Summary
हम एक डिम्बग्रंथि सनक पैड प्रत्यारोपण महिला प्रजनन पथ के सामान्य और तब्दील epithelia के अध्ययन के लिए उपयुक्त परख का वर्णन है। माउस वसा पैड बड़े ऊतक टुकड़े के प्रत्यारोपण की अनुमति देता है, सर्जरी और इमेजिंग के लिए आसानी से सुलभ है, और Müllerian मूल के ऊतकों के लिए सबसे अनुकूल देशी वातावरण प्रदान करता है।
Introduction
प्रत्यारोपण assays है, जो चूहों में विशिष्ट शरीर साइटों में कोशिकाओं और ऊतकों की शुरूआत शामिल है, ऊतक उत्थान और carcinogenesis के अध्ययन के लिए एक आवश्यक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं। कोशिकाओं के प्रत्यारोपण Orthotopic, वह है, एक देशी परिवेश में उनकी नियुक्ति, वयस्क स्टेम कोशिकाओं के लक्षण वर्णन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं। स्तन स्टेम सेल का अस्तित्व पहले ग्रंथि से मुक्त चूहों 1 के स्तन वसा पैड में उपकला स्तन ग्रंथि के टुकड़े के प्रत्यारोपण द्वारा सुझाव दिया गया था। Humanized माउस वसा पैड 2 के लिए engraftment assays मानव प्राथमिक स्तन उपकला कोशिकाओं के पुनर्योजी क्षमता और सामान्य विकास पुनरावृत्ति करने के लिए इस्तेमाल किया गया। इसके अलावा, मंजूरी दे दी स्तन वसा पैड में phenotypically अलग प्रकार की कोशिकाओं के धारावाहिक और सीमित कमजोर पड़ने प्रत्यारोपण स्तन स्टेम कोशिकाओं को 3-5 की आत्म नवीकरण क्षमता और multilineage भेदभाव का परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण थे। combinat में प्रत्यारोपण assaysआनुवंशिक वंश के साथ आयन स्तन कैंसरजनन 5 में मूल के सेल के सबूत प्रदान की अनुरेखण। गुर्दा प्रत्यारोपण कैप्सूल आमतौर पर ख्यात प्रोस्टेट स्टेम कोशिकाओं 6 के गुणों के परीक्षण के लिए उपयोग किया जाता है। सामान्य और नवोत्पादित माउस और मानव अग्नाशय organoids की Orthotopic प्रत्यारोपण जीन और रास्ते कैंसर की प्रगति 7 में बदल पता चला। मूल पर्यावरण के महत्व को भी विविध उत्थान के प्रदर्शन के द्वारा समर्थित किया गया इस तरह के स्तन वसा पैड, कंधे वसा पैड, और वापस त्वचा 8 के रूप में अलग-अलग स्थानों में पसीने की ग्रंथियों के बाद engraftments गया है।
पेरिटोनियल गुहा और डिम्बग्रंथि बर्सा आमतौर पर महिला प्रजनन पथ 9-12 की उपकला कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए ओर्थोटोपिक स्थानों के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। इन तरीकों के दोनों सीमाओं की एक संख्या है। कोशिकाओं के इंजेक्शन इंट्रापेरिटोनियल पेरिटोनियल गुहा के विभिन्न क्षेत्रों में अपने implantations की ओर जाता है, जिससे कॉमसेलुलर विकास की निगरानी plicating। इसके अलावा, microenvironment में बदलाव, ऐसे vascularization, तंत्रिका वितरण और प्रतिरक्षा सेल प्रतिनिधित्व की हद तक के रूप में, पेरिटोनियल गुहा के विभिन्न क्षेत्रों में काफी महत्वपूर्ण हो सकता है। डिम्बग्रंथि बर्सा तरल के कोई 10 से अधिक μl के इंजेक्शन की अनुमति देता है, एक बहुत ही सीमित मात्रा है। यह काफी कोशिकाओं की राशि है कि दिलाई जा सकती है सीमा। इसके अलावा, डिम्बग्रंथि बर्सा में इंजेक्शन काफी तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है और प्रक्रिया के समय का एक महत्वपूर्ण राशि की आवश्यकता है।
इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हम डिम्बग्रंथि वसा पैड गुणों का लाभ ले लिया है। माउस डिम्बग्रंथि वसा पैड के एक बड़े आकार की है, अंडाशय और गर्भाशय ट्यूब के निकट है, और सर्जरी के द्वारा आसानी से सुलभ है। यह बताया गया है कि घोड़े का trophoblast माउस डिम्बग्रंथि वसा पैड 13 में प्रत्यारोपित किया जा सकता है। हालांकि इस पद्धति का ब्यौरा वर्णित नहीं कर रहे थे। यह भी अगर यह मुझे सूचना नहीं मिलीThod वयस्क कोशिकाओं और ऊतकों के लिए लागू किया जा सकता है। यहाँ, हम माउस और महिला प्रजनन पथ के मानव कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए एक विश्वसनीय दृष्टिकोण का वर्णन है और पता चलता है कि इस पद्धति का भी लंबी अवधि के अंग प्रत्यारोपण के लिए लागू है।
Protocol
सभी विवो काम में वर्णित कॉर्नेल विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति ने मंजूरी दे दी है।
1. डिम्बग्रंथि वसा पैड Assays के लिए नमूना तैयारी
- अलगाव और प्राथमिक की संस्कृति तूबल उपकला (ते) प्रकोष्ठों
