Summary
Vi beskriver en æggestokkene fad pad transplantation assay egnet til studier af normale og transformerede epitel af den kvindelige reproduktive tarmkanalen. Musen fedtpude tillader transplantation af store vævsfragmenter, er let tilgængelige for kirurgi og billedbehandling, og giver den gunstigste native miljø for væv af mullerian oprindelse.
Introduction
Transplantationskirurger assays, som involverer indførelse af celler og væv i specifikke steder på kroppen hos mus, udgør en væsentlig tilgang til studier af vævsregeneration og carcinogenese. Orthotopisk transplantationer af celler, det vil sige deres placering i en nativ miljø, er særligt vigtige for karakterisering af voksne stamceller. Eksistensen af mamma stamceller blev først foreslået af transplantation af epitelial brystkirtel fragmenter i kirtel-fri yverfedt puder af mus 1. Indpodning assays til humaniseret muse fedtpude 2 blev anvendt til at rekapitulere den regenerative potentiale og normal udvikling af humane primære bryst epitelceller. Desuden serielle og begrænsende udvanding transplantationer af fænotypisk distinkte celletyper i det ryddet brystfedtpuden var afgørende for at teste selvfornyelse kapacitet og multilineage differentiering af mamma stamceller 3-5 den. Transplantation analyser i combination med genetisk afstamning sporing fremlagt dokumentation af cellen af oprindelse i brystkirtler carcinogenese fem. Nyre kapsel transplantationer er almindeligt anvendt til afprøvning egenskaber af formodede prostata stamceller 6. Ortotopisk transplantation af normalt og neoplastisk mus og human pancreas organoids afslørede gener og pathways ændret i kræft progression 7. Betydningen af det oprindelige miljø er også blevet støttet af demonstration af forskellige regenerering efter indpodninger af svedkirtler i forskellige steder, såsom yverfedt puder, skulder fedtpuder og tilbage hud 8.
Bughulen og ovarie bursa anvendes sædvanligvis som steder for ortotopisk transplantation af epitelceller i kvindelige reproduktive tarmkanalen 9-12. Begge disse metoder har en række begrænsninger. Intraperitoneal injektion af celler fører til deres implantationer i forskellige områder af bughulen, hvorved complicating overvågning cellulær vækst. Endvidere variationer i mikromiljøet, såsom omfanget af vaskularisering, innervation og immun celle repræsentation, kan være ganske betydelig i forskellige områder af bughulen. Den æggestokkene bursa har en meget begrænset mængde, hvilket muliggør injektion af højst 10 pi væske. Dette begrænser i væsentlig grad mængden af celler, der kan indgives. Desuden kan injektioner i æggestokkene bursa være ganske teknisk udfordrende og proceduren kræver en betydelig mængde tid.
For at løse disse begrænsninger, har vi udnyttet de æggestokkene fedt pad egenskaber. Musen æggestokkene fedtpude har en stor størrelse, er tilstødende til ovariet og æggelederen, og er let tilgængeligt med kirurgi. Det er blevet rapporteret, at equin trofoblasten kan transplanteres i musen æggestokkene fedtpude 13. detaljerne i denne metode blev imidlertid ikke beskrevet. Det blev heller ikke rapporteret om dette migThOD kan påføres voksne celler og væv. Her beskriver vi en pålidelig fremgangsmåde til transplantation af muse og humane celler i den kvindelige reproduktive tarmkanalen og viser, at denne metode også kan anvendes til langsigtet organtransplantation.
Protocol
Alle in vivo arbejde beskrevet er godkendt af Cornell University Institutional Animal Care og brug Udvalg.
1. Sample Forberedelserne til æggestokkene Fat Pad Analyser
- Isolering og dyrkning af Primary Tubal epitel (TE) Celler
- Euthanize donor 6- til 8-uger gamle jomfru β-actin-Enhanced Green Fluorescent Protein (EFGP) eller β-actin-Discosoma Red Fluorescent Protein (DsRed) mus ved CO 2 administration efterfulgt af cervikal dislokation. Bekræft vellykket eutanasi med en tå knivspids.
- Placer en individuel musen på et absorberende drapere, ventrale side op, og derefter tørre maven med 70% ethanol. Åbn huden ved at foretage en lateral incision på kroppen midterlinjen og med fingerspidserne trække huden over og under indsnittet mod hovedet og halen af musen.
