Summary
Vi beskriver en äggstocksmodefluga pad transplantation analys lämplig för studier av normala och transformerade epitel i de kvinnliga reproduktionsorganen. Musen fett pad tillåter transplantation av stora vävnadsfragment, är lättillgängligt för kirurgi och bildbehandling, och ger den mest gynnsamma naturliga miljö för vävnader Müllerian ursprung.
Introduction
Transplantations analyser, som involverar införandet av celler och vävnader till specifika kroppsställen i möss, utgör en viktig strategi för studier av vävnadsregenerering och cancer. Orthotopic transplantationer av celler, det vill säga deras placering i en infödd miljö, är särskilt viktiga för karakterisering av vuxna stamceller. Förekomsten av bröst stamceller föreslogs först av transplantation av epiteliala bröstkörtel fragment i körtelfria bröstfettkuddarna hos möss 1. Engraftment analyser till humaniserad mus fettkudden 2 användes för att rekapitulera den regenerativa potential och normal utveckling av humana primära bröstepitelceller. Dessutom seriella och begränsande utspädningstransplantationer av fenotypiskt distinkta celltyper i den rensas bröstfettkudden var avgörande för att testa självförnyelse kapacitet och multilineage differentiering av bröst stamceller 3-5. Transplantations analyser i combinatjon med genetisk härstamning spårning bevisat att cellen ursprungs bröst cancer 5. Njurkapseln transplantationer används vanligen för att testa egenskaperna hos förmodade prostatastamceller 6. Orthotopic transplantation av normal och neoplastisk mus och mänskliga pankreas organoids avslöjade gener och vägar förändras i cancerutveckling 7. Betydelsen av naturliga miljö har också fått stöd av demonstrationen av olika regeneration efter engraftments av svettkörtlar i olika platser, såsom bröstfettkuddar, axelfettkuddar och tillbaka hud 8.
Bukhålan och äggstocks bursa används vanligen som platser för orthotopic transplantation av epitelceller i det kvinnliga reproduktionsorganen 9-12. Båda dessa metoder har ett antal begränsningar. Intraperitoneal injektion av celler leder till deras implantationer inom olika områden av peritonealhålan, vari complicating övervaka cellulär tillväxt. Vidare variationer i mikromiljön, såsom omfattningen av vaskularisering, innervation och immuncellrepresentation, kan vara ganska betydande i olika områden i bukhålan. Äggstocks bursa har en mycket begränsad volym, vilket möjliggör injektion av högst 10 l vätska. Detta begränsar avsevärt den mängd celler som kan administreras. Dessutom kan injektioner i äggstocks bursa vara ganska tekniskt utmanande och förfarandet kräver en avsevärd tid.
Ta itu med dessa begränsningar, har vi dragit fördel av de ovariala fettkudden egenskaper. Musen äggstocksfettkudden har en stor storlek, ligger i anslutning till äggstocken och livmoderröret, och är lätt att nå med kirurgi. Det har rapporterats att equine trofoblast kan transplanteras i musen äggstocksfettkudden 13. Dock till detaljer om denna metod inte har beskrivits. Det var också inte rapporterats om detta migThOD kan appliceras på vuxna celler och vävnader. Här beskriver vi en tillförlitlig metod för transplantation av mus och humana celler av de kvinnliga reproduktionsorganen och visar att denna metod också kan tillämpas på långtidsorgantransplantation.
Protocol
Allt arbete in vivo beskrivna godkänts av Cornell University Institutional Animal Care och användning kommittén.
1. Prov Förberedelser för äggstockfettkudden Analyser
- Isolering och odling av primär Tubal Epitel (TE) Celler
- Avliva donator 6- till 8-veckor gamla jungfru β-aktin-Enhanced grönt fluorescerande protein (EFGP) eller β-aktin-discosoma Röd fluorescerande protein (DsRed) möss genom CO 2 administrering följt av cervikal dislokation. Kontrollera framgångsrik dödshjälp av en tå nypa.
- Placera en enskild mus på en absorberande duk, ventrala sidan uppåt, och torka sedan buken med 70% etanol. Öppna huden genom att göra en lateral snitt vid kroppen mittlinjen och med fingertopparna dra huden över och under snittet mot huvudet och svansen på musen.