- सीओ द्वारा 8 सप्ताह पुराने कुंवारी β-actin-बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EFGP) या β-actin-Discosoma लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (DsRed) चूहों को दाता 6 Euthanize 2 प्रशासन ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा पीछा किया। एक पैर की अंगुली चुटकी द्वारा सफल इच्छामृत्यु की जाँच करें।
- एक शोषक कपड़ा, उदर पक्ष पर एक व्यक्ति माउस जगह है, और फिर 70% इथेनॉल के साथ पेट साफ कर लें। शरीर midline पर एक पार्श्व चीरा बनाकर और उंगलियों से ऊपर है और सिर और माउस की पूंछ की ओर चीरा नीचे त्वचा खींच के साथ त्वचा खोलें।
- कुंद संदंश का उपयोग पेरिटोनियम पकड़ो और शरीर गुहा को खोलने के लिए ठीक कैंची के साथ एक काट कर। धीरे intestin के कुंडल धक्काएक तरफ ई और प्रजनन अंगों का पता लगाने।
- ठीक संदंश के साथ एक गर्भाशय सींग लेने के लिए और इस मुद्दे पर जहां गर्भाशय सींग को अलग से ऊपर 0.5 सेमी काटा। गर्भाशय सींग पकड़े, संयोजी ऊतक गर्भाशय सींग से जुड़ी है, गर्भाशय ट्यूब, अंडाशय और डिम्बग्रंथि वसा पैड दूर काटना। 6 मिलीलीटर बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ एक थाली में विच्छेदित प्रजनन पथ रखें। दूसरी प्रजनन पथ के साथ आगे बढ़ें।
- एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के लिए पकवान स्थानांतरण और 6 मिलीलीटर में ऊतकों 3 बार धोने बाँझ पीबीएस। एक विच्छेदन जैव सुरक्षा कैबिनेट में स्थित माइक्रोस्कोप के तहत काम जारी है। ठीक चिमटी के साथ गर्भाशय सींग ले लो और गर्भाशय-ट्यूबल जंक्शन पर विच्छेद करके गर्भाशय ट्यूब से गर्भाशय सींग काट। एक 25 जी सुई का उपयोग करके अंडाशय आसपास डिम्बग्रंथि बर्सा बाहर कट।
नोट: डिम्बग्रंथि बर्सा के बाद हटा दिया गया है, विच्छेदन पूरा हो गया है और अलग-अलग गर्भाशय ट्यूब पीबीएस समाधान में रहता है। - एक singl स्थानांतरणएक 3.5 सेमी डिश के लिए पीबीएस के एक 50 μl बूंद में ई गर्भाशय ट्यूब और 0.1 मिमी 28 गेज सुई का उपयोग टुकड़ों में कीमा। 200 μl पाचन बफर 1 (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) F12 (HAM) के माध्यम के 300 इकाइयों एमएल -1 कोलेजिनेस और 100 इकाइयों एमएल -1 hyaluronidase के साथ पूरक) और करने के लिए स्थानांतरण एक 5% सीओ में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते 2 इनक्यूबेटर।
- ऊष्मायन के बाद, 1 मिलीलीटर 0.25% trypsin ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) जोड़ सकते हैं और एक 1 मिलीलीटर विंदुक टिप (उर्फ नीला टिप) 3 मिनट के लिए 20 बार की मदद से समाधान निलंबित। 5 मिलीलीटर + 4 डिग्री सेल्सियस DMEM / F12 (HAM) के माध्यम युक्त 2% भ्रूण गोजातीय सीरम जोड़ें।
- Centrifugation (600 आरसीएफ, 5 मिनट, कमरे के तापमान (आरटी)), द्वारा ऊतकों लीजिए और 1 मिलीलीटर पाचन बफर 2 (DMEM F12 जोड़ने (HAM) की मध्यम 7 मिलीग्राम मिलीलीटर -1 Dispase द्वितीय और 10 माइक्रोग्राम मिलीलीटर -1 Deoxyribonuclease मैं के साथ पूरक ( DNase मैं))। 1 मिलीलीटर पिपेट तिवारी की मदद से निलंबित ऊतक गोली 20 बारपी।
- 5 मिलीलीटर सीरम मुक्त पूरा माउस ट्यूबल उपकला मध्यम विकास (एम-ते-जीएम, 1 टेबल) जोड़ें।
- centrifugation द्वारा कोशिकाओं (600 आरसीएफ, 5 मिनट, आरटी) ले लीजिए। 1 मिलीलीटर एम ते जीएम जोड़ें, निरस्त करने और hemocytometer द्वारा कोशिकाओं की गिनती। बीज 1 एक्स 10 5 24 अच्छी तरह से कम लगाव थाली में अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं और 4 दिनों के लिए एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर एम-ते-जीएम में सेते हैं।
- हर दिन मध्यम बदलें।
- Β-actin-EGFP या β-actin-DsRed चूहों से सुसंस्कृत प्राथमिक निलंबन ते कोशिकाओं के एकल कक्ष निलंबन तैयार करें।
- 24 अच्छी तरह से कम लगाव प्लेटों से ते निलंबन संस्कृतियों लीजिए। 1 मिलीलीटर 0.25% trypsin EDTA के साथ अपकेंद्रित्र (600 आरसीएफ, 5 मिनट, आरटी), और निलंबित सेल छर्रों। एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
- 5 मिलीलीटर DMEM / F12 (HAM) के 5% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त मध्यम जोड़कर trypsin गतिविधि बंद करो। centrifugation (600 आरसीएफ, 5 मिनट, आरटी) द्वारा सेल छर्रों लीजिए।
