Summary
תאי גזע עצביים (NSCs) להתייחס לתאים אשר יכול עצמית לחדש ולבדל לשלוש השושלות עצביות. כאן אנו מתארים פרוטוקול לקבוע תדירות המל"ל באוכלוסיית תא נתונה באמצעות neurosphere היווצרות והבחנה בתנאים משובטים.
Abstract
תאי גזע עצביים (NSCs) יש את היכולת עצמית לחדש וליצור השושלות העצביות העיקריות השלוש - האסטרוציטים, נוירונים oligodendrocytes. NSCs ואת אבות עצביים (NPS) מתורבתים נפוץ במבחנה כמו neurospheres. פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לקבוע את התדירות המל"ל באוכלוסיית תא נתונה בתנאים משובטים. הפרוטוקול מתחיל עם הזריעה של התאים בצפיפות המאפשרת דור neurospheres המשובט. Neurospheres מועבר לאחר מכן coverslips התאי בדיל בתנאים משובטים במדיום מותנה, אשר ממקסם את פוטנציאל הבידול של neurospheres. לבסוף, תדירות המל"ל מחושבת על בסיס יכולות היווצרות multipotency neurosphere. כלי עזר של פרוטוקול זה כולל את הערכה של סמנים המל"ל המועמד, טיהור של NSCs, ואת היכולת להבחין NSCs מ צירופים. שיטה זו אורכת 13 ימים כדי לבצע, וזה של הרבהhorter מאשר השיטות הקיימות למנות תדירות המל"ל.
Introduction
תאי גזע עצביים (NSCs) הם תאים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) שיכול עצמי לחדש והם multipotent. NSCs המפורט הראשון במהלך ההתפתחות של המוח הקדמי העוברי ולהמשיך להתמיד במוח הבוגר בבית לאזורים ספציפיים כגון אזור subventricular (SVZ) של החדרים לרוחב ואת gyrus המשוננת (DG) של ההיפוקמפוס. מספר קווי המל"ל נמצא בשימוש בניסויים קליניים לטיפול בשבץ ומחלות נוירולוגיות אחרות כמו מחל 1 של באטן.
NSCs ואת אבות עצביים (NPS) מופצים בתרבות צף מבנים אליפטית 3 ממדים שנקראים neurospheres. מערכת תרבות neurosphere פותחה על ידי ריינולדס וייס בתחילת 1990, כאשר הם מצאו כי תאי קליפת מוח עובריים ומבוגרים יכולים לחלק בנוכחות גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) ו גורם גדילה פיברובלסטים בסיסית (bFGF) 2-4. Neurospheres מורכב תערובת הטרוגנית של גאמות הכולל subclasses בשלבים התפתחותיים שונים 5. זה מאתגר במיוחד ללמוד NSCs באמצעות נתונים המתקבלים neurospheres בשל נוכחותם של צירופים. לפיכך, חשוב להעשיר NSCs מן neurospheres. כיום, ארבע שיטות עיקריות שימשו להעשיר עבור NSCs במבחנה. הראשון הוא השימוש סמנים פני התא. לואיס-X (לקס) ו CD133 (הידוע גם בשם Prominin1) הם פני התא הבולט המל"ל סמני 6-9. Syndecan-1, Notch-1 ו integrin-beta1 הם חלבונים משטח אחר המעשירים עבור NSCs 10. השני הוא הדרה לצבוע. הוכח כי התאים האוכלוסייה בצד, אשר יש את היכולת הייחודית לשאוב את צבע פלואורסצנטי ה- DNA מחייבת Hoechst 33342, מועשרים עבור NSCs 11. השלישי הוא השימוש של מיון המורפולוגי. הוכח כי תאים עם גודל תא גדל גרעיניות נמל יותר NSCs מאשר עמיתיהם 5,12,13. הרביעית היא תוספת של המל"ל suגורמי rvival עד בינוני התרבות. הוכח בנוסף לזה של proteoglycan כונדרויטין סולפט אפוליפופרוטאין E משפר הישרדות המל"ל ובכך מגביר המל"ל תדירה 14,15. למרות סמנים רבים, כולל גורמי שעתוק נקשרו NSCs 16,17, אף אחד הסמנים האלה מסוגלים להעשיר NSCs לטוהר. בשל חוסר סמנים המל"ל סופיים, זה עדיין מהווה אתגר לכמת NSCs ולהבחין ביניהם לבין צירופים במבחנה.
מחקרים ראשוניים השתמשו assay היווצרות neurosphere (NFA) לכמת NSCs 7,11,13. ב assay זה, תאים ניתקים הם מתורבתים כדי ליצור neurospheres ומספר neurospheres שנוצר עבור כל 100 תאים מצופים נקבע. ערך זה נקרא כמו יחידת גיבוש neurosphere (nfu). Nfu שווה את תדירות המל"ל אם כל neurospheres לנבוע NSCs. עם זאת, ניתן היה לראות כי nfu מגזים בהערכת תדירות המל"ל כפי neurospheres נוצרות על ידי שני NSCs ותחילת צירופים 5. לפיכך, אין זה מדויק למנות NSCs מבוססת אך ורק על היווצרות neurosphere. זה יכול להיות אפשרי לכמת NSCs מבוסס על יכולתם עצמית לחדש, להתרבות בהרחבה וליצור neurospheres multipotent.