- Håll bukhinnan med trubbiga pincett och gör ett snitt med fina sax för att öppna kroppshåligheten. Tryck försiktigt spolen i intestine åt sidan och lokalisera fortplantningsorganen.
- Med fin pincett plocka upp ett livmoderhorn och skär 0,5 cm ovanför den punkt där livmoderhornen separera. Håll livmoderhornet, dissekera bort bindväv fäst vid livmoderhornet, livmoder rör, äggstockar och äggstocks fett pad. Placera dissekerade fortplantningsorganen i en skål med 6 ml steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Fortsätt med andra fortplantningsorganen.
- Flytta över skålen till en biosäkerhet skåp och tvätta vävnaderna 3 gånger i 6 ml steril PBS. Fortsätta arbetet under en dissektion mikroskop ligger i skåpet biosäkerhet. Ta livmoderhornet med fina pincett och koppla livmoderhornet från livmoderröret genom att bryta vid utero-äggledarna korsningen. Klipp ut äggstocks bursa omger äggstocken med hjälp av en 25 G-nål.
Obs: Efter äggstocks bursa har tagits bort, är dissektion komplett och individuell livmoderröret kvar i PBS-lösning. - Överför en single livmoder rör i en 50 l droppe PBS till en 3,5 cm skål och finhacka i 0,1 mm bitar med hjälp av 28 gauge nålar. Överföring till 200 | al nedbrytningsbuffert 1 (Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) F12 () medium Hams kompletterat med 300 enheter ml -1 kollagenas och 100 enheter ml -1 hyaluronidas) och inkubera under 1 h vid 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator.
- Efter inkubationen, tillsätt 1 ml 0,25% Trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och suspendera lösningen med hjälp av en 1 ml pipettspets (aka blå spets) 20 gånger i 3 minuter. Tillsätt 5 ml + 4 ° C DMEM / F12-medium (Hams) innehållande 2% fetalt bovint serum.
- Samla vävnader genom centrifugering (600 RCF, 5 min, rumstemperatur (RT)), och tillsätt 1 ml nedbrytningsbuffert 2 (DMEM F12 () medium Hams kompletterat med 7 mg ml -1 Dispase II och 10 | ig ml -1 deoxiribonukleas I ( DNas I)). Avbryta vävnad pellets 20 gånger med hjälp av en 1 ml pipett tis.
- Tillsätt 5 ml serumfritt komplett mus äggledarna epitel tillväxtmedium (M-TE-GM, Tabell 1).
- Samla cellerna genom centrifugering (600 RCF, 5 min, RT). Tillsätt 1 ml M-TE-GM, avbryta och räkna celler genom hemocytometer. Seed 1 x 10 5 celler i 1 ml per brunn i en 24-brunnars låg fästplatta och inkubera i M-TE-GM vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator under 4 dygn.
- Ändra mediet varje dag.
- Förbered enstaka cellsuspensioner av odlade primära upphängnings TE celler från p-aktin-EGFP eller β-aktin-dsRed möss.
- Samla TE suspensionsodlingar från 24 brunnar låg fästplattor. Centrifugera (600 RCF, 5 min, RT), och suspendera cellpellets med en ml 0,25% trypsin-EDTA. Inkubera i 10 min vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
- Stoppa trypsinaktiviteten genom att tillsätta 5 ml DMEM / F12-medium (Hams) innehållande 5% fetalt bovint serum. Samla in cellpellets genom centrifugering (600 RCF, 5 min, RT).
- Tvätta cellpelletar två gånger med 4 ml kall PBS (4 ° C), tillsätt 1 ml PBS per cellpelleten, och avbryta. Räkna celler genom hemocytometer och överför till 1,7 ml centrifugrör. Arbetar på is, tillsätt 1 x 10 5 celler till 10 pl PBS, lägg sedan till 10 l basalmembranmatrisen. Avbryta och transport på is till djuret rummet.
Obs: Utför alla dissektion och vävnadskulturarbete i en biosäkerhet skåp under sterila betingelser.