- धो सेल छर्रों दो बार ठंड पीबीएस (4 डिग्री सेल्सियस) के 4 मिलीलीटर के साथ, सेल गोली प्रति 1 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ने के लिए, और निलंबित। hemocytometer द्वारा कोशिकाओं की गणना और 1.7 मिलीलीटर centrifugation ट्यूबों को हस्तांतरण। बर्फ पर काम करते हुए, 10 μl पीबीएस के लिए 1 एक्स 10 5 कोशिकाओं को जोड़ने, तो 10 μl तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स जोड़ें। निलंबित और पशु कमरे में बर्फ पर परिवहन।
नोट: बाँझ शर्तों के तहत एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में सभी विच्छेदन और टिशू कल्चर काम करते हैं।
- अमर मानव सेल लाइन की तैयारी
- उधर बढ़ने Lentivirus की EGFP और -mCherry लेबल तक 80 मानव अमर डिम्बग्रंथि सतह उपकला सेल lineHIO118 - एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 सेमी बर्तन पर 90% confluency।
- व्यंजन 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ दो बार धोएं, पकवान प्रति 1 मिलीलीटर 0.25% trypsin EDTA जोड़ सकते हैं और एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं। 10 मिलीलीटर DMEM / F12 (HAM) के 5% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त मध्यम जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो। लीजिएcentrifugation द्वारा सेल छर्रों (600 आरसीएफ, 5 मिनट, आरटी)।
- धो सेल छर्रों दो बार ठंड पीबीएस (4 डिग्री सेल्सियस) के 10 मिलीलीटर के साथ, सेल गोली प्रति 1 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ने के लिए, और निलंबित। hemocytometer द्वारा कोशिकाओं की गणना और 1.7 मिलीलीटर centrifugation ट्यूबों को हस्तांतरण।
- बर्फ पर काम करते हुए, जोड़ने 1.0 x 10 6 Lenti-mCherry लेबल की कोशिकाओं + 1.0 x 10 6 Lenti-EGFP 10 μl पीबीएस के लिए कोशिकाओं लेबल। 10 μl तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स जोड़ें। निलंबित और पशु कमरे में बर्फ पर परिवहन।
- के गर्भाशय ट्यूब तैयारी
- 6 से पीबीएस में 8 सप्ताह पुराने कुंवारी β-actin-DsRed चूहों को अलग-अलग गर्भाशय ट्यूब चरणों में वर्णित के रूप में 1.1.1-1.1.5 काटना। एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे पीबीएस के एक 200 μl बूंद में एक गर्भाशय ट्यूब स्थानांतरण। धीरे mesosalpinx, व्यापक बंधन के एक हिस्से को जो गर्भाशय ट्यूब के क्षेत्रों का समर्थन करता है हटाने के द्वारा चिमटी और 28 गेज सुई की मदद से गर्भाशय ट्यूब खुलना। 2 की एक बूंद में एकल uncoiled गर्भाशय ट्यूब की जगह00 μl ठंडा पीबीएस जब तक प्राप्तकर्ता के डिम्बग्रंथि वसा पैड से अवगत कराया और प्रत्यारोपण प्राप्त करने के लिए तैयार है।
2. डिम्बग्रंथि वसा पैड ट्रांसप्लांटेशन
नोट: कीटाणुरहित प्रत्येक पशु शल्य चिकित्सा के बीच उपकरणों। तैयार है और अग्रिम में सभी उपकरणों की व्यवस्था। सही डिम्बग्रंथि वसा पैड के लिए पृष्ठीय प्रत्यारोपण तरजीही के रूप में इस तिल्ली टाल रहे हैं। हालांकि, प्राप्तकर्ताओं दोनों डिम्बग्रंथि वसा पैड में प्रत्यारोपण हो सकता है।
- syngeneic चूहों या प्राथमिक कोशिकाओं के प्राप्तकर्ताओं के रूप में गंभीर संयुक्त इम्यूनो (एस.सी.आई.डी / एनसीआर) चूहों का प्रयोग करें। मानव कोशिकाओं, जैसे HIO118 कोशिकाओं, उपयोग इशारा / SCID / गामा (एनएसजी) चूहों या एस.सी.आई.डी चूहों के लिए।
- 0.15 मिलीग्राम / 10 ग्राम शरीर के वजन की एक खुराक में 2,2,2-Tribromoethanol का एक भी अंतर peritoneal इंजेक्शन के साथ प्राप्तकर्ता माउस anesthetize। एक हीटिंग पैड पर पशु प्लेस, पशु हुड में और पेडल पलटा (पैर की अंगुली चुटकी) के नुकसान से उचित anesthetization की पुष्टि करें। आँखों पर पशु चिकित्सक मरहम लागू सूखापन, जबकि रोकने के लिएपशु संज्ञाहरण के तहत है। 4 मिलीग्राम / जी शरीर के वजन की एक खुराक पर एनाल्जेसिक Ketoprofen के साथ पशु subcutaneously इंजेक्षन शल्य चिकित्सा के बाद दर्द के लिए इलाज के लिए।
नोट: एक विकल्प के रूप में, संज्ञाहरण के लिए isoflurane का उपयोग करें। प्रेरण कक्ष में पशु रखें और 0.8-1.5 एल / मिनट और 2-3% isoflurane vaporizer के लिए ऑक्सीजन प्रवाहमापी समायोजित करें। चैम्बर से anesthetized पशु निकालें, यह एक नकाब से isoflurane साँस लेने और 0.4-0.8 एल / मिनट और 1.5% isoflurane vaporizer के लिए ऑक्सीजन फ्लो मीटर निर्धारित है, तो सर्जरी शुरू करते हैं। - # 40 कतरनी के साथ शल्य चिकित्सा क्षेत्र दाढ़ी; एक क्षेत्र से बालों को हटाने 2 बार शल्य चिकित्सा क्षेत्र povidone आयोडीन की तीन एंटीसेप्टिक स्क्रब, 70% इथेनॉल के बाद साथ मुंडा त्वचा तैयार है, और एक बाँझ कपड़ा के साथ कवर।