NSCs, שהן EGF ו bFGF תגובה, בדרך כלל לשרוד במשך עשרה קטעים לפחות ובכך להציג יכולת התחדשות עצמית נרחבת בתרבות 4,18-20. צירופים, שהן EGF ו bFGF תגובה וכן, יכול גם ליצור neurospheres במשך כמה קטעים אבל לא במשך תקופה ארוכה של זמן. מכאן, זה כבר מקובל כי NSCs בתום לב אפשר למנות בדייקנות הוגנת מבוסס על היווצרות neurosphere במשך עשרה קטעים לפחות. במרבית המחקרים, לעומת זאת, התחדשות עצמית נמדד בדרך כלל מבוסס על היווצרות neurosphere שניוני ושלישוני בשל הזמן ניסיוני הרב הנדרש במשך עשר קטעים. לפיכך, NFA המשני יכול לשמש רחב להשוות את הימור יכולת התחדשות העצמיתאוכלוסיות Ween, אבל לא ניתן להשתמש בהם כדי למנות תדירות המל"ל במדויק.
NSCs יש יכולת שגשוג גדולה לעומת צירופים. מאפיין זה של NSCs שימש לואי ואח '. לפתח assay עבור ספירה המל"ל - את assay תא מושבת יוצרים העצבי (NCFCA) 21,22. ב assay זה, תאים בודדים בתרבית למשך 3 שבועות במטריצה חצי קשה המכיל קולגן. בתנאי התרבות אלה, זה היה מראה כי תאי יוצרי neurospheres מעל 2 מ"מ קוטר הם tripotent ויכולים עצמי לחדש לטווח ארוך. תאים אלה מוגדרים NSCs. לכן, NSCs נבדלים באופן יעיל מפני צירופים.
NSCs יש את היכולת להתמיין האסטרוציטים, oligodendrocytes נוירונים. לבידול של neurospheres, גורמי גדילה יוסרו בסרום מתווסף בינוני התרבות. אם כל שלוש השושלות עצביות הם נצפו בתוך neurosphere, ואז התא שיזם כי neurosphere iזה המל"ל. עם זאת, assay הבידול יש מספר מגבלות. ראשית, תנאי התרבות המשמשים לבידול לא יכולים להיות אופטימליים עבור דור של השלוש כל השושלות העצביות. למעשה, בתהליך התמיינות יחיד neurosphere, מוות של תאים משמעותי מתרחש בעיקר הדור astrocyte מתרחשת (Tham M ואחמד S, לא פורסם). שנית, יש את הנושא של clonality. עבור ספירה מדויקת של NSCs, היווצרות והבחנה של neurospheres צריכה להתבצע בתנאים משובטים, כאשר כל neurosphere עולה מתא בודד. בתרבויות ההשעיה בתפזורת, צבירה מתרחשת הן ברמות הסלולר neurosphere 23-25. לפיכך, זה אפשרי עבור כל neurosphere לנבוע מספר תאים או neurospheres, אשר מסבך ספירת neurosphere והערכת multipotency. הראיות אחרונות עולות כי צבירה של תאים אינה מתרחשת בצפיפות ציפוי נמוכה של 0.5 תאים / μL או מתחת, וכאשר צלחות תרבות אינן מועברות במהלך neurosphere היווצרות 15. לפיכך culturing תאים בצפיפות נמוכה כזה יבטיח clonality.
נכון לעכשיו, NCFCA היא השיטה הנפוצה ביותר להבחין NSCs מ צירופים ולפקידה תדירות המל"ל. NCFCA, לעומת זאת, דורש זמן רב יחסית של שלושה שבועות. כאן אנו מתארים פרוטוקול למנות תדירות המל"ל מבוססת על היכולת של NSCs לגבש neurospheres multipotent. פרוטוקול זה לוקח רק 13 ימים כדי לבצע. NCFCA מבטיח clonality כמו מטריקס קולגן מונע תנועה של neurospheres. תנאי התרבות להשתמש בפרוטוקול זה גם מאפשרים clonality כדי להישמר לאורך. למשל, השימוש 50-היטב תאי coverslips מבטיח כי neurospheres יבדיל בלי קשר לזה. יתר על כן, אנו משתמשים מותנים בינוניים המספקים גורמי neurotrophic במהלך התמיינות מנת למקסם את הפוטנציאל של בידול neurospheres (איור 1).
Protocol
הטיפול של בעלי חיים בוצע בהתאם להנחיות IACUC ו NACLAR ואושר על ידי מח' בעלי החיים ((http://www.brc.astar.edu.sg/index.php?sectionID-11).
הערה: תרבויות neurosphere הוכנו מן המוח הקדמי של עוברי (E14) C57BL / 6 עכברים כפי שתוארו לעיל 5.
1. תרבות של Neurospheres לדוגמא המשובט (יום 1)
- כן בינוני צמיחת המל"ל ידי שילוב F-12 המזון הבינוני / נשרי Modified של Dulbecco (DMEM / F12) בינוני עם תוסף B27 (ריכוז סופי: 1x), EGF (ריכוז סופי: 20 ng / mL), bFGF (ריכוז סופי: 10 ng / מ"ל) ו פניצילין / סטרפטומיצין (ריכוז סופי: 1x).