- Framställning av immortaliserad human cellinje
- Separat växa lentivirus-EGFP och -mCherry märkt human immortaliserad äggstocks ytepitelet cell lineHIO118 tills 80-90% konfluens på 10 cm skålar vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
- Diska två gånger med 10 ml PBS, tillsätt 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA per skål och inkubera i 10 min vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 10 ml DMEM / F12-medium (Hams) innehållande 5% fetalt bovint serum. Samlacellpelletar genom centrifugering (600 RCF, 5 min, RT).
- Tvätta cellpelletar två gånger med 10 ml kall PBS (4 ° C), tillsätt 1 ml PBS per cellpelleten, och avbryta. Räkna celler genom hemocytometer och överför till 1,7 ml centrifugrör.
- Arbetar på is, tillsätt 1,0 x 10 6 Lenti-mCherry märkta celler + 1,0 x 10 6 Lenti-EGFP märkta celler till 10 pl PBS. Tillsätt 10 | il basalmembranmatrisen. Avbryta och transport på is till djuret rummet.
- Beredning av livmoder Tube
- Dissekera enskilda äggledarna från 6- till 8 veckor gamla jungfru β-aktin-dsRed möss i PBS som beskrivs i steg 1.1.1-1.1.5. Överför enstaka äggledarna i en 200 pl droppe PBS under ett dissektionsmikroskop. Rulla ut försiktigt äggledarna med hjälp av pincett och 28 gauge nålar genom att avlägsna mesosalpinx, en del av den breda ligament som stödjer segmenten hos livmoderröret. Placera enskilda utrullat äggledarna i en droppe 200 pl iskall PBS tills mottagarens äggstocksfettkudden är utsatt och beredda att ta emot transplantationen.
2. Äggstocks Fat Pad Transplantation
Notera: Desinficera instrument mellan varje djur kirurgi. Förbereda och ordna all utrustning i förväg. Rygg transplantationer till höger äggstocksfettkudden är förmånliga eftersom detta undviker mjälten. Dock kan mottagarna ha transplantationer i båda äggstockfettkuddar.
- Använd syngena möss eller svår kombinerad immunbrist (SCID / NCR) möss som mottagare av primära celler. För humana celler, såsom HIO118 celler, använda Nod / SCID / gamma (NSG) möss eller SCID-möss.
- Söva mottagaren mus med en enda intra-peritoneal injektion av 2,2,2-Tribromoethanol vid en dosering av 0,15 ml / 10 g kroppsvikt. Placera djuret på en värmedyna, i djur huva och bekräfta korrekt bedövning av förlust av pedal reflex (toe nypa). Applicera veterinär salva på ögonen för att förhindra torrhet medandjur är under bedövning. Injicera djuret subkutant med den analgetiska Ketoprofen i en dos av 4 mg / g kroppsvikt för att behandla för postoperativ smärta.
Obs: Som ett alternativ, använda isofluran för anestesi. Placera djuret i induktionskammaren och justera syreflödesmätaren till 0,8-1,5 L / min och isofluran förångaren till 2-3%. Avlägsna sövda djur från kammaren, låt den andas isofluran från en mask och ställ in syre flödesmätaren till 0,4-0,8 l / min och isofluran förångare till 1,5%, sedan starta operationen. - Raka operationsområdet med # 40 Clippers; ta bort hår från ett område 2 gånger operationsområdet, förbereder den rakade huden med tre antiseptiska skurar av povidon-jod, följt av 70% etanol, och täck med en steril duk.
- Flytta djuret under en dissektion mikroskop ligger i en biosäkerhet skåp. Exponera reproduktionsorganen genom ett snitt i dorsomediala läge direkt ovanför äggstocksfettkudden.
Obs: CritiCal steg: Exakt hudsnitt underlättar sårläkning, är användningen av en skalpell som rekommenderas i steg 2,4. - Med trubbiga fin pincett dra äggstocksfettkudden försiktigt genom snittet mot mittlinjen, vilket minimerar skador på nerver och stora blodkärl.
Kritiska steg: Om blödningen inträffar, stoppa operationen och överväga transplantation till en annan värddjur. - Under kontroll av dissektion mikroskop med hjälp av en 28 gauge avfasade nål göra ett 2-4 mm djupt snitt i äggstocks fett pad, 3-4 mm ovanför äggstockarna.