- एक विच्छेदन एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में स्थित माइक्रोस्कोप के तहत पशु ले जाएँ। सीधे डिम्बग्रंथि वसा पैड से ऊपर dorsomedial स्थिति में एक चीरा द्वारा प्रजनन पथ बेनकाब।
नोट: critराजनैतिक कदम: सटीक त्वचा चीरा घाव भरने की सुविधा है, एक छुरी का उपयोग 2.4 चरण में सिफारिश की है। - का प्रयोग कुंद ठीक संदंश ध्यान midline की ओर चीरा के माध्यम से डिम्बग्रंथि वसा पैड खींच, नसों और प्रमुख रक्त वाहिकाओं को नुकसान को कम से कम।
महत्वपूर्ण कदम: खून बह रहा होता है, तो सर्जरी बंद करो और एक अलग मेजबान जानवर को रोपाई पर विचार करें। - एक 28 गेज beveled सुई की मदद से विच्छेदन खुर्दबीन के नियंत्रण के तहत डिम्बग्रंथि वसा पैड में एक 2-4 मिमी गहरी चीरा, अंडाशय के ऊपर 3-4 मिमी हैं।
महत्वपूर्ण कदम: सुनिश्चित करें कि चीरा केवल वसा पैड के आधे के माध्यम से चला जाता है; नीचे की ओर करने के लिए सभी तरह के माध्यम puncturing रिसाव का कारण बनता है। तेजी से हो और इस कदम के बाद बिना किसी देरी के लिए आगे बढ़ें। - सेल प्रत्यारोपण के लिए, सेल-तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-मिश्रण के 10-20 μl के साथ एक सिरिंज (30 गेज सुई) को भरने और वसा पैड चीरा में इंजेक्षन। गर्भाशय प्रत्यारोपण के लिए ट्यूब, गर्भाशय ट्यूब बुद्धि उठाओज ठीक संदंश और 10 में जगह - 20 μl तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स बर्फ पर रखा। एक 0.1-10 / 20 μl का उपयोग XL फिल्टर टिप (3 मिमी से छोटा) ऊतक और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स निलंबन लेने के लिए और वसा पैड चीरा में रिलीज स्नातक किया।
- 5 मिनट रुको तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स जमना और प्रजनन पथ पेरिटोनियम में वापस जगह करने के लिए। सर्जिकल सिवनी के 2 stiches और दो छोटे घाव क्लिप या शल्य सीवन के साथ त्वचा के साथ मांसपेशियों को बंद करें।
- दोहराएँ कदम 2.4-2.8 जानवर जो नियंत्रण के रूप में काम करेगा के विपरीत पार्श्व वसा पैड में एक पीबीएस तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स मिश्रण प्रत्यारोपण के लिए।
महत्वपूर्ण कदम: सर्जरी के बाद, एक हीटिंग पैड पर जानवरों की जगह क्योंकि गर्मी के नुकसान anesthetized चूहों में तेजी है। - जानवर मूल निवासी पिंजरे में एक हीटिंग पैड पर वसूली और संज्ञाहरण से पूरी तरह से जाग जब तक पशु का निरीक्षण करते हैं। एक जानवर की पहुंच से बाहर मत छोड़ो जब तक यह स्टर्ना बनाए रखने के लिए पर्याप्त होश आ गया हैएल लेटना। एक जानवर जब तक पूरी तरह से ठीक है कि अन्य जानवरों की कंपनी के लिए सर्जरी आया है वापस नहीं है।
- सर्जरी के बाद पिंजरे पर भोजन करने के लिए सूखी अलावा पिंजरे के अंदर पूर्व गीला खाना छर्रों का एक मुट्ठी भर रखें। शल्य चिकित्सा के बाद दर्दनाशक दवाओं लागू अगर अगले कुछ दिनों के लिए की जरूरत है और दैनिक घाव की जांच। अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल के अनुसार यदि घाव संक्रमण होता है एंटीबायोटिक दवाओं को लागू करें। 10 दिनों हटाये घाव क्लिप सर्जरी के बाद जब घाव पूरी तरह से बंद कर दिया है।
3. प्रोटोकॉल और छवि अधिग्रहण
- भ्रष्टाचार संग्रह और संरक्षण
- 4 मिलीलीटर 10x पीबीएस और 10 मिलीलीटर 16% paraformaldehyde समाधान के साथ 26 मिलीलीटर DDH 2 हे मिश्रण से 4% paraformaldehyde समाधान तैयार है।
- एक ब्लॉक में काटना, engrafted डिम्बग्रंथि वसा पैड, अंडाशय, गर्भाशय ट्यूब, 0.5 सेमी गर्भाशय चरणों में वर्णित के रूप में 1.1.1-1.1.4। इसके तत्काल बाद 2 मिलीलीटर 4% paraformaldehyde में डाल दिया है और आरटी पर 2 घंटे के लिए तय कर लो। एक ही पशु से, काटना गैर engraftedcontralateral डिम्बग्रंथि वसा पैड प्रणाली एक नियंत्रण के रूप में पीबीएस तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स मिश्रण के साथ प्रत्यारोपित (2.9 कदम देखें)। फिक्स और उसी तरह की प्रक्रिया।
- निर्धारण धोने के बाद 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ तीन बार ऊतकों और 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में रातोंरात सेते हैं।
