小鼠腹腔粘连的创建

Introduction

腹腔粘连是疤痕组织的一种形式，在腹部形成响应于炎症，典型地在手术或腹腔内感染。粘连是慢性腹痛和不孕的重要原因，并且是小肠梗阻¹的最常见的原因。粘连的存在使得执行第二腹部手术更加困难并增加了并发症²的可能性。

尽管经过多年的研究，粘连形成的基本机制仍然知之甚少。众所周知，最初的损伤腹膜表面导致富含纤维蛋白的流体，然后形成能结合肠和腹壁一起³的表面的凝块的渗出。后，成纤维细胞和其他细胞迁移到粘合剂空间和分泌结缔组织^4。在几个月到几年的粘附成熟通过开发血管和神经

几个商业产品存在被设计为减少腹部手术（ 例如 ，Seprafilm）后粘连的形成。所有这些产品作为机械屏障并通过防止肠的循环和腹壁^6,7-之间的物理接触停止粘连形成。尽管从对照试验手术防粘连减少粘连⁸形成的证据，许多外科医生有传言称已经失望的机械屏障产品的功效。

目前，还没有基于药物的抗粘附治疗的，这反映了一个事实，即参与粘连形成的精确过程知之甚少。开发特异性靶向参与形成粘连将要求所涉及的粘接的形成的事件的改进的理解细胞或分子试剂的疗法。几组■找识别分子途径可能对粘连形成^9-11重要。动物模型为研究形成粘连提供一个极好的环境。许多研究已经发表描述几个动物，特别是大鼠，小鼠^6,12-14手术创建粘连。鉴于我们的经验，在鼠标和转基因小鼠和基于鼠标的抗体的广泛应用研究纤维化，我们选择了鼠标作为我们粘连的研究模型。在此，我们报告，我们已经开发了可重复和可靠地创建小鼠腹腔粘连的技术。

Protocol

下面的协议已被批准斯坦福大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）和关于使用研究动物的所有机构的道德准则。

1.腹腔粘连的创建

1. 开始在手术前一周抗生素食物饮食鼠标。
2. 高压灭菌的手术器械和预温的生理盐水冲洗液。
3. 麻醉，用2％异氟醚吸入鼠标。
4. 用理发推子随后又迅速应用 - 脱毛剂（5 10秒），从多数腹部的表面的除去毛。彻底用湿纱布和任选轻轻擦拭，通过鼠标的下半部小心扣篮入温水移除脱毛剂。彻底干燥的动物。
5. 放置在动物的鼻子到麻醉鼻锥。整个手术过程中，精心控制R根据需要的动物espiratory率和滴定麻醉流速。
6. 使用的加热装置，如加热垫或变暖灯，防止体温过低。
7. 前预备腹部，确保与置于上方和下方的腹部，以防止小鼠从手术过程中移胶带条鼠标。消毒用优碘腹部，然后用70％乙醇跟随。包括在制备尽可能多区域成为可能，包括在剃区域边缘的头发。将在鼠标无菌的悬垂性。 （ 图1）
8. 注入皮下0.1毫克/公斤丁丙诺啡，或3微克的30 G鼠标。
9. 使皮肤切口。
   1. 在下腹正中开始，抓住用钳子皮肤，使用锋利的剪刀皮肤浅垂直切割。
   2. 优携带切割与剪刀xyphoid。小心只输入皮肤。
10. 由于腹部肌肉为n可见流覆盖内脏，把握肌肉的中线钳和非常仔细地用锋利的剪刀做一个小切口进去。确保不要意外切割成腹腔脏器。
11. 进入一个小切口腹膜空间，看到肌层从腹部器官抽离后，插入剪刀插进开两个方向仔细切割优和inferiorly扩展晋级。从xyphoid优至膀胱上述inferiorly延长切口。 （ 图2）
12. 现在肠子暴露，找到盲肠，轻轻exteriorize它。避免用手抓或齿锋利的钳盲肠。相反，使用无创钳如斜角肌挤压锯齿钳。
13. 研磨砂纸盲肠。
    1. 轻轻研磨带100砂纸30盲肠的两侧的整个表面 - 60秒，直到表面变得较少光泽和瘀斑APPEAr处的表面上。如果外科医生为右旋，它有助于定向与面向右前端的盲肠和覆盖在外科医生的左手食指的盲肠。 （ 图3）
    2. 轻轻进行打磨，因为它很容易不小心引起​​薄盲肠壁的穿孔。作为砂纸沿盲肠表面移动应感到砂砾少量。如果砂纸感到反复迎头赶上盲肠，这将有可能导致盲肠壁撕裂。仔细观察，确保砂纸颗粒不打跑，并保持在腹部，因为这可能导致过多的异物反应。
    3. 如果在盲肠壁的撕裂发生时，终止该程序和安乐死的动物。
    4. 如果盲肠血管被砂纸剪切和出血引起，保持长达两分钟用纱布压力。但是，如果在此时间后出血仍然存在，周围放置了一个数字8字形7-0单丝缝合点出血。这将可靠止血在几乎所有情况。请注意，不要大量盲肠壁纳入缝合，因为这样的风险导致墙体的部分涉及坏死。
14. 伤及右腹部侧壁上。
    1. 用砂纸的条带以研磨右侧腹侧壁的肌肉的腹膜表面。更积极与砂光这里比在盲肠和继续下去，直到右腹部侧壁的整个表面上出现粗暴对待。避免打磨这么辛苦，皮肤穿过肌层开口可见。 （ 图4）
    2. 使用卡斯特罗Viejo的针驱动，放置2到4数字8字形4-0丝线缝合到右腹部壁肌层。留下约5毫米长的尾巴。请注意，不要一不小心赶上肠壁进入缝合。 （ 图5）
15. 用10毫升注射器填充W¯¯第i个温暖的盐水，灌溉肠子几次。直接盐水流进腹腔灌溉内饰，以及。如果鼠标下方的表面被浸泡，用移动鼠标或更换的表面上，以避免低温。
16. 使用放置在切口无菌纱布，以吸收多余灌溉。
17. 以淀粉少许洒到右腹部侧壁的表面到盲肠的两侧。 （ 图6）
18. 确保没有活动性出血。如果有，用纱布海绵，直到它停止直接施加压力到出血点。如果出血不容易停止，如上所述放置止血缝合。
19. 使用镊子和手指的钝端，轻轻推回肠道进入腹腔。盲肠，以便最大限度地粘连形成旁在右侧腹侧壁缝线定位。
20. C失去腹部切口。
    1. 使用6-0吸收编织缝线，放置一个运行缝入肌层在切口的顶部。
    2. 运行缝合向下朝向切口的底部，汇集肌层。约3毫米的行程，并采取3毫米咬伤每个新针。小心不要意外地采取肠咬，同时将缝线。
    3. 在切口的底部，从上留下咬缝线的循环，并用这个仪器扳平缝合。切割缝线留下5毫米尾巴。
    4. 重复用6-0尼龙单丝缝合上述三个步骤关闭皮肤。
21. 辖20毫升/公斤皮下注射生理盐水丸（约0.5毫升为30 G鼠标）。
22. 用干纱布，彻底干燥整个动物，如背皮毛往往灌溉过程中被淋湿。
23. 松散包装粘合剂在腹部敷料覆盖切口。注意不要来约束一个nimal的腿或换药呼吸力学。
24. 仔细监测动物，因为它从麻醉中恢复。辖丁丙诺啡2-3天，每12小时控制疼痛手术后。