- לנתק neurospheres העכבר E14.5 ב 1 מדיום הגידול מ"ל המל"ל 1 מ"ל 0.05 N סודיום הידרוקסיד עבור 7 דקות ב RT. תאים פיפטה מעלה ומטה מדי פעם כדי לשמור על התאים בתרחיף. הוסף 1 מ"ל של 0.05 N חומצה הידרוכלורית כדי נייטרליize אלקלי.
הערה: תאים neurosphere הם זורעים ב -20,000 תאים / מ"ל בצלחת תרבות 10 ס"מ והם בתרבית למשך 5 ד ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. התשואה הצפויה לאחר כ -10 מיליון תאים לכל צלחת 10 ס"מ. תאים אלה הם ניתקו אז זורעים בצפיפות משובטת כמתואר בשלבי 1.2 ו -1.3, בהתאמה.- בצעו ספירת תאים באמצעות מכתים Trypan כחול hemocytometer.
- תאים neurosphere העכבר E14.5 זרע בודד בצפיפות של 50 תאים / מ"ל או מתחת 100 מדיום הגידול μL המל"ל בצלחת 96-היטב. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור 1 w כדי ליצור neurospheres המשובט.
הערה: Clonality מובטח במהלך היווצרות neurosphere בצפיפות זה כמו התאים לא קשר אחד לשני.
2. תרבות של Neurospheres עבור בינוני אלף (יום 3)
- לנתק neurospheres העכבר E14.5 כמתואר בשלב 1.2.
- תאים בודדים זרע מ- E14.5 neurospheres העכבר בצפיפות של 20,000 תאים / מ"ל במדיום הגידול 10 מ"ל המל"ל בצלחת תרבות 10 ס"מ. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 5 ד לייצר neurospheres תרבותי בתפזורת.
3. הכנת neurosphere אוויר בינוני (יום 8)
- הכן פתרון הציפוי על ידי ערבוב 700 μL של 0.01% פולי- L- ליזין (PLL), 70 μL של 1 מ"ג / מ"ל Laminin ו 6230 μL של בופר פוספט (PBS).
- מעיל צלחת תרבות 10 ס"מ עם 7 מ"ל של תמיסת PLL / Laminin עבור 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
- בעזרת פיפטה סרולוגיות 10 מ"ל, להעביר את כל neurospheres תרבותי בתפזורת צינור צנטריפוגות חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה neurospheres בעמ '171 XG דקות 1 ב RT ולהסיר את supernatant לחלוטין.
- כן בינוני בידול המל"ל ידי שילוב בינוני DMEM / F12 עם B27 (ריכוז סופי: 1x) ו עוברי שור סרום (FBS) (ריכוז סופי: 0.5%) מודעותד 10 מ"ל של מדיום בידול המל"ל neurospheres. פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי resuspend neurospheres.
- לשאוב PLL / Laminin מצלחת תרבות 10 ס"מ ולשטוף פעם עם 10 מ"ל PBS. להעביר את כל neurospheres אל PLL / Laminin מצופה תרבות צלחת 10 ס"מ. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור neurospheres לדבוק המנה.
4. קביעת nfu של המדגם Neurospheres (יום 8)
- ספירת neurospheres (זורע ביום 1; סעיף 1) יצרה בכל טוב תחת מיקרוסקופ.
הערה: לקבוע את מספר neurospheres שנוצר ל -100 תאים מצופים, אשר נותן את nfu.
5. העברת Neurospheres לדוגמא 50-היטב תאיים Coverslip (יום 8)
- מעיל היטב בכל coverslip תאיים 50-היטב עם 10 μL של פתרון הציפוי PLL / Laminin עבור 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
הערה: כן פתרון ציפוי כמתוארצעד 3.1. - הכן 3 x 50 צינורות צנטריפוגה חרוטי מ"ל המכיל 30 מ"ל של PBS לכל. בעזרת מלקחיים סטריליות, להסיר את coverslip 50-היטב התאי המצופה. טובלים את coverslip תאיים לתוך הצינור הראשון של PBS, ואחריו השני ואז הצינור השלישי של PBS, לשטוף את פתרון הציפוי.
- לשאוף כל נוזל הנותר מן הבארות של coverslip התאי.
- בעדינות פיפטה כל בינוניות neurospheres מבאר כל המנה 96-היטב ולהעביר אותו אל צלחת תרבות אחת 10 ס"מ.
- תחת מיקרוסקופ, לבחור neurosphere מדגם באמצעות micropipette P10 מצויד עם קצה פיפטה 10 μL. ודא שרק neurosphere יחיד נקלט בכל פעם על ידי הגדרת העמודה פיפטה 2 μL. השתמש קצה פיפטה חדש עבור כל neurosphere.
- מעביר את neurosphere על גבי במרכז באר של coverslip 50-היטב התאי המצופה.
- חזור על שלבי 5.5 ו -5.6 עד היטב כל conta coverslip התאיins neurosphere.