Kritiskt steg: Se till att snittet går endast genom hälften av fettkudden; punktering hela vägen fram till undersidan orsakar läckage. Vara snabb och utan dröjsmål efter det här steget. - För celltransplantationer, fylla en spruta (30 gauge-nål) med 10-20 | j, l av cellbasalmembranmatris-blandningen och injicera i fettkudden snittet. För livmoder rör transplantation, plocka upp livmoderröret with fin pincett och placera i 10-20 pl basalmembranmatrisen hålls på is. Med hjälp av en 0,1-10 / 20 ^ XL graderat filter spets (förkortas med 3 mm) plocka upp vävnaden och basalmembranet matris fjädring och utsättning i fettkudden snittet.
- Vänta 5 minuter för basalmembranmatrisen stelna och placera fortplantningsorganen tillbaka till bukhinnan. Stäng musklerna med 2 stygn av kirurgisk sutur och huden med två små sår klipp eller kirurgisk sutur.
- Upprepa steg 2,4-2,8 för att transplantera en PBS-basalmembranmatris blandningen i kontralaterala fettkudden hos djuret som kommer att tjäna som kontroll.
Kritiskt steg: Efter operationen placera djuret på en värmedyna, eftersom värmeförlusten är snabb i sövda möss. - Låt djur återhämta sig på en värmedyna i det ursprungliga bur och observera djuret tills den är helt vaken ur narkosen. Lämna inte ett djur utan tillsyn tills den har återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternal bakåtlutad kroppsställning. Skicka inte tillbaka ett djur som har opererats för sällskap med andra djur tills återhämtat sig helt.
- Placera en handfull av pre-våta livsmedel pellets inne i buren förutom torrfoder på buren efter operationen. Applicera postoperativa smärtstillande medel vid behov för de närmaste dagarna och undersöka såret dagligen. Applicera antibiotika enligt den fastställda djur protokollet om sårinfektion uppstår. Ta sårklämmor 10 dagar efter operationen när såret har helt stängd.
3. Histologi och Image Acquisition
- Graft insamling och bevarande
- Förbered 4% paraformaldehydlösning genom att blanda 26 ml DDH 2 O med 4 ml 10x PBS och 10 ml 16% paraformaldehydlösning.
- Dissekera i ett block, det inympade äggstocksfettkudden, äggstockar, livmoder rör, 0,5 cm livmoder som beskrivs i steg 1.1.1-1.1.4. Placera omedelbart i 2 ml 4% paraformaldehyd och fixa under 2 timmar, vid rumstemperatur. Från samma djur, dissekera den icke-inympadekontraäggstocks fett pad system transplanteras med PBS-basalmembranmatrisen blandning som en kontroll (se steg 2,9). Fix och process på samma sätt.
- Efter fixering tvätt vävnader tre gånger med PBS under 5 min och inkubera över natten i PBS vid 4 ° C.
- För hela monterings avbildning av äggstocksfettkudden vidare till steg 3.2.1.
Obs! När bildförvärvs vävnader kan frysas (3.3.1) eller behandlas för paraffininbäddning (3.3.2). Inkubation över natt i 30% sackaros i PBS vid 4 ° C förbättrar kvaliteten av frysta vävnader.
- Image Acquisition
- Placera hela montering äggstockfettkudden system i PBS fyllda rätter och bild med ett inverterat mikroskop utrustat med epi-fluorescens fäste och HD-färgkamera, med 4, 10x mål, och en stereo utrustad med en fluorescensfäste, färgkamera och plan Apo 1xWD70, ED Plan 1.5xWD45 mål.
- Histologi
- FöljandeHela-mount bild förvärv (3.2.1) placera en 200-500 l droppe bädda medium för frysta vävnadsprover på en 2 x 1 cm bit av laboratoriefilm och med hjälp av pincett, överföra vävnaden till nedgången. Plocka upp filmen på en kant och överföra vävnadsmedel sjunka till en 1,8 ml kryogen flaska. Stäng flaskan och ett dopp i flytande kväve. Förvara frusna vävnader vid -80 ° C.