2.收获组织粘连

1. 初次手术后至少要等七天。再次，高压灭菌器的外科器械和用异氟烷麻醉小鼠。
2. 消毒用优碘，随后用70％乙醇的腹部。剃并从腹部，以使得包含皮肤的粘附标本将不会在头发所覆盖，这使得组织学更加困难的右侧脱毛附加毛发。
3. 使用左正中切口，因为肠道是经常粘在原切口。在腹部的下端开始，约5mm到原始切口的底部的左侧，掌握与小齿镊皮肤切成用锋利的剪刀皮肤。扩展这个优越的切LY到胸腔。 （ 图7）
4. 用剪刀切成肌层和进入腹膜空间后，延长切到切口的顶部和底部。会有粘合剂组织造成盲肠和小肠粘附到腹部的右侧壁并且还可能对原始切口。 （ 图8）
5. 使用剪刀和开始在切口的边缘，盲肠的水平以上，开始切割入腹壁中周围，其中肠是附着的区域的圆。
6. 上面交替和下面的盲肠的水平，逐渐切断周围的粘附一路并完成一圈，产生一个皮肤和腹壁粘附到肠的“岛”。 （ 图9）
7. 再次使用剪刀，切成肠和粘附部分从肠的剩余部分分离，得到组织的夹层，由皮肤和腹壁的在一侧，在另一侧的肠，和粘合剂组织连接在两者之间。 （ 图10）
8. 或者，使用尖头剪刀大幅皮肤从腹壁肌肉分开。用于组织学考虑离开附着在皮肤，但对于消化和细胞分离的皮肤可以被删除。如果组织将用于组织学，请务必取出尽可能多的缝合材料尽量不用过分干扰粘接界面。消化和细胞分离是可以接受离开缝合到位只要组织消化液过滤。
9. 切除粘连组织后，使用您的机构使用动物委员会批准了人性化的方法安乐死鼠标。