הערה: neurospheres ניתן לאסוף תחת מיקרוסקופ להציב במנדף זרימה למינרית או על benchtop. - הוסף 10 μL של המל"ל בינוני בידול זה טוב של coverslip התאי. מניח את coverslip התאי בצלחת תרבות 10 סנטימטרים פיפטה PBS לאורך הקצוות של המנה כדי למנוע התייבשות של מדיום הבידול המל"ל. הנח עד שני coverslips החדרים ב תרבות צלחת אחת 10 ס"מ. דגירת coverslip התאי (כלול צלחת תרבות 10 סנטימטרים) הלילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
6. בידול של Neurospheres לדוגמא (יום 9)
- מעבירים את בינוני בידול מן neurospheres תרבותי בתפזורת (מסעיף 3) לצינור צנטריפוגות חרוטי 15 מ"ל. ודא 2-3 מ"ל של מדיום בידול נשאר בצלחת התרבות כדי למנוע מתאי דבקה מן ניתוק. באמצעות מזרק 20 מ"ל סטרילי, להעביר את בינוני בידול באמצעות 0.2 μמ 'מסנן כדי להסיר את כל התאים או פסולת.
- מעביר את בינוני הבידול המסונן בחזרה את מנת תרבות 10 סנטימטרים המכילה את התאים הדבקים.
- בעזרת מלקחיים סטריליות, מקום coverslip תאי בעדינות על בינוני הבידול באופן הפוך כזה כי neurospheres המדגם פונה כלפי מטה. דגירת coverslip תאי עם מדיום הבידול עבור 3 ד ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
הערה: neurospheres המדגם נמצא בקשר עם מדיום הבידול אך לא במגע עם תאי המבדילים מתחת.
תיקון 7. של הבדיל Neurospheres (יום 12)
- הוצא בעדינות את coverslip התאי מצלחת תרבות 10 סנטימטרים באמצעות מלקחיים סטרילית. בעדינות לטבול את coverslip לתוך PBS כדי לשטוף את המדיום המותנה.
- לקלף את אטם סיליקון מן coverslip. בצע זה בעדינות ובאיטיות כדי למנוע את שבירת coverslip. שימו לב בצד שבו הneurospheres דואר הבדיל הם דבקו.
- פיפטה 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA) על פיסת לחתוך סרט פרפין לגודל של coverslip. בעדינות במקום coverslip על הסרט פרפין עם neurospheres פונה כלפי מטה במגע עם PFA. תקן את neurospheres במשך 20 דקות ב RT.
זהירות: PFA הוא רעיל הוא בצורת נוזל אד והוא דליק. הימנע משאיפת אדי ומגע עם העור והעיניים. תמיד טפלו PFA במנדף מאוורר. - פיפטה 1 מ"ל של PBS על גבי פיסת הסרט פרפין. שטפו את neurospheres על ידי הנחת coverslip בעדינות עם neurospheres פונה כלפי מטה במגע עם PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- חזור על שלב 7.4 פעמים נוספות.
8. O4 הכתמה של הבדיל Neurospheres (יום 12)
- כן 3% אלבומין בסרום שור (BSA) ב- PBS. פיפטה 1 מ"ל של BSA 3% על פיסת הסרט פרפין. חסום את neurospheres ידי בעדינות placing coverslip (עם neurospheres פונה כלפי מטה) במגע עם BSA למשך 30 דקות ב RT.
- פיפטה 1 מ"ל של נוגדן IgM אנטי-O4 העכבר (1: 300 דילול ב BSA 3%) על פיסת הסרט פרפין המקום coverslip על הסרט פרפין עם neurospheres פונה כלפי מטה במגע עם הנוגדן. אפשר מכתים O4 להתרחש במשך 2 שעות ב RT.
- שטוף את coverslip פעמים עם PBS כמתואר בשלב 7.4.
- פיפטה 1 מ"ל של נוגדנים משני מצומדות-אנטי עכבר צבע פלואורסצנטי ירוק IgM (1: 500 דילול ב BSA 3%) על פיסת הסרט פרפין המקום coverslip על הסרט פרפין עם neurospheres פונה כלפי מטה במגע עם נוגדן . השאר למשך 1 שעות ב RT בחושך.
הערה: בצע immunostaining להיערך לצילום בסביבה חשוכה משלב זה ואילך. - שטוף את coverslip פעמים עם PBS כמתואר בשלב 7.4.
9. Tuj1 וחלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP) מכתיםשל הבדיל Neurospheres (יום 12)
- כן permeabilizing פתרון על ידי הוספת טריטון-X 100 (ריכוז סופי: 0.5%) ל- BSA 3%. פיפטה 1 מ"ל של permeabilizing הפתרון על חתיכת סרט פרפין. מניחים coverslip על הסרט פרפין עם neurospheres פונה כלפי מטה במגע עם הפתרון permeabilizing במשך 20 דקות ב RT.
- שטוף את coverslip פעמים עם PBS כמתואר בשלב 7.4.
- פיפטה 1 מ"ל של העכבר אנטי Tuj1 נוגדן 2a IgG (1: 500 דילול ב BSA 3%) ו ארנב נגד GFAP נוגדן IgG (1: 1,000 דילול של BSA 3%) על פיסת coverslip הסרט ומקום פרפין על סרט הפרפין עם neurospheres פונה כלפי מטה במגע עם הנוגדנים. אפשר Tuj1 מכתים GFAP להתרחש במשך 2 שעות ב RT.