- Alternativt, gå vidare med standard paraffininbäddning. Använd 20-40 volymer vävnadsvolym för varje steg.
- Fördjupa vävnader gång i 65% etanol under 30 min, lätt skakning vid RT.
- Fördjupa vävnader gång i 70% etanol under 30 min, lätt skakning vid RT. I detta skede prover kan lagras i månader vid RT.
- Fördjupa vävnader gång i 90% etanol under 30 min, lätt skakning vid RT.
- Fördjupa vävnader gång i 95% etanol under 30 min, lätt skakning vid RT.
- Fördjupa vävnader två gånger i absolut etanol (200 proof) i 30 min, lätt skakning vid RT. <li> Doppa vävnader två gånger i kloroform under 30 minuter, lätt skakning vid RT.
- Fördjupa vävnader gång i paraffin i 30 min, lätt skakning vid 58 ° C.
- Doppa vävnader gång i paraffin för 12 timmar, skaka försiktigt vid 58 ° C.
- Fördjupa vävnader gång i paraffin under 3 h, vid 58 ° C.
- Placera vävnader i metall histologi formar och fyll formarna med 58 ° C paraffin. Lägga en plast histologi kassett på toppen av paraffin och svalna paraffin till 4 ° C. Utdrag paraffin-vävnadsblock och förvara vid rumstemperatur.
Notera: Paraffintemperaturen bör inte överstiga 58 ° C för optimal konservering av vävnad lämplig för immunohistokemisk färgning.
- Alternativt, Förbered dig för paraffininbäddning med Specimen Processing Gel.
- Aspirera PBS och överföra hela montering vävnader till 70% etanol. Inkubera vid rumstemperatur under 2 h. I ett vattenbad, förvärma provbehandling gel till 60 ° C.
- pipette 200 pl av provbehandling gel på en laboratoriefilm fodrade petriskål. Med fin dissektion pincett överföra hela-mount vävnadssystem till provbehandling gel droppe.
- Tillåta provbehandling gel plug stelna vid rumstemperatur, eller stelna pluggen under 10 min vid 4 ° C.
- Placera provbehandling gel inbäddad vävnad i histologi vävnadskassetter inklämt mellan biopsi kuddar. Bädda in i paraffin som i steg 3.3.2-3.3.2.10.
Obs: provbehandling gel inbäddning förhindrar förlust och möjliggör bevarande av små ömtåliga vävnadsprover.
Obs: Vävnader konserverade genom frysning eller paraffininbäddning är lämpliga för immunhistokemisk färgning 14,15.
Representative Results
Experimentella celler och vävnader kan exakt transplanteras in i äggstocksfettkudden under ett dissektionsmikroskop (figur 1). Exemplen omfattar primära mus äggledarna epitelceller härledda från möss ubiquitously som uttrycker EGFP (figur 2A) eller DsRed (figur 2B) och humana immortaliserade äggstocks yta epitelceller HIO118 16,17 celler märkta med mCherry och EGFP lentivirus (Figur 2C - F). Tillvägagångssättet är också tillämplig för långsiktig transplantation av organ, såsom mus livmoderröret (Figur 3). Enligt immunohistokemisk färgning, både cilie (FOXJ1 positiv 14) och sekretoriska (PAX8 positiv 15) celler finns bevarade i äggledarna epitel av transplanterade vävnader (figur 3D och E).
