come una guarnizione / tenuta. Bloccare la cassetta acrilico con clip per fissare il filtro e fornire una tenuta ermetica.
    NOTA: Il rivestimento PIPAAm deve essere rivolto verso l'alto, così come il campione viene filtrato attraverso, le cellule saranno catturate PIPAAm superficie rivestita del filtro (Figura 1).

3. Filtrazione di campione di sangue con la cattura e rilascio del CTC dal microfiltro

  1. Come ogni marca pompa a siringa ha una propria interfaccia utente, fare riferimento al manuale d'uso della pompa e programmare la pompa a siringa a scorrere ad una velocità di 75 ml / ora e impostare il volume a 20 ml.
  2. Caldi 3 ml di supporto (disponibile in commercio) coltura cellulare di McCoy (preparati aggiungendo nel 10% siero fetale bovino e 1% penicillina e streptomicina) a 37 ° C.
  3. Aggiungere 7,5 ml di soluzione salina bilanciata di Hank disponibile in commercio (HBSS) a 7,5 ml di sangue campione e aspirare il sangue diluito in una siringa da 25 ml.
    NOTA: regolare il volume di HBSS modo che il campione di sangue viene diluito con uguale volume di 1: 1 con HBSS esempio, se viene utilizzato 10 ml di sangue, quindi mescolare con pari volume di 10 ml HBSS per raggiungere l'1:. Diluizione 1.
  4. Innestare la cassetta di filtrazione con la siringa e posizionarlo sulla pompa a siringa. Posizionare un tubo da 50 ml a fondo per raccogliere il flusso attraverso e avviare la pompa.
    NOTA: La filtrazione dovrebbe prendere circa il 10- 12 min. Tutte le fasi di filtrazione vanno effettuatefuori a normale temperatura ambiente (20-25 ° C) tra cui passo 3.8
  5. Dopo filtrazione è completa, sganciare la cassetta filtrazione prendere appunti quale lato è all'inizio che ha le cellule catturati sulla superficie PIPAAm rivestita. Aspirare 1 ml di terreni di coltura caldo in una nuova siringa.
  6. Re-impegnarsi la cassetta filtrazione con la siringa contenente il supporto, ma in questo momento impegnarsi l'estremità inferiore della cassetta in modo che il PIPAAm rivestito superficie del filtro sia rivolta lontano dalla siringa.
    NOTA: Questo sarà per liberare tutte le cellule che possono essere incorporati nei pori di slot applicando delicato flusso inverso.
  7. Posizionare la siringa indietro sulla pompa a siringa e tenere una piccola scatola di Petri o 6-pozzetti proprio sotto la cassetta di filtrazione. Impostare la velocità di flusso di 100 ml / h e avviare la pompa.
  8. Far passare tutti i media attraverso il filtro e raccogliere il flusso continuo nella capsula di Petri. Attendere che tutti i mezzi di comunicazione di passare attraverso e quindi arrestare la pompa e rimuovere la siringa unnd filtrazione cassette dalla pompa.
  9. Sganciare la cassetta filtrazione dalla siringa e aprirla per recuperare il filtro dalla cassetta. Posizionare il filtro con la superficie PIPAAm rivolto verso il basso nella stessa capsula di Petri utilizzato per raccogliere il flusso inverso quando si rilascia le cellule dai pori. Aggiungere il resto dei media caldi e la capsula di Petri in un incubatore a 37 ° C.
  10. Dopo 30 minuti tutte le cellule verranno rilasciati dal filtro. Tuttavia, lasciare filtro nella capsula di Petri fino a 24 ore per garantire tutte le cellule si staccano.
    NOTA: In alternativa, le cellule rilasciati possono essere raccolti in una provetta di effettuare ulteriori analisi a valle come la PCR, ELISA, Western Blot per citare alcuni esempi.
  11. Dopo 24 ore di cultura, rimuovere con attenzione il microfiltro con pinze.
    NOTA: Il filtro può essere scartata in questo momento come le cellule sono stati liberati da esso.
  12. pipettare delicatamente il terreno di coltura su e giù con un & # 1000181; l pipetta, di ri-sospendere i eritrociti e periferiche cellule mononucleate del sangue (PBMC) che vengono catturati sul filtro e rilasciato nella piastra con il CTC. Eseguire accuratamente e delicatamente questa azione per evitare il distacco delle cellule tumorali liberamente iscritti. Rimuovere con attenzione l'intero terreno contenente gli eritrociti ri-sospeso e PBMC, lasciando alle spalle le cellule tumorali in allegato e sostituire con terreno fresco pre-riscaldato a 37 ° C.
    NOTA: Questa operazione può essere ripetuta una volta, se eritrociti eccessive sono presenti dopo un lavaggio.