הערה: שני נוגדנים ניתן להכין כפתרון יחיד. - שטוף את coverslip פעמים עם PBS כמתואר בשלב 7.4.
- פיפטה 1 מ"ל של צבע פלואורסצנטי אדוםמצומדות-אנטי עכבר 2a IgG (1: דילול 500 BSA 3%) ו צבע פלואורסצנטי אדום רחוק IgG מצומדות-נגד ארנב (1: 500 דילול ב BSA 3%) נוגדנים משני על פיסת סרט והמקום פרפין coverslip על הסרט פרפין עם neurospheres פונה כלפי מטה במגע עם נוגדנים. השאר למשך 1 שעות ב RT.
הערה: שני נוגדנים ניתן להכין כפתרון יחיד. - שטוף את coverslip פעמים עם PBS כמתואר בשלב 7.4.
- לדלל 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) פתרון מניות 300 ננומטר ב PBS. פיפטה 1 מ"ל של DAPI על פיסת הסרט פרפין coverslip מקום על הסרט פרפין עם neurospheres פונה כלפי מטה במגע עם DAPI עבור 2 דקות ב RT עבור מכתים גרעינים.
- שטפו את coverslip פעם עם PBS פעמיים עם מים ללא יונים כמתואר בשלב 7.4. הר coverslip בשקופית זכוכית באמצעות הרכבה בינונית מתאים ולאפשר לו להתייבש O / N ב RT.
10. אמאגינג של הבדיל Neurospheres (יום 13)
- neurospheres תמונה תחת מיקרוסקופ confocal באמצעות 40X. השתמש לייזרים ב 488 ננומטר, 594 ננומטר 647 ננומטר לזהות oligodendrocytes, הנוירונים האסטרוציטים, בהתאמה.
- לקבוע את אחוז unipotent, neurospheres bipotent ו tripotent.
הערה: און נקבע על פי היכולת של neurosphere להתמיין שלוש השושלות העצביות - oligodendrocytes, נוירונים האסטרוציטים 5,14,15,26. Oligodendrocytes מזוהה מכתים חיובי עבור O4 (סעיף 8). נוירונים מזוהים מכתים חיובי עבור Tuj1 (סעיף 9). האסטרוציטים מזוהים מכתים חיובי עבור GFAP (סעיף 9). Neurosphere unipotent מתבדל רק אחד השושלת צריך להכתים חיובי לאף O4, GFAP או Tuj1. Neurosphere bipotent מתבדל כל שני שושלות וצריך להכתים חיובי עבור O4 ו GFAP או O4 ו Tuj1 או GFAP ו Tuj1. Tripotent neurosphere שונהiates לכל שלוש שושלות וצריך להכתים חיובי עבור O4, GFAP ו Tuj1. - לקבוע תדירות המל"ל באוכלוסייה של עניין באמצעות הנוסחה הבאה:
תדירות המל"ל = (% x nfu של neurospheres tripotent) / 100%.
Representative Results
השתמשנו בפרוטוקול זה כדי להעריך את היכולת של לקס, סמן המל"ל פני התא ידוע 7, כדי להעשיר את NSCs. נתונים ממחקר זה ישמש כדי להמחיש כיצד NSCs הם המנויים באמצעות מבחני המשובטים בפרוטוקול. תאי neurosphere עכבר E14.5 הודגרו עם נוגדן אנטי לקס. כתוצאה מכך, התאים המבטאים לקס (לקס +) ותאי כי אינם מבטאים לקס (LEX -) היו זורעים ב 50 תאים / מ"ל ידי הקרינה המופעל מיון תאים (FACS) והשאיר ליצור neurospheres המשובטים עבור 1 wk. זמן לשגות הדמיה מראה כי neurospheres שנוצר ב 50 תאים / מ"ל הם משובט (איור 2). Nfu עבור לקס + ולקס - תאים נקבע. זה מוצג שלקס + יש תאים יכולת היווצרות neurosphere גבוה משמעותית לעומת לקס - תאים (3g איור). Neurospheres שנוצר אז הובדלובתנאים משובטים, ובהמשך immunostained הדמיה (e-איור 3 א). תאים לקס + ליצור באופן משמעותי יותר neurospheres tripotent מ לקס - תאים (3F איור). תדירות המל"ל מכן חושבה על nfu ו-% של neurospheres tripotent (3g איור). בחירה המבוססת על לקס, מעשיר תדירות המל"ל על ידי יותר מ -14 לקפל, אימות לקס כסמן המל"ל. אנחנו גם קבענו את תדירות המל"ל של neurospheres עכבר E14.5 באמצעות פרוטוקול זה 27 ו NCFCA 28. שתי השיטות לדווח תדירות המל"ל השוואה של 2% על ב neurospheres העכבר E14.5.