Representative Results

在手术中，盲肠和可能升结肠，肝和小肠的环路七天后应粘着在右路腹壁。 （ 图8）切除的组织可被嵌入并切片和将产生极好的组织学载玻片。 （ 图11，12）

当被正确执行的程序，将小鼠的100％应该7天时都具有相当的粘连。死亡率应小于5％。

图 1： 手术制备 （一）动物被固定用胶带，用优碘坦然腹部（二）优碘已被清除与醇拭子和无菌披盖已放置。OM /文件/ ftp_upload / 54450 / 54450fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图2：。 切口切口应从膀胱到xyphoid水平延伸请点击此处查看该图的放大版本。

图 3： 盲肠磨损 （一）悬垂比与指向右侧前端的左手食指盲肠允许由左拇指被稳定盲肠的基（二）打磨的适当水平离开。盲肠具有粗糙表面是少光泽比以前，和出血的几个点状点。额外应小心而肠系膜侧附近打磨，因为这里的船只会流血最轻快。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 4： 腹壁磨损内脏被扫地出门和肌壁的腹膜表面打磨，直到它出现粗糙。血管看到刚刚在腹壁是经常遇到的砂纸以上，但不会流血大增。 请点击此处查看该图的放大版本。

1“>
图5：图8字形缝合的放置一个身影8字形丝线放入肌壁，之前被拴住请点击此处查看该图的放大版本。

图6：淀粉的应用淀粉光层撒在腹部侧壁和排便。两个数字8字形缝线见于肌壁。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7：切口的第二次手术（一）切口开始只是原切口的左边（b）新切口应从膀胱到胸腔的水平扩展。 请点击此处查看大图这个数字。

图8： 该粘附小肠（SB）的循环是粘附于右侧壁和彼此。原来正中切口，愈合现在，被认为是（公司）。 请点击此处查看该图的放大版本。

仲>图9： 摘除粘连组织。 （a）和（b）一个皮肤和腹壁粘连到底层肠“岛”是由周围的附着处一个完整的圆切割释放。 请点击此处查看该图的放大版本。

图10： 该标本在整个肠切割将产生与肠组织的夹层在一侧（a）和皮肤上的另一侧（B）。缝合可见的碎片应该如果试样是用于组织学被删除。 请点击此处查看该图的放大版本。

jove_content“FO： - together.within页保留=”1“>
图11：通过组织学的粘接界面盲肠（上）附手术显示皮肤和腹壁（下）后，在7天内结束染色粘附的A节伊红（H＆E）。在这个早期时间点盲肠很可能附着在腹壁主要通过纤维蛋白和其他分子，和大量的瘢痕组织尚未形成。 请点击此处查看该图的放大版本。

图12： 免疫荧光成像粘附在七天部手术后免疫荧光染色α平滑肌肌交流电。锡，表现在皮肤毛囊（左）的真实染色和盲肠肌壁（中），和盲肠腔面（右）的非特异性染色。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

在此过程中的关键步骤是：彻底研磨盲肠，而不会造成穿孔，将缝合在腹侧壁，和施加的淀粉适量。仅应用砂纸盲肠，或肠的小特定部分。在大量小肠广泛使用砂纸往往会造成显著肠梗阻。小心磨损以足够的力量盲肠，表面变得粗糙，但没有这么多，墙壁眼泪。找到这种平衡可能需要一些时间。始终谨慎操作肠道，避免使用尖锐或齿镊操纵排便。这是很容易造成意外通过抓住用钳子小肠系膜或通过拉肠深刻地出血。

如果在盲肠壁发生撕裂，该过程应终止和动物安乐死。根据我们的经验，盲肠撕裂导致动物死亡几天后，即使撕裂repaIRED好。此外，盲肠壁的撕裂将导致粪便的泄漏，这将影响在一个不可预知的方式的炎症反应。

止血必须在过程结束时完成。有些出血船只将重新开放，开始出现已停止后流血。如果有疑问，周围放置的出血点可吸收的单丝数字8字形缝合。这种类型的缝合线的优选的丝或编织的可吸收的缝合线，因为它可以但以最小的阻力在组织被拉动。然而我们已经发现，丝或编织的可吸收的缝合线是最有效的诱导粘连腹侧壁，如单丝是少的炎症。

在该过程结束时的淀粉应用有助于提高粘连的形成，但我们已发现，淀粉过量会引起导致死亡的炎症反应。淀粉应当上lightl洒年。不应该有这么多，它形成的固体层。

当第一次学习此过程中，通常失去几个小鼠。在我们的经验死亡的最常见的原因是由于由肠的过于剧烈磨损和脓毒症肠梗阻脱水由于肠穿孔。如果彻底止血不是在手术结束时达到可发生引起大出血死亡。