4. CTC Viabilità valutazione

  1. Valutare colta vitalità CTC utilizzando un Live / Assay Morto 8.
    NOTA: Numerosi live / saggi morti sono disponibili in commercio. Dopo il protocollo del produttore è altamente consigliato. Si prega di fare riferimento alla lista materiali / reagenti per il kit di analisi commerciale utilizzato per questo esperimento.

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Representative Results

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Utilizzando il sangue donatori sani '(ottenuto con un protocollo approvato dalla University of Miami IRB 20.150.020 a seguito di un consenso informato) a spillo con le cellule tumorali in coltura, la tecnica thermoresponsive per il rilascio di cellule vitali circolanti tumorali (CTC), la cattura raggiunto, il rilascio e l'efficienza di recupero del 94% ± 9%, 82% ± 5% e 77% ± 5% rispettivamente (Tabella 1) 15. In confronto, l'efficienza rilascio e il recupero dei filtri non rivestiti erano significativamente più bassi (7% ± 1% di efficienza di rilascio e il 6% ± 1% di efficienza di recupero) (Tabelle 1) 15. Per valutare la vitalità delle CTC rilasciati dal filtro, ~ 1000 SK-BR-3 cellule sono stati addizionati in 7,5 ml di sangue del donatore sano, filtrata attraverso il filtro fessura rivestito PIPAAm e rilasciato mediante il metodo sopra descritto. Un test Live / Morto è stata effettuata per valutare la vitalità cellulare prima di picco in sanguee dopo il rilascio. La fattibilità di pre-picco è stato del 98% (592 su 602 cellule contate) e la vitalità delle cellule catturati e rilasciati dal sangue è stata del 95% (540 su 567 cellule contate) 15 (Figura 3A). In parallelo, le cellule catturato e rilasciato post-filtrazione dal campione di sangue sono state coltivate in terreno di coltura 5A McCoy. Le immagini sono state prese a giorno 3 e il giorno 10. Come mostrato in figura 3B, cellule rilasciate dal filtro non solo rimasero vitali, ma una rapida espansione in coltura, stabilendo così la filtrazione redditività postale.

Figura 1
Figura 1:. PIPAAm patinata filtri slot per catturare e di circolazione di uscita cellule tumorali del sangue (Pannello superiore) (A) Brightfield immagine di PIPAAm filtro fessura rivestito; (B) Filtrazione di sangue intero per la cattura CTC. (C) Schema di tegli microfiltro cassette in cui il filtro di slot PIPAAm rivestito è inserita tra la parte superiore e la cassetta inferiore. (Pannello inferiore) (D) Schema del processo di rilasciare catturato CTC dai filtri di slot PIPAAm rivestiti. Riprodotto con il permesso di riferimento 15. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Le cellule tumorali del seno Capture, rilascio e coltura di cellule tumorali vitali (SKBr-3) a spillo in normali donatori di sangue sono stati catturati e rilasciato utilizzando un microfiltro PIPAAm rivestito: Figura 3.. Le cellule sono rimaste rilascio posta valida ed espanse in coltura rapidamente. (A) assay Live-morti eseguito sulle cellule rilasciate dal filtro. 95% (540 su 567 cellule contate) delle cellule ha mostrato di essere vitali(Verde) dopo il rilascio. Le cellule morte sono etichettati in rosso. (B) 3 ° giorno attraverso giorno 10 la cultura delle cellule rilasciate dal filtro fessura PIPAAm rivestito. Le cellule sono rimaste vitali e ampliato nella cultura. Barra di scala = 100 μm.Reproduced con il permesso di riferimento 15. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: Misura del Pore parametri pre e post PIPAAm Coating immagini in campo chiaro di filtro fessura (A) prima e (B) post-rivestimento PIPAAm.. Lunghezza (C) Pore è diminuita del 7,3% ± 2,1% dopo il rivestimento e pori PIPAAm larghezza è stata ridotta del 15,3% ± 5,6% dopo il rivestimento PIPAAm. Riprodotto con il permesso di riferimento 15.Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5: contaminanti eritrociti e leucociti vengono rimossi da dolci lava Circa 1.000 SKBr-3 cellule sono state recuperate dal sangue dal filtro fessura PIPAAm rivestito e sono stati piastrati su una piastra a 48 pozzetti.. (A) a 16 ore in coltura, le cellule tumorali SKBr-3 aderito alla piastra di coltura (frecce verdi), mentre eritrociti e leucociti apoptotici sono stati anche depositando sul fondo della piastra (frecce rosse). (B) post-lavaggio, le cellule non aderenti sono state rimosse, lasciando le cellule tumorali aderenti sulla piastra (frecce verdi). Riprodotto con il permesso di riferimento 15. Si pregaclicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1
Tabella 1:. Cattura, di rilascio e recupero efficienza di PIPAAm Filtri Slot patinata Capture efficienza = numero di cellule catturate sul filtro prima numeri rilascio / cellule spillo in sangue. Rilasciare efficienza = numero di cellule rilasciate dai numeri filtro / cellulari catturati sul filtro prima del rilascio. Efficienza Recupero = numero di cellule rilasciate dai numeri filtro / cellulari a spillo in blood.Reproduced con il permesso di riferimento 15.