Figur 2:. Detektering av transplanterade Mus Primära Tubal Epitel-celler och humana Förevigats Ovarian ytepitelet Cells (A, B) Ut utväxter av primär mus äggledarna epitelceller (pilar) av β-aktin-EGFP möss (A, grön) och p-aktin-DsRed (B, röd) 8 dagar efter transplantation till en syngena mus. (C, D) Engraftments av blandade HIO118 celler (pilar) märkta med antingen Lenti-EGFP (grön) eller Lenti-mCherry (röd) 10 dagar efter transplantation i NSG möss. (D) Förstorad område från (C, pil). (E, F) Graft utvecklat 43 dagar efter transplantation av samma celler som i C, D till SCID-mus (pilar). AD, F, fluorescens; E, ljusa fält, FP, fettkudden; Ov, äggstock; UT, livmoder rör. (A, B, DF) Skalstreck = 500 | im; (C) Skala bar = 1600 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
ad / 54444 / 54444fig3.jpg "/>
Figur 3: Karakterisering av uterin Tube Transplant. (A) Komplett livmodern röret (pilen) av β-aktin-DsRed mus 6 dagar efter transplantation till äggstocksfettkudden (pil, röda). (B) Fluorescerande fryst sektion av fettkudden med transplantation visas i (A). Rött, DsRed; Blå, 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) nukleär motfärgning. (C) Livmoder rör transplantat (pil) 40 dagar efter transplantation i NSG mottagare mus (pil). Paraffin avsnitt. Notera korrekt konservering av alla princip livmoder rörkomponenter, och brist på transplantationsassocierade fibros och inflammation. Hematoxylin och eosin-färgning. (D, E) Upptäckt av äggledarna epitel markörer parade box gen 8 (PAX8) och forkhead box J1 (FOXJ1, brun kärn färg, pilspetsar) i celler av transplantatet (pilar) visas i (
| Komponent | 1x DMEM F12-medium (Hams) |
| L-glutamin | 2 mM |
| natrium pruvate | 1 mM |
| Epidermal tillväxtfaktor | 10 ng ml -1 |
| Basisk fibroblasttillväxtfaktor-2 | 10 ng ml -1 |
| Hydrokortison | 500 ng ml -1 |
| Insulin | 5 pg ml -1 |
| transferrin | 5 pg ml -1 |
| natriumselenit | 5 ng ml -1 |
| bovint albumin | 0,10% |
| Penicillin / streptomycin | 100 enheter ml -1 / 100 mikrogram ml -1 |
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) icke-essentiella aminosyror | 0,1 mM |
| Beta-merkaptoetanol | 10 -4 M |
Tabell 1:. Mouse Tubal Epithelim Growth Medium (M-TE-GM) komponenter som anges i den vänstra kolumnen löses i 1x DMEM F12 (Hams) medium vid de angivna koncentrationerna, högra kolumnen. Slutmediet kompositionen är serumfritt.
Discussion
Vi har etablerat en äggstocksfettkudden transplantation analys som gör det möjligt att korrekt leverans och detektion av epitelceller och vävnader. Äggstocksfettkudden analys transplantation förfarande är mindre tekniskt utmanande än intrabursal injektion 10-12 och möjliggör en mer enhetlig och exakt lokalisering av transplanterade celler jämfört med intraperitoneal injektion 9. Det är också väl lämpad för långtids transplantation av ett helt organ, såsom livmoderröret.
Viktigt ger äggstocksfettkudden en bekant mikro för epitel av den kvinnliga reproduktiva systemet. Det bör vara särskilt lämpliga för studier av de molekylära och cellulära egenskaper hos människa och mus äggstocks- och äggledarna epitelceller under förnyelse och malign transformation. I motsats till andra organ, har få studier med inriktning på identifiering och karakterisering av stamceller i epitel av den kvinnliga reproductive kanalen 18,19. Sådana studier är av särskild betydelse eftersom många cancerformer tros härröra från vuxna stamceller 20. Ändå cellulära ursprung äggstockscancer fortsatt mycket diskutabel 18. Äggstockscancer står för merparten av äggstockscancer och är i 5: e plats bland alla cancerrelaterade dödsfall bland kvinnor i USA 21. Således utveckling av en orthotopic analys med flera fördelar jämfört med befintliga transplantationsteknik 9-12 i hög grad bör underlätta studier inom detta område.
Med tanke på den ytliga platsen för äggstocks fett pad, kan små djur bildsystem användas för att följa upp engraftments märkt med stark fluorescerande eller självlysande reportrar. Det bör också vara möjligt att fastställa minimalt invasiva högupplösta levande imaging analyser, såsom icke-linjär mikroskopi 22. Äggstocks fett pad kan också hållas i organkulturer och därmed tillåtaing tredimensionella kultur av normal och neoplastisk epitel under förhållanden nära rekapitulera organisation av celler och den extracellulära matrisen. Framtida studier bör ta itu med dessa lovande möjligheter.