- Hold peritoneum ved stump pincet og lave et snit med fine sakse til at åbne kropskaviteten. Skub forsigtigt spole af intestine til side og find de reproduktive organer.
- Med fin pincet afhente en livmoderhorn og skæres 0,5 cm over det punkt, hvor livmoderhornene adskilt. Mens du holder livmoderen horn, dissekere væk bindevæv knyttet til uterine horn, uterin rør, æggestok og æggestokkene fedt pad. Placer dissekeret forplantningskanal i en skål med 6 ml sterilt phosphatbufret saltvand (PBS). Fortsæt med den anden reproduktive tarmkanalen.
- Overfør skålen til en biosikkerhed kabinet og vask vævene 3 gange i 6 ml sterilt PBS. Fortsætte arbejdet under en dissektion mikroskop placeret i biosikkerhed kabinet. Grab uterine horn med fine pincet og afbryd uterine horn fra æggelederen ved overskæring ved utero-tubal krydset. Klip æggestokkene slimsæk omkring æggestokken ved hjælp af en 25 G nål.
Bemærk: Når æggestokkene bursa er blevet fjernet, dissektion er færdig, og den enkelte æggelederen forbliver i PBS-opløsning. - Overfør en enkee æggelederen i en 50 pi dråbe PBS til en 3,5 cm skål og hakkekød i 0,1 mm stykker ved hjælp 28 gauge nåle. Overførsel til 200 pi digestionspuffer 1 (Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) F12 (Hams) medium suppleret med 300 enheder mr1 Collagenase og 100 enheder mr1 hyaluronidase) og inkuberes i 1 time ved 37 ° C i en CO 5% 2 inkubator.
- Efter inkubationen tilsættes 1 ml 0,25% trypsin-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og suspendere opløsningen ved hjælp af en 1 ml pipettespids (aka blå spids) 20 gange i 3 minutter. Tilsæt 5 ml + 4 ° C DMEM / F12 (Hams) medium indeholdende 2% føtalt bovint serum.
- Indsamle væv ved centrifugering (600 rcf, 5 min, stuetemperatur (RT)), og der tilsættes 1 ml fordøjelse puffer 2 (DMEM F12 (Hams) medium suppleret med 7 mg ml -1 Dispase II og 10 ug ml -1 deoxyribonuclease I ( DNase I)). Suspender vævspellet 20 gange med hjælp af en 1 ml pipette tis.
- Der tilsættes 5 ml serumfrit komplet muse tubal epitel vækstmedium (M-TE-GM, tabel 1).
- Indsamle cellerne ved centrifugering (600 RCF, 5 min, RT). Tilsæt 1 ml M-TE-GM, suspendere og tælle celler ved hæmocytometer. Seed 1 x 10 5 celler i 1 ml per brønd i en 24-brønds lav fastgørelsesplade og inkuber i M-TE-GM ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator i 4 dage.
- Skift medium hver dag.
- Forbered enkeltcelle-suspensioner af dyrkede primære suspension TE-celler fra p-actin-EGFP eller β-actin-dsRed mus.
- Indsamle TE suspensionskulturer fra 24-brønds lave montagepladerne. Centrifuger (600 rcf, 5 min, RT), og suspendere cellepellets med en ml 0,25% trypsin-EDTA. Inkuber i 10 minutter ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator.
- Stop trypsinaktivitet ved tilsætning af 5 ml DMEM / F12 (Hams) medium indeholdende 5% føtalt bovint serum. Indsamle cellepellets ved centrifugering (600 rcf, 5 min, RT).
- Vask cellepellets to gange med 4 ml kold PBS (4 ° C), der tilsættes 1 ml PBS per celle pellet, og suspendere. Tæl celler ved hæmocytometer og overførsel til 1,7 ml centrifugering rør. Arbejde på is, tilsæt 1 x 10 5 celler til 10 pi PBS, hvorefter der tilsættes 10 pi basalmembranmatrix. Suspender og transportere på is til dyret rummet.
Bemærk: Udfør alle dissektion og vævskultur arbejde i et biosikkerhed skab under sterile forhold.