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Discussion

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Il processo di acquisizione vitali CTC dal sangue intero e rilascio dal microfiltro è relativamente semplice; tuttavia alcuni punti critici sono degni di nota. È indispensabile, come tutte coltura cellulare che una condizione sterile viene mantenuta attraverso l'intero processo. La fase iniziale del rivestimento del filtro con PIPAAm è critica, come base per la tecnica di rilasciare le cellule dal filtro si basa sullo sfruttamento di temperatura reattivi proprietà interfacciali del PIPAAm. Per assicurare il filtro è stato rivestito in modo efficace, misurare le dimensioni di un poro (larghezza e lunghezza di un poro cava) sul filtro al microscopio prima del rivestimento e poi ancora misurare un rivestimento misura del perno pori. La dimensione dei pori deve essere ridotta del 1μm sia la larghezza e la lunghezza (Figura 4). Come accennato, il filtro slot durante la cattura CTC efficiente, cattura anche alcuni grandi cellule PBMC, tuttavia queste cellule sono cellule non aderenti e così during passo 3.13 vengono rimossi dalla coltura lasciando le cellule tumorali aderenti (Figura 5).

Piccole modifiche al protocollo possono essere necessari se diversi volumi di sangue devono essere filtrati o in casi in cui la viscosità è estremamente elevato. Come indicato nel protocollo, è fondamentale per diluire il sangue 1: 1 con HBSS. La viscosità del sangue varia da paziente a paziente, ma per la maggior parte questo non influenzerà la filtrazione. Ci saranno alcuni casi in cui la viscosità è troppo alta o grandi coaguli sono presenti, nel qual caso la pompa a siringa non sarà in grado di forzare il sangue attraverso il filtro. Si consiglia in questi casi di fermare la pompa a siringa, sganciare la cassetta dalla siringa, aprire la parte superiore della cassetta, ma lasciare il filtro ancora attaccato alla parte inferiore. Grandi coaguli di sangue saranno facilmente visibili sul filtro. pipettare delicatamente 1 ml di HBSS sul filtro mentre si tiene la cassetta con una leggera angle per consentire il coagulo per lavare via. Una volta che il coagulo è stato rimosso, chiudere la cassetta, re-impegnarsi alla siringa e continuare filtrazione.

Mentre i filtri PIPAAm flessibili possono essere effettuate in batch e memorizzati per un uso successivo, abbiamo trovato che la durata di questi filtri pre-rivestito è di circa 3 mesi. La cattura e il rilascio delle cellule efficaci possono essere diminuiti, in parte a causa del degrado PIPAAm nel corso del tempo.