Flera viktiga steg måste beaktas. Tillhandahålla en värmedyna och hålla gnagare varm under operation förbättrar avsevärt överlevnaden. Sterilitet av instrument som hanterar fettkudden säkerställer att engrafted systemen hålls sterila. I vår erfarenhet, signifikant blödning resulterar i tillväxthämning av transplantationer. Viktigt bör fettkudden snitt göras just därför att riva fettkudden eller punktering det genom orsaker blödning. Koaguleringsmedel bör användas för att stoppa blödning vid behov. Om engraftments inte utvecklas, bör betraktas som en högre koncentration av injicerade celler. De första lyckade utväxter kan observeras så tidigt som en vecka efter transplantationen och mest engraftments bör vara synlig enmånad efter ingreppet. För transplantation, kan nålar med större diameter (23-25 G) användas för att förhindra skjuvning av stora celler (över 10 ^ m i diameter). Emellertid kan sådana nålar vara mer traumatisk för fettkudden och deras användning bör testas i förväg. För våra experiment har vi använt 6 till 8 veckor gamla donator- och mottagarmöss. För båda ändamål kan användas yngre eller äldre möss. Emellertid kan antalet injicerade celler behöva justeras. Den mindre storleken av äggstocksfettkuddar i yngre givare kommer också att behöva övervägas.
Som med alla metoder, finns det vissa begränsningar på musen äggstocksfettkudden transplantationsanalys. Även syngena immunkompetenta möss kan användas för murina primära celler / vävnader, kräver vår teknik NSG eller SCID-möss för transplantation av mänskligt material. Det är sannolikt möjligt att humanisera fettkudden för att stödja tillväxten av humana epitelceller. Men vi har inte testat detta tillvägagångssätt ännu. Användning av yngre femän kan leda till lägre avels kostnader; emellertid mogna jungfru honmöss (ålder 8 till 10 veckor) har en större fettkudden, varigenom transplantation av större prover. Slutligen bör laboratoriepersonal utbildas i djur kirurgi för att säkerställa ett snabbt och framgångsrikt genomförande av förfarandet.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr Andrew K. Godwin, University of Kansas Medical Center, för att ge de mänskliga celler HIO118. Dessa studier stöddes av bidrag från New York Stem Cell Program (NYSTEM, T028095) och National Institutes of Health / National Institute of Child Health and Human Development (P50HD076210) till AFN, och av bidrag från NYSTEM (C028125, C024174 och T028095), National Institutes of Health / National Cancer Institute (CA182413) och äggstocks Cancer Research Fund (327.516) till AYN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 gauge needle | BD Becton Dickinson | 305122 | |
| 28 gauge needle (hypodermic syringe with attached needle) | Kendall | 30339 | Part Number: 8881500014 |
| basic fibroblast growth factor-2 | Sigma-Aldrich | F9786 | |
| basement membrane matrix (Geltrex) | Invitrogen | A1413202 | |
| β-actin-DsRed mice | The Jackson Laboratory | 6051 | B6.Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J |
| β-actin-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 3291 | C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| bovine albumin | Sigma-Aldrich | A3311 | |
| chloroform | VWR | EM-CX1058-1 | |
| collagenase/hyaluronidase | Stem Cell Technologies | 7912 | |
| cryogenic vials | Thermo Scientific Nunc | 377267 | |
| dispase II | Worthington | NPRO2 | |
| DMEM F12 (HAM's) | Corning | 10-092-CV | |
| DNaseI (Deoxyribonuclease I) | Stem Cell Technologies | 7900 | |
| embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) | Sakura Finetek | 4583 | |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
| ethanol 200 proof | Koptec | V1001 | to prepare 70% |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | |
| filter tip 0.1-10/20 µl XL | USA Scientific | 1120-3810 | |
| FOXJ1 antibody | eBioscience | E10109-1632 | used at concentration 1:1,000 (no unmasking) |
| hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
| Ketoprofen | Zoetis | 4396H | |
| laboratory film (Parafilm M) | American National Can | PM-999 | |
| L-Glutamine | Corning | 25-005-Cl | |
| insulin-transferin-sodium selenite | Sigma-Aldrich | I884 | |
| isoflurane, 250 ml | Santa Cruz Animal Health | sc-363629Rx | |
| low attachment plate 24-well | Costar | 3473 | |
| MEM non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
| metal histology molds | Electron Microscopy Sciences | 62527-22 | |
| microscope, inverted | Nikon | Eclipse TS 100 | |
| microscope, stereo | Nikon | SMZ800 | |
| Nod/SCID/gamma (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 05557 | NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ |
| paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| paraffin (Paraplast, X-TRA) | Fisher Thermo Scientific | 23-021-401 | |
| PAX8 antibody | Proteintech | 10336-1-AP | used at concentration 1:1,000 (no unmasking) |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-030-CV | |
| penicillin streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| severe combined immunodeficiency (SCID/NCr) mice, BALB/C background) | NCI-Frederick Animal Production Program | 01S11 | |
| sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
| specimen processing gel (HISTOGEL) | Richard-Allan Scientific | HG-4000-012 | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Trypsin-EDTA, 25% | Corning | 25-053-Cl |
References
- Deome, K. B., Faulkin, L. J., Bern, H. A., Blair, P. B. Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice. Cancer Res. 19, 515-520 (1959).