- डिम्बग्रंथि वसा पैड के पूरे माउंट इमेजिंग के लिए कदम करने के लिए 3.2.1 आगे बढ़ें।
नोट: के बाद छवि अधिग्रहण के ऊतकों जमे हुए किया जा सकता है (3.3.1) या आयल एम्बेडिंग (3.3.2) के लिए कार्रवाई की। 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में 30% sucrose में रात ऊष्मायन जमे हुए ऊतकों की गुणवत्ता में सुधार।
- चित्र अधिग्रहण
- जगह पूरे माउंट पीबीएस भरा बर्तन और छवि एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग महामारी प्रतिदीप्ति लगाव और उच्च परिभाषा रंग कैमरा के साथ सुसज्जित में डिम्बग्रंथि वसा पैड सिस्टम, 4, 10x उद्देश्यों, और एक stereomicroscope एक प्रतिदीप्ति लगाव, रंग कैमरा और योजना के साथ सुसज्जित के साथ ए पी ओ 1xWD70, प्रवर्तन निदेशालय योजना 1.5xWD45 उद्देश्यों।
- प्रोटोकॉल
- निम्नलिखितपूरे माउंट छवि अधिग्रहण (3.2.1) प्रयोगशाला फिल्म और संदंश का उपयोग करने का एक 2 एक्स 1 सेमी टुकड़े पर जमे हुए ऊतक नमूनों के लिए मध्यम embedding के एक 200-500 μl बूंद जगह, ड्रॉप करने के लिए ऊतक हस्तांतरण। एक किनारे पर फिल्म उठाओ और एक 1.8 मिलीलीटर क्रायोजेनिक शीशी के लिए ऊतक मध्यम बूंद हस्तांतरण। शीशी बंद करो और तरल नाइट्रोजन में उतर रही है। -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए ऊतकों स्टोर।
- वैकल्पिक रूप से, मानक आयल embedding के साथ आगे बढ़ें। प्रत्येक चरण के लिए ऊतक की मात्रा का 20-40 संस्करणों का प्रयोग करें।
- 30 मिनट के लिए 65% इथेनॉल में एक बार ऊतकों को विसर्जित कर दिया, आरटी पर धीरे मिलाते हुए।
- 30 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में एक बार ऊतकों को विसर्जित कर दिया, आरटी पर धीरे मिलाते हुए। इस स्तर पर नमूने आरटी पर महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है।
- 30 मिनट के लिए 90% इथेनॉल में एक बार ऊतकों को विसर्जित कर दिया, आरटी पर धीरे मिलाते हुए।
- 30 मिनट के लिए 95% इथेनॉल में एक बार ऊतकों को विसर्जित कर दिया, आरटी पर धीरे मिलाते हुए।
- 30 मिनट के लिए पूर्ण इथेनॉल (200 सबूत) में दो बार ऊतकों को विसर्जित कर दिया, आरटी पर धीरे मिलाते हुए। <li> ऊतकों में दो बार 30 मिनट के लिए क्लोरोफॉर्म में विसर्जित कर दिया, आरटी पर धीरे मिलाते हुए।
- 30 मिनट के लिए पैराफिन में एक बार ऊतकों को विसर्जित कर दिया, 58 डिग्री सेल्सियस पर धीरे मिलाते हुए।
- 12 घंटे के लिए पैराफिन में एक बार ऊतकों को विसर्जित कर दिया, 58 डिग्री सेल्सियस पर धीरे मिलाते हुए।
- 3 घंटे के लिए पैराफिन में एक बार ऊतकों को विसर्जित कर दिया, 58 डिग्री सेल्सियस पर।
- धातु ऊतक विज्ञान के नए नए साँचे में ऊतकों की जगह और 58 डिग्री सेल्सियस के तेल के साथ नए नए साँचे भरें। आयल के शीर्ष पर एक प्लास्टिक ऊतक विज्ञान कैसेट जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस तक आयल शांत हो जाओ। आरटी पर आयल ऊतक ब्लॉक और दुकान निकालें।
नोट: पैराफिन तापमान immunohistochemical धुंधला के लिए उपयुक्त ऊतक का इष्टतम संरक्षण के लिए 58 डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं होनी चाहिए।
- वैकल्पिक रूप से, नमूना प्रसंस्करण जेल के साथ आयल embedding के लिए तैयार करें।
- पीबीएस Aspirate और 70% इथेनॉल के लिए पूरे माउंट ऊतकों हस्तांतरण। 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। एक पानी के स्नान में, पहले से गरम नमूना 60 डिग्री सेल्सियस के लिए जेल प्रसंस्करण।
- Pipettई एक प्रयोगशाला फिल्म लाइन पेट्री डिश पर नमूना प्रसंस्करण जेल के 200 μl। का प्रयोग ठीक विच्छेदन संदंश नमूना प्रसंस्करण जेल ड्रॉप करने के लिए पूरे माउंट ऊतक प्रणाली हस्तांतरण।
- नमूना प्रसंस्करण जेल प्लग कमरे के तापमान पर जमना, या 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए प्लग जमना करने की अनुमति दें।
- ऊतक विज्ञान ऊतक बायोप्सी फोम पैड के बीच sandwiched कैसेट में नमूना प्रसंस्करण जेल एम्बेडेड ऊतक रखें। कदम 3.3.2-3.3.2.10 में के रूप में पैराफिन में शामिल करें।
नोट: नमूना प्रसंस्करण जेल एम्बेडिंग नुकसान से बचाता है और छोटे नाजुक ऊतकों के नमूनों के संरक्षण के लिए अनुमति देता है।
नोट: ठंड या आयल embedding द्वारा संरक्षित ऊतकों immunohistochemical धुंधला 14,15 के लिए उपयुक्त हैं।
Representative Results