- Fremstilling af immortaliserede humane cellelinie
- Separat vokse lentivirus-EGFP og -mCherry mærket human immortaliseret ovarie overflade epitel celle lineHIO118 indtil 80 - 90% konfluens på 10 cm skåle ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator.
- Vaske retter to gange med 10 ml PBS, tilsættes 1 ml 0,25% trypsin-EDTA pr skål og inkuberes i 10 minutter ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator. Reaktionen standses ved tilsætning af 10 ml DMEM / F12 (Hams) medium indeholdende 5% føtalt bovint serum. Indsamlecellepellets ved centrifugering (600 RCF, 5 min, RT).
- Vask cellepellets to gange med 10 ml kold PBS (4 ° C), tilsættes 1 ml PBS per cellepellet, og suspendere. Tæl celler ved hæmocytometer og overførsel til 1,7 ml centrifugering rør.
- Arbejde på is, tilsæt 1,0 x 10 6 Lenti-mCherry mærkede celler + 1,0 x 10 6 Lenti-EGFP mærkede celler til 10 pi PBS. Tilsæt 10 pi basalmembranmatrix. Suspender og transportere på is til dyret rummet.
- Fremstilling af æggelederen
- Dissekere individuelle æggeledere fra 6- til 8-uger gamle jomfruelige β-actin-dsRed mus i PBS som beskrevet i trin 1.1.1-1.1.5. Overfør æggeledere enkelt ind i en 200 pi dråbe PBS under en dissektion mikroskop. Forsigtigt rulle ud æggeledere ved hjælp af pincetter og 28 gauge nåle ved at fjerne mesosalpinx, en del af den brede ligament der understøtter segmenter af æggelederen. Placer enkelt æggeledere rullet i en dråbe 200 pi iskold PBS indtil modtagerens æggestokkene fedt pad udsættes og parat til at modtage transplantationen.
2. æggestokkene Fat Pad Transplantation
Bemærk: Desinficer instrumenter mellem hvert dyr kirurgi. Forberede og arrangere alt udstyr på forhånd. Dorsale transplantationer til højre ovarie fedtpude privilegerede da dette undgår milten. Imidlertid kan modtagerne transplantationer i begge æggestokkene fedtpuder.
- Brug syngene mus eller svær kombineret immundefekt (SCID / NCR) mus som modtagere af primære celler. For humane celler, såsom HIO118 celler, brug Nod / SCID / gamma (NSG) mus eller SCID-mus.
- Bedøver recipient mus med en enkelt intraperitoneal injektion af 2,2,2-tribromethanol i en dosis på 0,15 ml / 10 g legemsvægt. Placer dyret på en varmepude, i dyret hætte og bekræft ordentlig bedøvelse ved tab af pedal refleks (tå knivspids). Påfør dyrlæge salve på øjnene for at forebygge tørhed, mensdyr er under anæstesi. Injicere dyret subkutant med den smertestillende ketoprofen i en dosis på 4 mg / g legemsvægt til behandling for smerter efter operation.
Bemærk: Som et alternativ, bruger isofluran til anæstesi. Sende dyret i induktionen kammer og justere ilt flowmeter til 0,8-1,5 l / min, og isofluran fordamper til 2-3%. Fjern bedøvede dyr fra kammeret, lad det trække vejret isofluran fra en maske og sæt ilt flowmeter til 0,4-0,8 l / min, og isofluran fordamper til 1,5%, og derefter starte operationen. - Barber det kirurgiske område med # 40 neglesaks; fjerne hår fra et område 2 gange den kirurgiske område, forberede barberede hud med tre antiseptiske scrubs af povidon-jod, efterfulgt af 70% ethanol, og dække med et sterilt afdækningsstykke.
- Flyt dyret under en dissektion mikroskop placeret i et biosikkerhed skab. Eksponere forplantningskanal ved et snit i dorsomedial position direkte over æggestokkene fedtpuden.
Bemærk: Critical skridt: Præcis hud incision letter sårheling, anbefales brug af en skalpel i trin 2.4. - Ved stump fine tænger trække æggestokkene fedtpude omhyggeligt gennem snittet mod midterlinjen minimere skader på nerver og store blodkar.