- Proia, D. A., Kuperwasser, C. Reconstruction of human mammary tissues in a mouse model. Nature protocols. 1, 206-214 (2006).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439, 84-88 (2006).
- Stingl, J., Caldas, C. Molecular heterogeneity of breast carcinomas and the cancer stem cell hypothesis. Nat Rev Cancer. 7, 791-799 (2007).
- Koren, S., et al. PIK3CA(H1047R) induces multipotency and multi-lineage mammary tumours. Nature. 525, 114-118 (2015).
- Nikitin, A. Y., Nafus, M. G., Zhou, Z., Liao, C. -P., Roy-Burman, P. Prostate stem cells and cancer in animals. Stem Cells and Cancer. Bagley, R. G., Teicher, B. A. , Humana Press. New York, NY. 199-216 (2009).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160, 324-338 (2015).
- Lu, C. P., et al. Identification of stem cell populations in sweat glands and ducts reveals roles in homeostasis and wound repair. Cell. 150, 136-150 (2012).
- Flesken-Nikitin, A., et al. Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche. Nature. 495, 241-245 (2013).
- Orsulic, S., et al. Induction of ovarian cancer by defined multiple genetic changes in a mouse model system. Cancer Cell. 1, 53-62 (2002).
- Dawes, J., Liu, B., Mars, W., Michalopoulos, G., Khillan, J. S. Multiple ovarian transplants to rescue a transgenic line of mice. Lab Anim (NY). 39, 191-193 (2010).
- Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Albihn, A., et al. Production of capsular material by equine trophoblast transplanted into immunodeficient mice. Reproduction. 125, 855-863 (2003).
- Muthusamy, N., Vijayakumar, A., Cheng, G., Ghashghaei, H. T. A knock-in Foxj1(CreERT2::GFP) mouse for recombination in epithelial cells with motile cilia. Genesis. 52, 350-358 (2014).
- Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24, 751-765 (2013).
- Capo-Chichi, C. D., et al. Dynamic alterations of the extracellular environment of ovarian surface epithelial cells in premalignant transformation, tumorigenicity, and metastasis. Cancer. 95, 1802-1815 (2002).
- Roland, I. H., et al. Loss of surface and cyst epithelial basement membranes and preneoplastic morphologic changes in prophylactic oophorectomies. Cancer. 98, 2607-2623 (2003).
- Flesken-Nikitin, A., Odai-Afotey, A. A., Nikitin, A. Y. Role of the stem cell niche in the pathogenesis of epithelial ovarian cancers. Mol Cell Oncol. 1, 963435 (2014).
- Ng, A., Barker, N. Ovary and fimbrial stem cells: biology, niche and cancer origins. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 625-638 (2015).
- Visvader, J. E. Cells of origin in cancer. Nature. 469, 314-322 (2011).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).
- Williams, R. M., et al. Strategies for high-resolution imaging of epithelial ovarian cancer by laparoscopic nonlinear microscopy. Transl Oncol. 3, 181-194 (2010).