प्रायोगिक कोशिकाओं और ऊतकों सही एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप (चित्रा 1) के तहत डिम्बग्रंथि वसा पैड में प्रत्यारोपित किया जा सकता है। उदाहरण प्राथमिक माउस ट्यूबल उपकला कोशिकाओं चूहों सर्वत्र EGFP (2A चित्रा) या DsRed (चित्रा 2 बी) और मानव अमर डिम्बग्रंथि सतह उपकला कोशिकाओं HIO118 16,17 कोशिकाओं mCherry और EGFP lentiviruses के साथ लेबल (- एफ चित्रा -2) व्यक्त करने से निकाली गई शामिल हैं। दृष्टिकोण भी इस तरह के माउस गर्भाशय ट्यूब (चित्रा 3) के रूप में अंगों के प्रत्यारोपण के लिए लंबी अवधि के लिए लागू है। Immunohistochemical धुंधला के अनुसार, दोनों रोमक (FOXJ1 सकारात्मक 14) और स्रावी (PAX8 सकारात्मक 15) कोशिकाओं को प्रत्यारोपित ऊतकों (चित्रा 3 डी और ई) के ट्यूबल उपकला में संरक्षित कर रहे हैं।
चित्रा 2:। प्रत्यारोपित माउस प्राथमिक तूबल उपकला कोशिकाओं और मानव की जांच अमर डिम्बग्रंथि सतह उपकला कोशिकाओं (ए, बी) के बाहर प्राथमिक माउस ट्यूबल उपकला कोशिकाओं β-actin-EGFP चूहों (ए, हरा) और β-actin-DsRed (बी, लाल) 8 दिन एक syngeneic माउस में प्रत्यारोपण के बाद की (तीर) की वृद्धि। (सी, डी) मिश्रित HIO118 कोशिकाओं (तीर) या तो Lenti-EGFP (हरा) या Lenti-mCherry (लाल) के साथ लेबल 10 दिनों एनएसजी चूहों में प्रत्यारोपण के बाद की Engraftments। (डी) (सी, तीर) से बढ़े क्षेत्र। (ई, एफ) भ्रष्टाचार, 43 दिन सी के रूप में ही कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के बाद विकसित एस.सी.आई.डी माउस (तीर) के लिए डी। ई, एफ, प्रतिदीप्ति; ई, उज्ज्वल क्षेत्र, एफपी, वसा पैड; Ov, अंडाशय; केन्द्र शासित प्रदेशों, गर्भाशय ट्यूब। (ए, बी, डीएफ) स्केल बार = 500 माइक्रोन; (सी) स्केल बार = 1600 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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चित्रा 3: गर्भाशय प्रत्यारोपण ट्यूब की विशेषता। (ए) β-actin-DsRed माउस 6 दिन डिम्बग्रंथि वसा पैड में प्रत्यारोपण के बाद का पूरा गर्भाशय ट्यूब (तीर) (तीर, चमकदार लाल)। (बी) (ए) में दिखाए गए प्रत्यारोपण के साथ वसा पैड के फ्लोरोसेंट जमे हुए खंड। लाल, DsRed; ब्लू, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) परमाणु counterstaining। (सी) गर्भाशय ट्यूब भ्रष्टाचार (तीर) एनएसजी प्राप्तकर्ता माउस (तीर) में प्रत्यारोपण के बाद 40 दिनों के लिए। पैराफिन अनुभाग। नोट सभी सिद्धांत गर्भाशय ट्यूब घटकों का सही संरक्षण, और प्रत्यारोपण से जुड़े फाइब्रोसिस और सूजन की कमी है। Hematoxylin और eosin धुंधला हो जाना। (डी, ई) जांच ट्यूबल उपकला मार्कर बनती बॉक्स जीन 8 (PAX8) और Forkhead बॉक्स J1 की (FOXJ1; भूरे रंग परमाणु, तीर) में दिखाया गया है भ्रष्टाचार (तीर) की कोशिकाओं में (
| अंग | 1x DMEM F12 (HAM) की मध्यम |
| एल Glutamine | 2 मिमी |
| सोडियम pruvate | 1 मिमी |
| एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर | 10 एनजी मिलीलीटर -1 |
| बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक -2 | 10 एनजी मिलीलीटर -1 |
| hydrocortisone | 500 एनजी मिलीलीटर -1 |
| इंसुलिन | 5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर -1 |
| ट्राnsferrin | 5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर -1 |
| सोडियम Selenite | 5 एनजी मिलीलीटर -1 |
| गोजातीय एल्बुमिन | 0.10% |
| पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन | 100 यूनिट मिलीलीटर -1 / 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर -1 |
| न्यूनतम आवश्यक मध्यम ईगल (सदस्य) गैर आवश्यक अमीनो एसिड | 0.1 मिमी |
| बीटा-mercaptoethanol | 10 -4 एम |
तालिका 1:। माउस तूबल Epithelim मध्यम विकास (एम-ते-जीएम) अवयव बाएँ कॉलम में सूचीबद्ध 1x DMEM F12 (हाम) ने संकेत दिया सांद्रता में मध्यम, सही कॉलम में भंग कर रहे हैं। अंतिम मध्यम रचना मुक्त सीरम है।
Discussion
हम एक डिम्बग्रंथि वसा पैड प्रत्यारोपण परख जो सही वितरण और उपकला कोशिकाओं और ऊतकों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है की स्थापना की है। डिम्बग्रंथि वसा पैड परख प्रत्यारोपण प्रक्रिया कम तकनीकी intrabursal इंजेक्शन 10-12 से चुनौती दे रहा है और अधिक समान और के रूप में intraperitoneal इंजेक्शन 9 की तुलना में प्रतिरोपित कोशिकाओं के सटीक स्थान के लिए अनुमति देता है। यह भी अच्छी तरह से इस तरह के गर्भाशय ट्यूब के रूप में एक पूरे अंग है, की लंबी अवधि के प्रत्यारोपण के लिए अनुकूल है।