Kritisk Trin: Hvis der opstår blødning, stoppe operationen og overveje transplantere til et andet værtsdyr. - Under kontrol af dissektion mikroskop med hjælp fra en 28 gauge skrå nål lave en 2-4 mm dybt indsnit i æggestokkene fedtpuden, 3-4 mm over æggestokkene.
Kritisk skridt: Sørg for, at snittet kun går gennem halvdelen af fedtet pad; punktering hele vejen igennem til undersiden forårsager lækage. Vær hurtig og fortsæt straks efter dette trin. - For celle transplantationer, fylde en sprøjte (30 gauge nål) med 10-20 pi af cellen-basalmembran matrix-blandingen og tilføre fedt pad snit. For æggelederen transplantation, afhente æggelederen with fine pincet og sted i 10 - 20 pi basalmembran matrix holdes på is. Ved hjælp af en 0,1-10 / 20 pi XL gradueret filter spids (forkortet med 3 mm) afhente væv og basalmembran matrix suspension og slip ind i fedt pad snit.
- Vent 5 minutter for basalmembranen matrix at størkne og placere den reproduktive tarmkanalen tilbage i bughinden. Luk musklerne med 2 masker af kirurgisk sutur og huden med to små sår klip eller kirurgisk sutur.
- Gentag trin 2,4-2,8 at omplante en PBS-basalmembran matrix-blandingen i contra-lateral fedt pad af dyret der skal tjene som kontrol.
Kritiske trin: Efter operationen placere dyret på en varmepude, fordi varmetabet er hurtig i bedøvede mus. - Lad dyret komme sig på en varmepude i den indfødte buret og observere dyret indtil helt vågen fra bedøvelsen. Lad ikke et dyr uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde sternal recumbence. Må ikke returnere et dyr, der har gennemgået kirurgi til selskab med andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt.
- Placer en håndfuld af præ-vådt foderpiller inde i buret i tillæg til tørre fødevarer på buret efter operationen. Påfør post-kirurgiske smertestillende hvis det er nødvendigt for de næste par dage og undersøge såret dagligt. Anvend antibiotika i henhold til den godkendte dyr protokollen, hvis sårinfektion opstår. Fjern sårklemmer 10 dage efter operationen, når såret er helt lukket.
3. Histologi og Image Acquisition
- Graft Indsamling og Preservation
- Forbered 4% paraformaldehyd-opløsning ved at blande 26 ml Hedeselskabet 2 O med 4 ml 10x PBS og 10 ml 16% paraformaldehydopløsning.
- Dissekere i en blok, den podet ovarie fedtpude, ovarie, æggeleder, 0,5 cm uterus som beskrevet i trin 1.1.1-1.1.4. Anbring straks i 2 ml 4% paraformaldehyd og løse i 2 timer, ved stuetemperatur. Fra det samme dyr, dissekere den ikke-indpodetkontralaterale æggestokkene fedtpude transplanteret med PBS-basalmembranmatrix blanding som en kontrol (se trin 2.9). Fix og fremgangsmåde på samme måde.
- Efter fiksering vask væv tre gange med PBS i 5 minutter og inkuberes natten over i PBS ved 4 ° C.
- For hele-mount billeddannelse af æggestokkene fedt pad fortsæt til trin 3.2.1.
Bemærk: Efter billedoptagelse væv kan fryses (3.3.1) eller behandles for paraffin indlejring (3.3.2). Inkubation natten over i 30% sucrose i PBS ved 4 ° C forbedrer kvaliteten af frosne væv.
- Billede Acquisition
- Placer hel-mount æggestokkene fedt pad systemer i PBS fyldt retter og billede ved hjælp af et omvendt mikroskop udstyret med epi-fluorescens udlæg og high-definition farvekamera, med 4, 10x mål og et stereomikroskop udstyret med en fluorescens vedhæftet fil, farve kamera og Plan Apo 1xWD70, ED Plan 1.5xWD45 mål.
- Histologi
- Følgendehel-mount billede erhvervelse (3.2.1) placere en 200-500 pi dråbe indlejring medium for frosne vævsprøver på en 2 x 1 cm stykke af laboratorie film og bruge pincet, overføre vævet til drop. Saml filmen ved den ene kant og overføre vævet-medium fald til et 1,8 ml kryogen hætteglas. Luk hætteglasset og fordybe sig i flydende nitrogen. Opbevar frosne væv ved -80 ° C.