פרוטוקול באיור 1. לבידול neurosphere בתנאי משובט. Neurospheres לדוגמא גדל בתנאים המשובטים ממוקמים בנפרד בכל PLL / Laminin-גoated היטב של coverslip תאיים 50-היטב, ואיפשר לדבוק O / N. באותו היום, neurospheres התרבותי בתפזורת הם מצופים במדיום בידול בצלחת סנטימטר PLL / 10 מצופה Laminin, ואפשר לדבוק O / N. למחרת, בינוני מותנה מן neurospheres תרבותי בתפזורת מסונן והניח בחזרה בצלחת 10 ס"מ. Neurospheres מדגם מכן הפוך על המדיום המותנה ואפשר להבדיל במשך 3-4 ימים 28. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
צמיחה איור 2. של המשובטים neurosphere. תאים שמקורם neurospheres E14.5 היו הפרידו זורעים 50 תאים / מ"ל בצלחת 96-היטב. תאים בודדים אותרו במשך 6 ד ידי הדמיה זמן לשגות. תמונות של oתא ne כזה גדל לתוך neurosphere מוצג. ראוי לציין, כי neurosphere שומרת clonality. (א) 0 ימים; (ב) 1.19.45; (ג) 2.95.37; (ד) 3.32.76; (ה) 4.46.53; (ו) 5.61.44; איפה את המספר הראשון מתייחס היום, המספר השני מתייחס שבריר של יום, ומספר השלישי מתייחס שבריר של h. הגדלה 10X. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. דיפרנציאציה של משובטי Neurospheres ואת ספירת התדירות המל"ל. Neurospheres היחיד נקטף בדיל ב coverslip תאי 50-גם עבור 3 ד. תמונה מייצגת של STA neurosphere tripotentשאינו עומד עם (א) DAPI immunostained עבור (ב) GFAP, (ג) Tuj1 ו- (ד) O4. (ה) מציגה את הכיסוי של (א) - (ד). סרגל קנה מידה, 65 מיקרומטר. (ו)% של unipotent, bipotent ו neurospheres tripotent שנוצר על ידי לקס + ולקס - תאים (ממוצע ± SEM, n = 3). (ז) תדירות המל"ל לקס + ולקס -. התאים מחושב כמכפלה של nfu ו-% של neurospheres tripotent אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
אנו מתארים הי הספירה של NSCs בתנאים משובטים. צעדים קריטיים לכלול את השימוש של מדיום גידול והבחנה טרי המל"ל, וגם שימוש פתרון PLL / Laminin מוכן טרי כדי לצפות את coverslips התאי, כמו גם את כלי התרבות. הדבר מבטיח תנאי גידול והתמיינות אופטימליים של neurospheres. שימוש נוגדנים באיכות טובה כדי לאתר את הנוירונים גליה ביעילות, כמו גם לקטיף סלקטיבית של neurospheres משובט כי אינם באים במגע עם neurospheres אחר, הם קריטיים. יתר על כן, חשוב להבטיח את neurospheres הרים לא להתייבש. מומלץ להוסיף 10 μL של מדיום בידול זה טוב לאחר קטיפתם כל 10 neurospheres. חשוב להשתמש coverslip אחד החדרים ב צלחת אחת 10 ס"מ לדגימה להימנע הצטלבות בין neurospheres ממדגמים שונים. אם שני coverslips (כל neurospheres המכיל בין מדגמים שונים) ממוקםאותו 10 ס"מ צלחת, neurospheres מ coverslip אחד יכול לשחרר גורמים שעשויים לשנות את הנטייה של neurospheres ב coverslip אחרים להתמיין שושלות ספציפיים. שני coverslips באותה 10 ס"מ צלחת עשויה גם לגרום בלבול בין דגימות.
במקרה ש nfu או תדירות המל"ל נמוך מהמצופה, להבטיח כי neurospheres מספר מעבר נמוך משמשים. כמו כן, חשוב כי neurospheres מעבר נמוך הבריא משמש להפקה בינונית מותנה. לאחר מכן, אם neurospheres מתורבתים בבארות עם קוטר קטן, כגון בצלחת 96-היטב, אז זה יהיה קשה לתמרן ולבחור neurospheres באמצעות micropipette. במקרה זה, להעביר את neurospheres לצלחת תרבות גדולה, כגון צלחת 6-היטב, לפני לקטוף. חלק מן neurospheres ההרים עשוי להמריא מן coverslip התאי במהלך תרבות immunostaining. צמצום התנועה של coverslip התאי במהלך התרבות, לשטוף אינטנסיבי פחותing במהלך immunostaining, יעזור למנוע ניתוק של neurospheres.