महत्वपूर्ण बात है, डिम्बग्रंथि वसा पैड महिला प्रजनन प्रणाली के epithelia के लिए एक परिचित microenvironment प्रदान करता है। यह उत्थान और घातक परिवर्तन के दौरान मानव और माउस डिम्बग्रंथि और ट्यूबल उपकला कोशिकाओं की आणविक और सेलुलर गुणों के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयुक्त होना चाहिए। अन्य अंगों के विपरीत, कुछ अध्ययनों महिला आर के epithelia में पहचान और स्टेम कोशिकाओं के लक्षण वर्णन पर ध्यान केंद्रित किया हैeproductive पथ 18,19। इस तरह के अध्ययन क्योंकि कई तरह के कैंसर वयस्क स्टेम सेल 20 से उत्पन्न माना जाता है विशेष महत्व के हैं। उपकला डिम्बग्रंथि के कैंसर का अभी तक सेलुलर मूल अत्यधिक बहस का मुद्दा 18 में रहते हैं। उपकला डिम्बग्रंथि के कैंसर डिम्बग्रंथि के कैंसर के बहुमत के लिए खाते और अमेरिका के 21 में महिलाओं की सभी कैंसर से संबंधित मौतों के बीच में 5 वें स्थान पर है। मौजूदा प्रत्यारोपण तकनीक 9-12 पर कई फायदे के साथ एक orthotopic परख के इस प्रकार के विकास बहुत इस क्षेत्र में अध्ययन की सुविधा चाहिए।
डिम्बग्रंथि वसा पैड के सतही स्थान को देखते हुए, छोटे पशु इमेजिंग सिस्टम पर मजबूत फ्लोरोसेंट या bioluminescent संवाददाताओं के साथ लेबल engraftments पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह भी इस तरह के गैर रेखीय माइक्रोस्कोपी 22 के रूप में न्यूनतम इनवेसिव उच्च संकल्प रहते इमेजिंग assays, स्थापित करने के लिए संभव होना चाहिए। डिम्बग्रंथि वसा पैड भी अंग संस्कृतियों में रखा जा सकता है, जिससे की अनुमति देते हैंबारीकी से कोशिकाओं के संगठन और बाह्य मैट्रिक्स recapitulating की शर्तों के तहत सामान्य और नवोत्पादित epithelia के तीन आयामी संस्कृति हैैं। भविष्य के अध्ययन के इन होनहार संभावनाओं का पता होना चाहिए।
कई महत्वपूर्ण कदम माना जा है। एक हीटिंग पैड उपलब्ध कराना और सर्जरी के दौरान मूषक गर्म रखने के काफी सुधार जीवित रहने की दर। वसा पैड से निपटने के साधन के बाँझपन सुनिश्चित करता है कि engrafted सिस्टम बाँझ रखा जाता है। हमारे अनुभव, प्रत्यारोपण के विकास मंदता में महत्वपूर्ण खून बह रहा है परिणामों में। महत्वपूर्ण बात है, वसा पैड चीरा ठीक बनाया जाना चाहिए क्योंकि वसा पैड फाड़ या खून बह रहा कारणों के माध्यम से यह puncturing। Coagulants खून बह रहा है के रूप में आवश्यक को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। अगर engraftments विकसित नहीं है, इंजेक्शन कोशिकाओं के एक उच्च एकाग्रता से विचार किया जाना चाहिए। पहली सफल outgrowths प्रत्यारोपण के बाद एक सप्ताह के रूप में जल्दी के रूप में देखा जा सकता है और सबसे engraftments दिखाई एक होना चाहिएप्रक्रिया के बाद महीने। प्रत्यारोपण के लिए, बड़ा व्यास (23-25 जी) के साथ सुई (व्यास में 10 माइक्रोन से अधिक) बड़े कोशिकाओं के बाल काटना को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, इस तरह सुइयों वसा पैड के लिए और अधिक दर्दनाक हो सकता है और उनके उपयोग के लिए अग्रिम में परीक्षण किया जाना चाहिए। हमारे प्रयोगों के लिए हम 6 से 8 सप्ताह पुरानी दाता और प्राप्तकर्ता चूहों का इस्तेमाल किया है। दोनों उद्देश्यों के लिए छोटे या बड़े चूहों का इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, इंजेक्शन कोशिकाओं की संख्या समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। छोटे दानदाताओं में डिम्बग्रंथि वसा पैड के छोटे आकार पर भी विचार करने की आवश्यकता होगी।
किसी भी तरीके के साथ के रूप में, वहाँ माउस डिम्बग्रंथि वसा पैड प्रत्यारोपण परख की कुछ सीमाएं हैं। syngeneic इम्युनो-सक्षम चूहों murine प्राथमिक कोशिकाओं / ऊतकों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हमारी तकनीक एनएसजी या मानव सामग्री के प्रत्यारोपण के लिए SCID चूहों की आवश्यकता है। यह मानव उपकला कोशिकाओं के विकास का समर्थन करने के लिए वसा पैड मानवीयकरण की संभावना संभव है। हालांकि, हम अभी तक इस दृष्टिकोण परीक्षण नहीं किया है। युवा फे का उपयोगपुरुषों में कम प्रजनन लागत के लिए नेतृत्व करने के लिए कर सकते हैं; हालांकि, परिपक्व वर्जिन मादा चूहों (उम्र 8 से 10 सप्ताह) जिससे बड़ा नमूनों के प्रत्यारोपण की अनुमति के एक बड़े वसा पैड है। अंत में, प्रयोगशाला कर्मियों पशु शल्य चिकित्सा में प्रशिक्षित किया जाना चाहिए प्रक्रिया का समय पर और सफल क्रियान्वयन सुनिश्चित करने के लिए।