- Alternativt fortsætte med standard paraffin indlejring. Brug 20-40 mængder væv volumen for hvert trin.
- Fordybe væv én gang i 65% ethanol i 30 min ved omrystning ved stuetemperatur.
- Fordybe væv gang i 70% ethanol i 30 min ved omrystning ved stuetemperatur. På dette stadium prøver kan opbevares i måneder ved stuetemperatur.
- Fordybe væv gang i 90% ethanol i 30 min ved omrystning ved stuetemperatur.
- Fordybe væv gang i 95% ethanol i 30 min ved omrystning ved stuetemperatur.
- Fordybe væv to gange i absolut ethanol (200 proof) i 30 min ved omrystning ved stuetemperatur. <li> Fordyb væv to gange i chloroform i 30 min, ryster blidt på RT.
- Fordybe væv gang i paraffin i 30 min ved omrystning ved 58 ° C.
- Fordyb væv gang i paraffin for 12 timer, ryster blidt ved 58 ° C.
- Fordybe væv gang i paraffin i 3 timer, ved 58 ° C.
- Placer væv i metal histologi forme og fylde forme med 58 ° C paraffin. Tilføj en plastik histologi kassette på toppen af paraffin og køle ned paraffin til +4 ° C. Uddrag paraffin-tissue blok og opbevares ved stuetemperatur.
Bemærk: Paraffin temperatur må ikke overstige 58 ° C for optimal konservering af væv egnet til immunhistokemisk farvning.
- Alternativt, Forbered dig på Paraffin Indlejring med Specimen Processing Gel.
- Aspirer PBS og overføre hele-mount væv til 70% ethanol. Der inkuberes ved stuetemperatur i 2 timer. I et vandbad, Forvarm prøvebehandling gel til 60 ° C.
- Pipette 200 pi af prøvebehandling gel på et laboratorium film-foret petriskål. Brug af fine dissektion pincet overføre hel-mount væv system til det prøvebehandling gel drop.
- Tillad prøvebehandling gel plug at størkne ved stuetemperatur, eller størkne proppen i 10 minutter ved 4 ° C.
- Placer prøvebehandling gel indlejret væv i histologi væv kassetter klemt mellem biopsi skumpuder. Integrer i paraffin som i trin 3.3.2-3.3.2.10.
Bemærk: prøvebehandling gel indlejring forhindrer tab og tillader bevarelse af små skrøbelige vævsprøver.
Bemærk: Væv frosne eller paraffin indlejring er velegnede til immunhistokemisk farvning 14,15.
Representative Results
Eksperimentelle celler og væv kan nøjagtigt transplanteres ind i æggestokkene fedt pad under en dissektion mikroskop (figur 1). Eksemplerne omfatter primære muse tubal epitel celler afledt fra mus allestedsnærværende udtrykker EGFP (figur 2A) eller DsRed (figur 2B) og humane immortaliserede ovarie overflade epitelceller HIO118 16,17 celler mærket med mCherry og EGFP lentivira (figur 2C - F). Fremgangsmåden er også anvendelig til langsigtet transplantation af organer, såsom muse æggelederen (figur 3). Ifølge immunhistokemisk farvning, både cilierede (FOXJ1 positiv 14) og sekretoriske (PAX8 positive 15) celler er bevaret i den tubal epitel af transplanterede væv (figur 3D og E).