如果粘连形成是不充分的，可以考虑使用盲肠和右侧壁更积极的磨损，留下更多的淀粉，或将更多的缝线上腹部侧壁上。根据我们的经验，等不到一个星期不到足够的附着力形成重新打开腹部结果之前。另一方面，如果死亡率小鼠手术后高，考虑使用盲肠不太积极磨损，更紧密地检查止血，并施加较少的淀粉。同样重要的是仔细监测鼠标的手术过程中的呼吸频率。一旦此过程的外科医生获得经验，死亡率应小于10％。

这种技术的目的是主要形成盲肠和右腹部侧壁之间的粘连。粘连也会经常小肠，肝和中线切口之间形成。使用这种技术，通常不会引起上腹部的左侧粘连。该技术的一个限制是，肠和腹壁之间粘连是更可能形成比肠的环路之间的粘连。此外，这是不太可能导致完全冻结的腹部充满粘合剂组织，这是经常出现在谁曾多次手术的人类。

如在引言中所讨论的，许多技术用于生产在小鼠和其他物种，特别是鼠腹腔粘连，已在文献中^6,12-14说明。要少得多公布protoco LS对小鼠产生粘连。我们推测，由于粘连的小鼠产生比大鼠更加困难，大多数研究者选择发展其在大鼠的技术。然而，由于转基因小鼠和抗小鼠抗体的更大的可用性的，我们认为，这是有价值的，以具有用于在小鼠中粘附创建一个稳健的模型，尽管技术难度较大。我们尝试了许多公开的大鼠协议后开发了这个协议。我们发现，用于创建在大鼠粘连，如盲肠的使用电的方法中，往往会导致小鼠死亡。我们并不满足于通过使用一个单一的介入治疗技术，如放置侧壁缺血单独的按钮，或者只磨损盲肠产生粘连的密度。我们在这里提出的技术代表，我们发现，通过试验和错误，产生粘连一致，同时尽量减少死亡率干预的组合。

内容“>因为这种技术一直使粘合剂组织盲肠和侧壁之间形成，我们认为，它是理想的，旨在减少粘连形成测试干预。此外该技术可以用来探索分子途径和细胞类型是参与粘连形成。粘合组织可以容易地切下并用于组织学的准备，和产量优异的组织学图像（ 图11，图12）。

一些研究人员可能希望在其中粘连形成的时间小于100％的典范。省略淀粉的应用会降低粘附率至80％左右。降低放入右腹部侧壁丝线的数量会进一步降低附着率。

在我们的经验，手术后七天天是第一个时间点，其中所述肠是始终如一粘附于腹壁。然而，其他的时间点可以根据更相关对项目的重点。例如，感兴趣的嗜中性粒细胞和巨噬细胞的迁移到附着力空间研究人员可能想收获组织前五天手术后。另一方面，胶原蛋白的成纤维细胞的沉积花费数周的地方的初始损伤后，为此这将是更适当的检查在术后数周隔开的时间点组织。

手术放大镜是手术视野放大倍率非常有帮助的，而执行此过程。一个执行显微镜也可使用，但限制了外科医生的从不同的角度检查手术视野的能力。该过程也可以与没有放大率在全部完成。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24"	Fisher Scientific	14-206-62
Polylined Sterile Field, 18" x 24"	Busse Hospital Disposables	696	Cut a rectangular hole of the appropriate size
Isothesia isoflurane	Henry Schein	050033
Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4"	Fisher Scientific	22-415-469
Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Nair depilatory cream	Church & Dwight Co.	22339-05
Buprenex buprenorphine  0.3 mg/ml	Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.	NDC 12496-0757-5
1 cc insulin syringe, 27 G	Becton Dickinson	329412
Povidone Iodine Prep Solution	Medline	MDS093944H
Webcol alcohol prep swabs	Covidien	6818
General-Purpose Labarotory Labeling tape	VWR	89097-912
BioGel PI surgical gloves	Mölnlycke Health Care	ALA42675Z
Micro Forceps with teeth	Roboz	RS-5150
Fine scissors- sharp	Fine Science Tools	14060-09
Straight serrated forceps	Fine Science Tools	11050-10
Castro-Viejo needle driver	Fine Science Tools	12565-14
100 grit 1/4 sheet sandpaper	ACE Hardware	1010446	Cut into strips
4-0 silk suture, 30", SH needle	Ethicon	K831
7-0 PDS II absorbable monofilament suture, 30", BV-1 needle	Ethicon	Z135	Usually comes double-armed. Cut the suture at the midway point to generate two usable sutures.
Rice starch	MP Biomedicals	102955
0.9% Sodium Chloride Irrigation	Baxter	BHL2F7121	Warm to 37 °C prior to use
10 ml syringe	Becton Dickinson	309604
6-0 Vicryl absorbable braided suture, 18", RB-1 taper needle	Ethicon	J212H
6-0 Ethilon nylon monofilament  suture, 18", P-3 needle,	Ethicon	1698G
Tegaderm Transparent Film Dressing Frame Style, 6 cm x 7 cm	3M	1624W	Cut in half lengthwise