Acknowledgments
हम, डॉ एंड्रयू लालकृष्ण गॉडविन, केन्सास विश्वविद्यालय के मेडिकल सेंटर का शुक्रिया अदा करने के लिए मानव कोशिकाओं HIO118 प्रदान करने के लिए करना चाहते हैं। (; T028095 NYSTEM) और बाल स्वास्थ्य और AFN करने के लिए मानव विकास (P50HD076210) के स्वास्थ्य / राष्ट्रीय संस्थान के राष्ट्रीय संस्थानों, और NYSTEM (C028125, C024174 और से अनुदान द्वारा इन अध्ययनों से न्यू यॉर्क में स्टेम सेल कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित थे T028095), स्वास्थ्य / राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (CA182413) और Ayn करने के लिए डिम्बग्रंथि के कैंसर रिसर्च फंड (327516) के राष्ट्रीय संस्थानों।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 gauge needle | BD Becton Dickinson | 305122 | |
| 28 gauge needle (hypodermic syringe with attached needle) | Kendall | 30339 | Part Number: 8881500014 |
| basic fibroblast growth factor-2 | Sigma-Aldrich | F9786 | |
| basement membrane matrix (Geltrex) | Invitrogen | A1413202 | |
| β-actin-DsRed mice | The Jackson Laboratory | 6051 | B6.Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J |
| β-actin-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 3291 | C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| bovine albumin | Sigma-Aldrich | A3311 | |
| chloroform | VWR | EM-CX1058-1 | |
| collagenase/hyaluronidase | Stem Cell Technologies | 7912 | |
| cryogenic vials | Thermo Scientific Nunc | 377267 | |
| dispase II | Worthington | NPRO2 | |
| DMEM F12 (HAM's) | Corning | 10-092-CV | |
| DNaseI (Deoxyribonuclease I) | Stem Cell Technologies | 7900 | |
| embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) | Sakura Finetek | 4583 | |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
| ethanol 200 proof | Koptec | V1001 | to prepare 70% |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | |
| filter tip 0.1-10/20 µl XL | USA Scientific | 1120-3810 | |
| FOXJ1 antibody | eBioscience | E10109-1632 | used at concentration 1:1,000 (no unmasking) |
| hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
| Ketoprofen | Zoetis | 4396H | |
| laboratory film (Parafilm M) | American National Can | PM-999 | |
| L-Glutamine | Corning | 25-005-Cl | |
| insulin-transferin-sodium selenite | Sigma-Aldrich | I884 | |
| isoflurane, 250 ml | Santa Cruz Animal Health | sc-363629Rx | |
| low attachment plate 24-well | Costar | 3473 | |
| MEM non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
| metal histology molds | Electron Microscopy Sciences | 62527-22 | |
| microscope, inverted | Nikon | Eclipse TS 100 | |
| microscope, stereo | Nikon | SMZ800 | |
| Nod/SCID/gamma (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 05557 | NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ |
| paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| paraffin (Paraplast, X-TRA) | Fisher Thermo Scientific | 23-021-401 | |
| PAX8 antibody | Proteintech | 10336-1-AP | used at concentration 1:1,000 (no unmasking) |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-030-CV | |
| penicillin streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| severe combined immunodeficiency (SCID/NCr) mice, BALB/C background) | NCI-Frederick Animal Production Program | 01S11 | |
| sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
| specimen processing gel (HISTOGEL) | Richard-Allan Scientific | HG-4000-012 | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Trypsin-EDTA, 25% | Corning | 25-053-Cl |
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