Figur 2:. Påvisning af transplanterede mus Primære Tubal epitelceller og humant udødeliggjort æggestokkene overfladeepitelet Cells (A, B) Out bevoksninger af primær muse æggelederne epitelceller (pile) af β-actin-EGFP-mus (A, grøn) og p-actin-DsRed (B, rød) 8 dage efter transplantation ind i en syngen mus. (C, D) indpodninger af blandede HIO118 celler (pile) mærket med enten Lenti-EGFP (grøn) eller Lenti-mCherry (rød) 10 dage efter transplantation i NSG mus. (D) udvidet område fra (C, pil). (E, F) Graft udviklet 43 dage efter transplantation af de samme celler som i C, D til SCID mus (pile). AD, F, fluorescens; E, lyse felt, FP, fedt pad; Ov, ovarie; UT, æggelederen. (A, B, DF) Scale bar = 500 um; (C) Scale bar = 1600 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
annonce / 54.444 / 54444fig3.jpg "/>
Figur 3: Karakterisering af æggelederen Transplant. (A) Komplet æggelederen (pil) af β-actin-DsRed mus 6 dage efter transplantation ind i æggestokkene fedtpuden (pil, lyse rødt). (B) Fluorescerende frosne sektion af fedtpuden med transplantation vist i (A). Rød, DsRed; Blå, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) nuklear kontrastfarvning. (C) æggelederen graft (pil) 40 dage efter transplantation i NSG recipient mus (pil). Paraffin sektion. Bemærk korrekte opretholdelse af alle princippet æggelederen komponenter, og mangel på transplantation-associeret fibrose og inflammation. Hematoxylin og eosin-farvning. (D, E) Påvisning af æggelederne epitel markører Parret-box gen 8 (PAX8) og Forkhead box J1 (FOXJ1, brun nukleare farve, pilespidser) i celler af transplantatet (pile) vist i (
| Komponent | 1x DMEM F12 (Hams) medium |
| L-Glutamin | 2 mM |
| Natrium pruvate | 1 mM |
| Epidermal vækstfaktor | 10 ng ml-1 |
| Basisk fibroblastvækstfaktor-2 | 10 ng ml-1 |
| Hydrocortison | 500 ng ml-1 |
| Insulin | 5 ug ml -1 |
| Transferrin | 5 ug ml -1 |
| natriumselenit | 5 ng ml-1 |
| bovint albumin | 0,10% |
| Penicillin / streptomycin | 100 enheder ml-1/100 ug ml -1 |
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) ikke-essentielle aminosyrer | 0,1 mM |
| Beta-mercaptoethanol | 10 -4 M |
Tabel 1:. Mouse Tubal Epithelim Growth Medium (M-TE-GM) Komponenter opført i venstre kolonne opløses i 1x DMEM F12 (Hams) medium ved de angivne koncentrationer, højre spalte. Den endelige medium præparat er serumfrit.
Discussion
Vi har etableret en æggestokkene fedtpude transplantation assay, som giver mulighed for præcis levering og detektion af epiteliale celler og væv. Den æggestokkene fedtpude assay transplantation procedure er mindre teknisk udfordrende end intrabursal injektion 10-12 og giver mulighed for mere ensartet og præcis placering af transplanterede celler sammenlignet med intraperitoneal injektion 9. Det er også velegnet til langsigtet transplantation af et helt organ, såsom æggelederen.
Vigtigere er det, æggestokkene fedt pad giver en velkendt mikromiljø for epitel af den kvindelige reproduktive system. Det bør være særligt velegnet til studier af de molekylære og cellulære egenskaber af mennesker og mus æggestokkene og æggelederne epitel celler under regenerering og malign transformation. I modsætning til andre organer, har kun få undersøgelser fokuseret på identifikation og karakterisering af stamceller i epiteler af den kvindelige reproductive tarmkanalen 18,19. Sådanne undersøgelser er af særlig betydning, fordi mange kræftformer menes at stamme fra voksne stamceller 20. Alligevel cellulære oprindelse af epitelial ovariecancer forblive yderst diskutabel 18. Epiteliale ovariecancer tegner sig for størstedelen af ovariecancer og er i 5. plads blandt alle kræftrelaterede dødsfald blandt kvinder i USA 21. Således udvikling af en ortotopisk assay med flere fordele i forhold de eksisterende transplantationsteknikker 9-12 bør i høj grad lette undersøgelser på dette område.
I betragtning af den overfladiske placering af æggestokkene fedt pad, kan små dyr billeddannende systemer bruges til at følge op på indpodninger mærket med stærk fluorescerende eller bioluminiscerende journalister. Det bør også være muligt at etablere minimalt invasive høj opløsning levende imaging assays, såsom ikke-lineær mikroskopi 22. Den ovarie fedtpude kan også opbevares i organkulturer, derved tilladeing tredimensionel kultur af normalt og neoplastisk epitel under forhold nøje den gentog organisering af celler og den ekstracellulære matrix. Fremtidige undersøgelser bør tage disse lovende muligheder.