Uno dei fattori limitanti per stabilire una cultura da paziente CTC si trovano nel numero di CTC che sono presenti nel campione di sangue. Numeri bassi probabilmente farà la capacità di espandere le cellule estremamente difficile, se non impossibile. Tuttavia, sequestrando un campione con conta di cellule bassi in aree più piccole coltura può aiutare, ad esempio in un singolo pozzetto della piastra da 96 pozzetti, invece di una piastra 6 bene. L'identificazione di terreni di coltura, o la modifica dei mezzi disponibili in commercio, che fornirà l'ambiente ottimale FOr queste cellule a crescere è un'altra sfida che dovrà essere superato.

Analisi cellulari e molecolari di CTC forniscono informazioni preziose per la prognosi del cancro e può aiutare Precision Drive medicina 15. La vitalità delle cellule rilasciate dal filtro di acquisizione è uno sviluppo fondamentale verso la capacità di cultura paziente CTC per i test di sensibilità ai farmaci e di screening. E 'noto da tempo che CTC tendono a differire dal tumore primario e quindi la necessità di trattare sia conseguenza. Come esempio, Schneeweiss et al. hanno riferito che nel carcinoma mammario metastatico (MBC), profili antigene di tessuto metastatico e tumore primario si differenziano fino al 20% dei pazienti. Rivalutazione dei marcatori predittivi, tra cui il fattore di crescita epidermico umano del recettore 2 (HER2) espressione, potrebbe aiutare a ottimizzare il trattamento MBC. Mentre campionamento tessuto è invasiva e spesso difficile da ripetere, analisi CTC richiede solo un campione di sangue e potrebbe fornire un facile-repeat, in tempo reale e #34; liquido biopsia "approccio 22.

Un importante significato della tecnica risiede nel fatto che, mentre diverse piattaforme comunemente utilizzati nella cattura CTC e le analisi sono limitate nelle analisi molecolari e cellulari come fissativo è necessario per l'elaborazione del campione o il CTC sono immobilizzati sulla piattaforma. Inoltre, i sistemi basati su affinità, che consentono di vitale cattura e rilascio CTC, possono potenzialmente essere influenzati dalla scelta del target l'antigene 15. In alternativa, il filtro fessura con il rivestimento PIPAAm fornisce una piattaforma gratuita un'etichetta che è efficace ed efficiente nella cattura e il rilascio di vitale CTC dal sangue intero. Questo metodo prevede la possibilità per l'ulteriore caratterizzazione di vitale CTC, tra cui singola fenotipiche delle cellule e l'analisi genomica, nonché ex vivo della cultura CTC.

Il lavoro è attualmente in corso di impiegare questa tecnologia per applicazioni cliniche. La capacità di efficace cultura CTC da patient campioni porteranno alla formulazione di reggimenti terapia efficace su un paziente a paziente base, rivelare nuovi bersagli farmacologici, e portare allo sviluppo di chemioterapici efficaci.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Slot Filter Circulogix Inc. MSF-01 Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com)
poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)  Ploysciences Inc. 21458 Non-Hazardous. Store at room temp.
1-Butanol Sigma Aldrich B7906 Use in well ventilated area
Plastic Microscope Slides Cole-Parmer 48510-30 Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square
Spin Coater Specialty Coating Systems SCS G3 Spin Coater Instrument
Polyimide Tape Uline S-7595 Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com)
HBSS- Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14025-092
1x PBS Gibco 10010-023
Falcon Petri dishes 35 x 10 mm VWR 25373-041
Microfilter Cassette Circulogix Inc. FC-01 Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine 
Syringe 20 ml BD Scientific 302830
Syringe Pump KD scientific  78-0100V Any syringe pump capable of holding a 25 ml syringe may be used
Cellstar 50 ml Centrifuge tube VWR 82050-322
Greiner Bio One 6 well plate VWR 89131-688 Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant
SKBR3 Cells ATCC HTB-30
Live Dead Assay Life Technologies L3224 Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work
Cell Culture Incubator VWR 98000-368 Any incubator that can be used for cell culture will suffice

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Cattura e rilascio di vitali circolanti cellule tumorali del sangue
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Rawal, S., Ao, Z., Agarwal, A. Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood. J. Vis. Exp. (116), e54435, doi:10.3791/54435 (2016).More

Rawal, S., Ao, Z., Agarwal, A. Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood. J. Vis. Exp. (116), e54435, doi:10.3791/54435 (2016).

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