מחקרים ראשוניים לכמת NSCs רק באמצעות NFA 7,11,13. עם זאת, NFA מגזים בהערכת תדירות המל"ל הן NSCs ו NPS מוקדם ליצור neurospheres 5. לואיס ואח '. פיתח שיטה אחרת לכמת NSCs המכונה NCFCA 21,22. NCFCA כרוכה culturing תאים בודדים במטריצה מבוססת קולגן כדי להבטיח clonality, וזה היה מראה כי neurospheres מעל 2 מ"מ קוטר נוצרים על ידי NSCs בלבד. בדומה NCFCA, clonality מובטחת בכל פרוטוקול זה. זו מושגת על ידי יצירת neurospheres בצפיפות משובטת ובידול neurospheres ב coverslips התאי. השימוש התאי coverslips מקנה מספר היתרונות. את coverslip התאי מאפשר לכל neurosphere מדגם להבדיל מבלי מגע פיזי עם neurospheres מדגם אחר, ובכך להבטיח clonality במהלך התמיינות.את coverslip התאי ניתן למקם מושעה על מדיום הבידול לאפשר neurospheres המדגם להיות מותנה ברציפות כדי להבטיח בידול מקסימאלי. בהעדר בינוני בסרום המותנה במהלך התמיינות, הישרדות של neurospheres פוחתת neurospheres בעיקר ליצור האסטרוציטים (Tham M ואחמד S, לא פורסם). בנוסף, neurospheres immunostained ניתן לאחסן בנוחות תקופה ארוכה ואת coverslips התאי יכול להיות מותקן ישירות על שקופיות זכוכית מיקרוסקופ. בנוסף, הדמיה של neurospheres immunostained נעשתה קלה כאחד יכול במהירות לאתר את neurosphere הקטן תאי היטב, ללכידת תמונה, ולהמשיך הלאה אל באר הבא.
קבענו את התדירות המל"ל בתרבות neurosphere עכבר E14.5 הוא באמצעות הפרוטוקול המתואר בכתב היד הזה 27 ו NCFCA 28. תדירות המל"ל neurospheres העכבר E14.5 נקבע על ידי שני ליthods ניתן להשוואה. NCFCA מונה NSCs כי הם מולטיפוטנטיים יש יכולת התחדשות עצמית לטווח ארוך. מאז תדירות המל"ל מן השיטה שלנו דומה לזו מן NCFCA, את קריאת נתוני הפרוטוקול שלנו לא נראתה להעריך את התדירות המל"ל. NCFCA דורש שלושה שבועות להסתיים וכולל בעיקר ציפוי תא ומילוי בינוני. הפרוטוקול המתואר כאן דורש 13 ימים כדי לבצע וכרוך סדרות שונות של צעדים, למשל, קטיף neurosphere ו immunostaining. פרוטוקול זה יכול לשמש ככלי עזר אלטרנטיבה למנות NSCs. חוקרים יכולים להשתמש בשני NCFCA ופרוטוקול זה כדי לאמת תדירות המל"ל בדגימות שלהם.
מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא כי שורה של צעדים חשובים צריכה להיות כל שבוצעו ביום 8. הכנת הבינוני המותנה, קביעת nfu של neurospheres מדגם, והעברת neurospheres מדגם coverslip 50-היטב התאי צריך להיות שבוצע על דהy 8. אפשר לקחת את הזמן כדי להשלים את השלבים הבאים. בנוסף, זה דורש תרגול כדי לבצע שלבים אלה בצורה יעילה.
Neurospheres היה בשימוש נרחב כדי ללמוד לתפקד והתנהגות המל"ל. עם זאת, neurospheres מורכב הן של NSCs ו NPS. לפיכך, חשוב להעשיר NSCs מן neurospheres ללמוד ביולוגיה המל"ל. נכון לעכשיו, סמנים פני תא, רכוש הדרה לצבוע כמו גם גודל תא גרעיני שמשו להעשיר עבור NSCs 6,7,9-13,29,30. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לכמת את העשרת NSCs ידי סמני פוטנציאל המל"ל, וכדי להקל על החיפוש אחר סמן המל"ל מוחלט. ארבעה מחקרים שנעשו לאחרונה השתמשו בפרוטוקול זה למנות תדירות המל"ל 5,14,15,26.
Acknowledgments
אנו מודים הסוכנות למדע, טכנולוגיה ומחקר (A * STAR), סינגפור למימון מחקר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical centrifuge tubes | BD | 352096 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | BD | 352070 | |
| 20 mL sterile syringe | BD | 300141 | |
| 50 mL sterile syringe | BD | 300144 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
| Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody | Covance | MMS-435P-100 | |
| Rabbit anti-GFAP IgG antibody | Dako | Z033401 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Microscope fitted to laminar flow hood | Leica | MZ6 | |
| Glass slides | Marienfeld-superior | 1000200 | |
| Mouse anti-O4 IgM antibody | Merck Millipore | MAB345 | |
| Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | |
| Microscope | Nikon Eclipse | TS100-F | |
| Laminar flow hood | NuAire | NU-543 | |
| 96-well culture dishes | NUNC | 167008 | |
| 10-cm culture dishes | NUNC | 150350 | |
| Paraffin film | Parafilm | PM999 | |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant human basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| 0.2 µm filter | Sartorius Stedim | 16534-K | |
| 0.45 µm filter | Sartorius Stedim | 16555-K | |
| 1.0 N Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| 1.0 N Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Paraformaldehyde (PFA) powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Toxic |
| Bovine Serum Albumin (BSA) powder | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 50-well chambered coverslips | Sigma-Aldrich | C7735 | |
| Stir plate with heat function | Stuart | UC152 | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | A21042 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific | A21135 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A31573 | |
| 4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| Cell-culture centrifuge | Thermo Fisher Scientific | RT1 75002383 | |
| Pasteur pipettes | Thermo Fisher Scientific | 10006021 | |
| CO2 incubator | |||
| Ventilated fume-hood | |||
| Aspirator | |||
| Confocal microscope | |||
| Micropipettes | |||
| Micropipette tips | |||
| Plastic pipettes | |||
| Multichannel pipettes | |||
| Glass beaker | |||
| Sterile forceps | |||
| pH meter |
References
- Ahmed, S. The culture of neural stem cells. J. Cell. Biochem. 106 (1), 1-6 (2009).
- Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12 (11), 4565-4574 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and Population Analyses Demonstrate That an EGF-Responsive Mammalian Embryonic CNS Precursor Is a Stem Cell. Dev. Biol. 175 (1), 1-13 (1996).
- Narayanan, G., et al. Single-Cell mRNA Profiling Identifies Progenitor Subclasses in Neurospheres. Stem Cells and Dev. 21 (18), 3351-3362 (2012).
- Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (26), 14720-14725 (2000).
- Capela, A., Temple, S. LeX/ssea-1 Is Expressed by Adult Mouse CNS Stem Cells, Identifying Them as Nonependymal. Neuron. 35 (5), 865-875 (2002).
- Capela, A., Temple, S. LeX is expressed by principle progenitor cells in the embryonic nervous system, is secreted into their environment and binds Wnt-1. Dev. Biol. 291 (2), 300-313 (2006).
- Corti, S., et al. Isolation and characterization of murine neural stem/progenitor cells based on Prominin-1 expression. Exp. Neurol. 205 (2), 547-562 (2007).
- Nagato, M., et al. Prospective characterization of neural stem cells by flow cytometry analysis using a combination of surface markers. J. Neurosci. Res. 80 (4), 456-466 (2005).
- Kim, M., Morshead, C. M. Distinct Populations of Forebrain Neural Stem and Progenitor Cells Can Be Isolated Using Side-Population Analysis. J. Neurosci. 23 (33), 10703-10709 (2003).
- Murayama, A., Matsuzaki, Y., Kawaguchi, A., Shimazaki, T., Okano, H. Flow cytometric analysis of neural stem cells in the developing and adult mouse brain. J. Neurosci. Res. 69 (6), 837-847 (2002).
- Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).
- Tham, M., et al. CSPG Is a Secreted Factor that Stimulates Neural Stem Cell Survival Possibly by Enhanced EGFR Signaling. PLoS ONE. 5 (12), e15341 (2010).
- Gan, H. T., Tham, M., Hariharan, S., Ramasamy, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. Identification of ApoE as an autocrine/paracrine factor that stimulates neural stem cell survival via MAPK/ERK signaling pathway. J. Neurochem. 117 (3), 565-578 (2011).
- Ramasamy, S., Narayanan, G., Sankaran, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. Neural stem cell survival factors. Arch. Biochem. Biophys. 534 (1-2), 71-87 (2013).
- Ahmed, S., et al. Transcription factors and neural stem cell self-renewal, growth and differentiation. Cell Adh. Migr. 3 (4), 1-12 (2009).
- Gritti, A., et al. Multipotent Neural Stem Cells Reside into the Rostral Extension and Olfactory Bulb of Adult Rodents. J. Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).
- Gritti, A., et al. Epidermal and Fibroblast Growth Factors Behave as Mitogenic Regulators for a Single Multipotent Stem Cell-Like Population from the Subventricular Region of the Adult Mouse Forebrain. J. Neurosci. 19 (9), 3287-3297 (1999).
- Vescovi, A. L., et al. Isolation and cloning of multipotential stem cells from the embryonic human CNS and establishment of transplantable human neural stem cell lines by epigenetic stimulation. Exp. Neurol. 156 (1), 71-83 (1999).
- Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (49), e2639 (2011).
- Louis, S. A., et al. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony-Forming Cell Assay. Stem Cells. 26 (4), 988-996 (2008).
- Coles-Takabe, B. L., et al. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
- Mori, H., Fujitani, T., Kanemura, Y., Kino-Oka, M., Taya, M. Observational examination of aggregation and migration during early phase of neurosphere culture of mouse neural stem cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (3), 231-234 (2007).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat. Methods. 3 (10), 801-806 (2006).
- Yu, Y. H., et al. Purification, Visualization, and Molecular Signature of Neural Stem Cells. Stem Cells and Dev. 25 (2), 189-201 (2016).
- Yu, Y. H. C1qR1 is comparable with LeX and Prom1 as a neural stem cell marker. Identification of mouse embryonic neural stem cell surface markers. , Chapter 3.5, Figure 3.17 (2012).
- Tham, M. Neural colony-forming cell assay. A role for chondroitin sulfate proteoglycan in regulating the survival and growth of neural stem cells. , Chapter 3.6.3, Figure 3.22A (2009).
- Yuan, S. H., et al. Cell-Surface Marker Signatures for the Isolation of Neural Stem Cells, Glia and Neurons Derived from Human Pluripotent Stem Cells. PLoS ONE. 6 (3), e17540 (2011).
- Hall, P. E., Lathia, J. D., Miller, N. G. A., Caldwell, M. A., Ffrench-Constant, C. Integrins Are Markers of Human Neural Stem Cells. Stem Cells. 24 (9), 2078-2084 (2006).