Flere kritiske trin skal overvejes. Giver en varmepude og holde gnavere varm under kirurgi forbedrer i høj grad overlevelsen. Sterilitet instrumenter håndterer fedtpuden sikrer, at inkorporerede systemer holdes sterile. Det er vores erfaring, signifikant blødning resulterer i væksthæmning af transplantationer. Vigtigt er, bør fedtpuden snittet blive lagt netop fordi rive fedtpuden eller punktere det gennem forårsager blødninger. Koaguleringsmidler bør anvendes til at stoppe blødningen som nødvendigt. Hvis indpodninger ikke udvikler, bør betragtes som en højere koncentration af injicerede celler. De første succesfulde udvækster kan observeres så tidligt som en uge efter transplantationen og mest indpodninger skal være synlig énmåned efter indgrebet. Til transplantation, kan nåle med større diameter (23-25 G) anvendes til at forhindre forskydning af store celler (over 10 um i diameter). Dog kan sådanne nåle være mere traumatisk for fedt pad og deres anvendelse bør testes på forhånd. For vores eksperimenter har vi anvendt 6 til 8 uger gamle donor- og recipientmus. For begge formål kan anvendes yngre eller ældre mus. Imidlertid skal antallet af injicerede celler, der skal justeres. Den mindre størrelse af æggestokkene fedtpuder hos yngre donorer skal også overvejes.
Som med alle metoder, der er nogle begrænsninger af muse æggestokkene fedtpude transplantation assay. Selvom syngene immunkompetente mus kan anvendes til murine primære celler / væv, vores teknik kræver NSG eller SCID-mus til transplantation af humant materiale. Det er sandsynligt muligt at humanisere fedtpuden at understøtte væksten af humane epitelceller. Vi har dog ikke testet denne fremgangsmåde endnu. Anvendelse af yngre fehanner kan føre til lavere omkostninger avl; imidlertid modne jomfruelige hunmus (alder 8 til 10 uger) har en større fedtpude, hvorved transplantation af større emner. Endelig bør laboratoriepersonale uddannes i dyr operation for at sikre en rettidig og vellykket gennemførelse af proceduren.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Andrew K. Godwin, University of Kansas Medical Center, for at sikre de menneskelige celler HIO118. Disse undersøgelser blev støttet af tilskud fra New York Stem Cell Program (NYSTEM, T028095) og National Institutes of Health / National Institute of Child Health and Human Development (P50HD076210) til AFN, og af tilskud fra NYSTEM (C028125, C024174 og T028095), National Institutes of Health / National Cancer Institute (CA182413) og æggestokkene Cancer Research Fund (327.516) til Ayn.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 gauge needle | BD Becton Dickinson | 305122 | |
| 28 gauge needle (hypodermic syringe with attached needle) | Kendall | 30339 | Part Number: 8881500014 |
| basic fibroblast growth factor-2 | Sigma-Aldrich | F9786 | |
| basement membrane matrix (Geltrex) | Invitrogen | A1413202 | |
| β-actin-DsRed mice | The Jackson Laboratory | 6051 | B6.Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J |
| β-actin-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 3291 | C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| bovine albumin | Sigma-Aldrich | A3311 | |
| chloroform | VWR | EM-CX1058-1 | |
| collagenase/hyaluronidase | Stem Cell Technologies | 7912 | |
| cryogenic vials | Thermo Scientific Nunc | 377267 | |
| dispase II | Worthington | NPRO2 | |
| DMEM F12 (HAM's) | Corning | 10-092-CV | |
| DNaseI (Deoxyribonuclease I) | Stem Cell Technologies | 7900 | |
| embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) | Sakura Finetek | 4583 | |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
| ethanol 200 proof | Koptec | V1001 | to prepare 70% |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | |
| filter tip 0.1-10/20 µl XL | USA Scientific | 1120-3810 | |
| FOXJ1 antibody | eBioscience | E10109-1632 | used at concentration 1:1,000 (no unmasking) |
| hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
| Ketoprofen | Zoetis | 4396H | |
| laboratory film (Parafilm M) | American National Can | PM-999 | |
| L-Glutamine | Corning | 25-005-Cl | |
| insulin-transferin-sodium selenite | Sigma-Aldrich | I884 | |
| isoflurane, 250 ml | Santa Cruz Animal Health | sc-363629Rx | |
| low attachment plate 24-well | Costar | 3473 | |
| MEM non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
| metal histology molds | Electron Microscopy Sciences | 62527-22 | |
| microscope, inverted | Nikon | Eclipse TS 100 | |
| microscope, stereo | Nikon | SMZ800 | |
| Nod/SCID/gamma (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 05557 | NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ |
| paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| paraffin (Paraplast, X-TRA) | Fisher Thermo Scientific | 23-021-401 | |
| PAX8 antibody | Proteintech | 10336-1-AP | used at concentration 1:1,000 (no unmasking) |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-030-CV | |
| penicillin streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| severe combined immunodeficiency (SCID/NCr) mice, BALB/C background) | NCI-Frederick Animal Production Program | 01S11 | |
| sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
| specimen processing gel (HISTOGEL) | Richard-Allan Scientific | HG-4000-012 | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Trypsin-EDTA, 25% | Corning | 25-053-Cl |
References
- Deome, K. B., Faulkin, L. J., Bern, H. A., Blair, P. B. Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice. Cancer Res. 19, 515-520 (1959).
- Proia, D. A., Kuperwasser, C. Reconstruction of human mammary tissues in a mouse model. Nature protocols. 1, 206-214 (2006).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439, 84-88 (2006).
- Stingl, J., Caldas, C. Molecular heterogeneity of breast carcinomas and the cancer stem cell hypothesis. Nat Rev Cancer. 7, 791-799 (2007).
- Koren, S., et al. PIK3CA(H1047R) induces multipotency and multi-lineage mammary tumours. Nature. 525, 114-118 (2015).
- Nikitin, A. Y., Nafus, M. G., Zhou, Z., Liao, C. -P., Roy-Burman, P. Prostate stem cells and cancer in animals. Stem Cells and Cancer. Bagley, R. G., Teicher, B. A. , Humana Press. New York, NY. 199-216 (2009).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160, 324-338 (2015).
- Lu, C. P., et al. Identification of stem cell populations in sweat glands and ducts reveals roles in homeostasis and wound repair. Cell. 150, 136-150 (2012).
- Flesken-Nikitin, A., et al. Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche. Nature. 495, 241-245 (2013).
- Orsulic, S., et al. Induction of ovarian cancer by defined multiple genetic changes in a mouse model system. Cancer Cell. 1, 53-62 (2002).
- Dawes, J., Liu, B., Mars, W., Michalopoulos, G., Khillan, J. S. Multiple ovarian transplants to rescue a transgenic line of mice. Lab Anim (NY). 39, 191-193 (2010).
- Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Albihn, A., et al. Production of capsular material by equine trophoblast transplanted into immunodeficient mice. Reproduction. 125, 855-863 (2003).
- Muthusamy, N., Vijayakumar, A., Cheng, G., Ghashghaei, H. T. A knock-in Foxj1(CreERT2::GFP) mouse for recombination in epithelial cells with motile cilia. Genesis. 52, 350-358 (2014).
- Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24, 751-765 (2013).
- Capo-Chichi, C. D., et al. Dynamic alterations of the extracellular environment of ovarian surface epithelial cells in premalignant transformation, tumorigenicity, and metastasis. Cancer. 95, 1802-1815 (2002).
- Roland, I. H., et al. Loss of surface and cyst epithelial basement membranes and preneoplastic morphologic changes in prophylactic oophorectomies. Cancer. 98, 2607-2623 (2003).
- Flesken-Nikitin, A., Odai-Afotey, A. A., Nikitin, A. Y. Role of the stem cell niche in the pathogenesis of epithelial ovarian cancers. Mol Cell Oncol. 1, 963435 (2014).
- Ng, A., Barker, N. Ovary and fimbrial stem cells: biology, niche and cancer origins. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 625-638 (2015).
- Visvader, J. E. Cells of origin in cancer. Nature. 469, 314-322 (2011).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).
- Williams, R. M., et al. Strategies for high-resolution imaging of epithelial ovarian cancer by laparoscopic nonlinear microscopy. Transl Oncol. 3, 181-194 (2010).
